一種羰基還原酶突變體及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羰基還原酶CgKR1突變體及其編碼基因，含有羰基還原酶突變體基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該羰基還原酶突變體在不對(duì)稱還原酮酯，制備光學(xué)純手性羥基酯，比如催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯中的應(yīng)用。本發(fā)明羰基還原酶突變體與野生酶相比，熱穩(wěn)定性都有大幅度的提高，且部分突變體對(duì)鄰氯苯甲酸甲酰甲酯的催化活性也有明顯提高。本發(fā)明獲得的多個(gè)羰基還原酶突變體可以應(yīng)用于催化酮酯不對(duì)稱還原，制備光學(xué)純手性羥基酯，比如催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原，制備光學(xué)純(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。這些羰基還原酶突變體具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種羰基還原酶突變體及其基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及羰基還原酶CgKRl突變體及其編碼基 因，含有所述羰基還原酶突變體基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其重組酶和該重 組酶的制備方法，以及該羰基還原酶突變體在不對(duì)稱還原酮酯，制備光學(xué)純手性羥基酯，t匕 如催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原制備（R)-鄰氯扁桃酸甲酯中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 手性醇廣泛應(yīng)用于手性醫(yī)藥、農(nóng)藥以及多種類型的手性材料的制備中。其中 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯[(R)-CMM](分子式為 〇-Cl-C6H4CH(0H)C00CH3, CAS 號(hào)：32345-59-8) 是合成血小板聚集抑制劑氯吡格雷的重要手性中間體。氯吡格雷是一種二磷酸腺苷（ADP) 受體阻滯劑，可與血小板膜表面ADP受體結(jié)合，使纖維蛋白原無(wú)法與糖蛋白GP Ilb/IIIa受 體結(jié)合，從而抑制血小板相互聚集，主要用于治療急性心肌梗死，在國(guó)內(nèi)具有廣泛的市場(chǎng)。
[0003] 研究人員已開發(fā)出多種光學(xué)活性手性醇合成的方法，包括動(dòng)力學(xué)拆分和不對(duì)稱合 成。其中，利用前手性羰基化合物的不對(duì)稱還原合成光學(xué)活性手性醇的途徑，可實(shí)現(xiàn)理論 100%的產(chǎn)率，是生產(chǎn)光學(xué)活性（R)-鄰氯扁桃酸甲酯的重要方法。手性金屬衍生物可作為 催化劑用于羰基的不對(duì)稱還原，盡管該化學(xué)方法已被部分用于工業(yè)生產(chǎn)，然而該方法操作 難度大，反應(yīng)條件苛刻，且產(chǎn)物中可能會(huì)殘留重金屬，因此其應(yīng)用受到限制。生物催化方法 不僅反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好，具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性，而且避免了產(chǎn)物中 重金屬殘留，恰好彌補(bǔ)了化學(xué)方法的不足之處，因此近幾年來(lái)生物催化的羰基不對(duì)稱還原 反應(yīng)在手性醇不對(duì)稱合成中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。
[0004] (R)-鄰氯扁桃酸或其衍生物酯的生物不對(duì)稱合成方法主要有腈水解酶催化的鄰 氯扁桃腈的不對(duì)稱水解以及羰基還原酶催化的鄰氯苯甲酰甲酸酯的不對(duì)稱還原。張志鈞 等用糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp. E⑶0401)來(lái)源的腈水解酶在甲苯-水兩相體系中催化 消旋鄰氯扁桃腈的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)水解拆分制備（R)-鄰氯扁桃酸，底物濃度為200mM，產(chǎn)物的 對(duì)映體過(guò)量值（ee)為9(λ4%，產(chǎn)率為76·5%αBiotechnol·2011，152 :24-29)。Ema等 用面包酵母來(lái)源的羰基還原酶Gre2p催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原制備（R)-鄰氯 扁桃酸甲酯，底物濃度為200g/L，產(chǎn)物的ee值高于99 %，分離得率為89 % (Adv. Synth. Catal. 2008,350 :2039-2044)。為實(shí)現(xiàn)高的產(chǎn)率，該反應(yīng)額外添加了 lg/L的NADP+輔酶，由 于輔酶價(jià)格昂貴，大量輔酶的添加勢(shì)必會(huì)增加反應(yīng)的成本。
[0005] 從光滑假絲酵母（Candida glabrata)CGMCC2. 234克隆得到的羰基還原酶CgKRl 能夠催化多種高濃度的羰基化合物的高立體選擇性不對(duì)稱還原制備光學(xué)手性醇，該羰基還 原酶已經(jīng)在大腸桿菌（E. coli)中重組過(guò)量表達(dá)（Adv. Synth. Catal. 2012, 354,1765-1772 ; CN102618513A)。該酶對(duì)多種羰基化合物具有較高的活力，可以催化多種高濃度的酮酯類 底物完全轉(zhuǎn)化，但該羰基還原酶的熱穩(wěn)定性較差，:Π丨只有41. 8°C，催化0. 5M底物轉(zhuǎn)化，在 30°C下反應(yīng)不到10h即完全失活，而酶的熱穩(wěn)定性是工業(yè)用酶的重要特征。通過(guò)隨機(jī)突變、 定點(diǎn)突變等蛋白質(zhì)工程的手段對(duì)CgKRl進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造，提高其熱穩(wěn)定性，將具有較高 的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的羰基還原酶熱穩(wěn)定性差的問(wèn) 題，提供一種熱穩(wěn)定性提高的羰基還原酶突變體蛋白質(zhì)、編碼該突變體蛋白質(zhì)的核酸序列， 含有該核酸序列的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，重組表達(dá)該羰基還原酶突變體的整細(xì) 胞的制備方法及在催化羰基不對(duì)稱還原，制備光學(xué)純手性醇中的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是：提供一種熱穩(wěn)定性提高的 羰基還原酶CgKRl突變體蛋白質(zhì)。
[0008] 對(duì)具有如序列表中SEQ ID No. 2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行突變，將第138位 的天冬氨酸替換為天冬酰胺，或者在此基礎(chǔ)上，對(duì)第92位的苯丙氨酸、第94位的苯丙氨酸、 第99位的異亮氨酸、174位的甘氨酸分別或共同進(jìn)行氨基酸殘基替換，獲得由CgKRl衍生 的且具有羰基還原酶活性的突變體蛋白質(zhì)。
[0009] 突變體CgKRlD138N所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)是從由CgKRl構(gòu)建的隨機(jī)突變 庫(kù)中篩選得到。在篩選獲得熱穩(wěn)定性有明顯提高的突變體CgKRl D138N的基礎(chǔ)之上，我們繼續(xù) 對(duì)CgKRlD138N進(jìn)行改造，將酶表面和活性中心的一些非保守位點(diǎn)突變?yōu)槠渌陌被釟埢?以進(jìn)一步強(qiáng)化該酶的熱穩(wěn)定性。
[0010] 優(yōu)選的，所述羰基還原酶突變體，為野生羰基還原酶CgKRl的氨基酸殘基發(fā)生如 下任意一種情況的突變所獲得的突變體：
[0011] (1)野生型羰基還原酶CgKRl的氨基酸序列中第138位天冬氨酸替換為天冬酰胺， 命名為 CgKRlD138N ;
[0012] (2)野生型羰基還原酶CgKRl的氨基酸序列中第138位天冬氨酸替換為天冬酰胺， 且第99位異亮氨酸替換為酪氨酸，且第174位甘氨酸替換為丙氨酸，命名為CgKRl 199Y/D138N/ G174A
[0013] (3)野生型羰基還原酶CgKRl的氨基酸序列中第138位天冬氨酸替換為天冬酰胺， 且第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸，且94位苯丙氨酸替換為纈氨酸，第99位異亮氨酸替換 為酪氨酸，且第174位甘氨酸替換為丙氨酸，命名為CgKRl F9a/F94v/199Y/D138NA:mA。
[0014] 所述突變體的獲得方法具體為：以來(lái)源于光滑假絲酵母（Candida glabrata) CGMCC2. 234中的羰基還原酶野生酶CgKRl基因?yàn)槟０?，利用隨機(jī)突變引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR 構(gòu)建隨機(jī)突變庫(kù)，對(duì)所得到的突變基因庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，得到熱穩(wěn)定性提高的突變體 CgKRl111381

【權(quán)利要求】
1. 一種羰基還原酶突變體，其特征在于，其是如下（a)或（b)的蛋白質(zhì)： (a) 將具有如序列表中SEQ ID No :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的第138位天冬氨酸替 換為天冬酰胺所獲得的蛋白質(zhì)； (b) 在（a)的氨基酸序列中，對(duì)138位之外的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過(guò)氨基酸殘基替換獲得 的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羰基還原酶突變體，其特征在于，所述的（b)蛋白質(zhì)是 在（a)的氨基酸序列中將第92位的苯丙氨酸、第94位的苯丙氨酸、第99位的異亮氨酸、第 174位的甘氨酸分別或共同替換為其他氨基酸殘基獲得的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種羰基還原酶突變體，其特征在于，所述的羰基還原酶 突變體具有如下序列： (1) 將如序列表中SEQ ID No :2所示氨基酸序列中的第138位天冬氨酸替換為天冬酰 胺； (2) 將如序列表中SEQ ID No :2所示氨基酸序列中的第138位天冬氨酸替換為天冬酰 胺，同時(shí)第99位異亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第174位甘氨酸替換為丙氨酸； (3) 將如序列表中SEQ ID No :2所示氨基酸序列中的第138位天冬氨酸替換為天冬酰 胺，同時(shí)第92位苯丙氨酸替換為亮氨酸，同時(shí)94位苯丙氨酸替換為纈氨酸，同時(shí)第99位異 亮氨酸替換為酪氨酸，同時(shí)第174位甘氨酸替換為丙氨酸。
4. 一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼如權(quán)利要求1-3中任一所述的羰基還 原酶突變體。
5. -種包含如權(quán)利要求4所述的核酸的重組表達(dá)載體。
6. -種包含如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
7. -種重組羰基還原酶突變體的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： 培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組羰基還原酶突變體。
8. -種如權(quán)利要求1-3任一所述的羰基還原酶突變體或如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá) 轉(zhuǎn)化體作為催化劑在催化前手性羰基化合物不對(duì)稱還原，制備光學(xué)純手性醇中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物為如式1或式2 所示的化合物： 其中，
札為-CH3、-C6H5、-C6H4-〇-Cl 或 _(CH2)2C6H5 ; R2 為-CH3 或-CH2CH3 ; r3 為-ch3、-ch2ch3、-ch2ci 或-c6h5。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104099305SQ201410345443
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】郁惠蕾, 黃磊, 許建和, 李春秀, 潘江 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)