基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒，包含VP7基因保守序列特異性引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）等成分，檢測的最高稀釋度可達10-5～10-4，定量檢測線性范圍可達10-1拷貝/μL，對其它病毒核酸、細菌和陰性對照無任何擴增，本檢測試劑盒快速、敏感、特異，可用于糞便和血液等多種樣本中輪狀病毒的定量檢測。
【專利說明】基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 輪狀病毒（rotavirus，RV)是世界范圍內(nèi)引發(fā)嬰幼兒和幼齡動物嚴重脫水性腹瀉 的重要原因。輪狀病毒性胃腸炎是流行廣泛的人獸共患病，尤其是幼齡動物及嬰幼兒的一 種急性腸道傳染病，以腹瀉和脫水為特征，病死率可達50%。輪狀病毒的基因組由11個不 連續(xù)的dsRNA片段組成，分別編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1?VP4、VP6、VP7)和5個非結(jié)構(gòu)蛋白 (NSP1?NSP5);其中VP7和VP4構(gòu)成外層衣殼，VP7具有血清型特異性，與致病性有關(guān)，可 刺激機體產(chǎn)生保護性抗體。VP7是一種N-聯(lián)低聚甘露糖糖蛋白，為病毒外膜的重要糖蛋白 和主要中和抗原，并決定病毒的G血清型。
[0004] 隨著分子生物學技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)的不斷發(fā)展，基因檢測技術(shù)已越來越多 的應用于人畜傳染病的診斷等諸多領(lǐng)域。這些技術(shù)針對待測病毒核酸序列設計特異性引 物，具有特異性強、敏感性高、準確性高等優(yōu)點。PCR技術(shù)靈敏度更高，可檢測儲存較長時間 的樣本及多樣環(huán)境樣本，其擴增產(chǎn)物可用于基因研究工作。但是目前尚無牛輪狀病毒診斷 的專用試劑盒。本技術(shù)發(fā)明根據(jù)牛輪狀病毒（bovine rotavirus, BRV)VP7的基因保守序 列，設計特異性引物，建立了實時熒光定量PCR (qPCR)檢測方法，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出快 速準確的診斷與檢測試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 試劑盒組成與保存期檢測試劑盒含VP7基因保守序列特異性引物、特異性熒光探 針、逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶)等成分組成，運用實時熒光定量PCR (qPCR)方法檢 測。
[0006] 試劑盒保存期達6個月。
[0007] 其主要特點 特異性強，根據(jù)VP7基因保守序列設計特異性引物，通過實驗驗證，本試劑盒可以檢測 A組病毒，而對BVDV、BCV、PEDV等其它病毒核酸和細菌無任何擴增，陰性對照亦無擴增。 (附圖1) 靈敏度高，檢測的最高稀釋度可達1〇_5?1〇_4。定量檢測線性范圍可達ΚΓ1拷貝/ μ L。 (附圖2) 總之，本檢測試劑盒快速、敏感、特異，可用于糞便和血液等多種樣本中輪狀病毒的定 量檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1是本技術(shù)發(fā)明基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒的特異性。
[0009] 圖2是本技術(shù)發(fā)明基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒的敏感性。
[0010] 注：Μ為100bp DNA Marker; 1-2泳道分別為空白和陰性對照；3-7泳道分別 為質(zhì)粒10倍梯度系列稀釋（103，102，10 1，10°和ΚΓ1)。

【具體實施方式】
[0011] 樣品采集與處理 (1)組織樣品處理。每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約lg，用手術(shù)剪剪碎混 勻后取0. 05g于研磨器中研磨，加入1. 5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1. 5 mL滅菌 離心管中，8000rpm離心2min，取上清液ΙΟΟμ?于1. 5mL滅菌離心管中。
[0012] (2)全血樣品處理。待血凝后取血清ΙΟΟμ?，置1. 5mL滅菌離心管中。
[0013] (3)陽性對照處理。取陽性對照10〇μ?，置1. 5mL滅菌離心管中。
[0014] (4)陰性對照處理。取陰性對照100 μι,置1. 5mL滅菌離心管中。
[0015] RNA 提取 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液60〇μ?，充分顛倒混勻，室溫 靜置3?5min。將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸 浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），13000rpm離心30s，棄去收集管中液體，套上收集管。向 吸附柱中加入60〇μ?洗液，13000rpm離心30s，棄去收集管中液體，套上收集管。重復此步 驟。再空柱13000rpm離心2min。將吸附柱移入新的1.5 mL離心管中，在膜中央加入洗脫 液25μ?，室溫靜置lmin，13000rpm離心30s，獲得總RNA。 RT-PCR 每份總體積2〇μ?，含16. 8PLRT_PCR反應液（用前混勻），1. 2 μ?酶混合液，2PL模板 RNA。擴增條件為 42°C 45 min，95°C 3min ;擴增條件為 95°C 30s，60°C 30s，72°C 25s，35 個 循環(huán)；72°C延伸10 min。
[0016] 電泳 將PCR擴增產(chǎn)物10 μ?混合2PL上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110?120V 電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。
[0017] 結(jié)果描述及判定 閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況 進行調(diào)整。陽性對照ct值<30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無 Ct值并且無特定擴 增曲線，實驗結(jié)果成立；被檢樣品Ct值<30并出現(xiàn)特定的擴增曲線為RV陽性；被檢樣品 30 < Ct < 37并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新再做一次后進行結(jié)果判定，如兩次結(jié)果相同， 可判定為陽性；被檢樣品Ct值> 37時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性。
[0018] 使用注意事項 所有接觸病料的物品均應分隔和處理，以免污染實驗室。整個PCR操作過程應在配液 區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)分別完成，盡量縮短操作時間。反復凍融試劑會減低檢測靈 敏度，請嚴格依照試劑盒說明書操作。
【權(quán)利要求】
1.本技術(shù)發(fā)明公開了 "基于VP7基因的牛輪狀病毒qPCR檢測試劑盒"，檢測試劑盒由 VP7基因保守序列特異性引物、特異性熒光探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）等成 分組成，運用實時熒光定量PCR (qPCR)方法檢測，樣本稀釋度達ΚΓ5?10Λ定量檢測線性 范圍達ΚΓ1拷貝/ μ L，特異性強；以及包括樣品的采集與處理、病毒RNA的提取、特異性引 物的設計、RT-PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳等操作方法及結(jié)果判定，本試劑盒具有快速、敏感、 特異的特點，降低了檢測成本和時間，省時省力，可用于糞便和血液等多種樣本中輪狀病 毒的定量檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK104152579SQ201410345476
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】魏鎖成, 郭慧琳, 車團結(jié) 申請人:魏鎖成, 郭慧琳, 車團結(jié)