專利名稱：用于檢測結(jié)直腸癌pik3ca基因熱點突變位點的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點(E542K、E545K和H1047R)的試劑盒，能對結(jié)直腸癌PIK3CA基因突變位點進行檢測，特異性好，準(zhǔn)確度高，可提高突變檢出率。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生存環(huán)境及生活方式的改變，CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，全球毎年新增病例約ー百萬，約五十萬患者因其死亡。人類惡性腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān)，具有復(fù)雜的分子基礎(chǔ)，是多步驟、多基因改變的復(fù)雜過程。癌基因PIK3CA的發(fā)現(xiàn)為我們研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的方向，進ー步認(rèn)識癌基因PIK3CA突變作用對于掲示結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要的意義。PIK3CA是ー種體細(xì)胞突變癌基因，PIK3CA基因突變導(dǎo)致的PIK3CA過度表達(dá)可以導(dǎo)致PI3K的催化活性增強，促使細(xì)胞癌變，有致癌的功能。對PI3K家族全部成員的激酶結(jié)構(gòu)域外顯子編碼區(qū)域進行序列分析顯示，PIK3CA是唯一一個可以發(fā)生體細(xì)胞突變引起致癌的基因，在結(jié)腸癌中突變率達(dá)32%。PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位雜交技術(shù)檢測到的，其定位于3q26. 3，長34kb，包含20個外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生ー組長124kD的蛋白。PIK3CA編碼PI3Ks的pi 10催化亞單位，即PI3Kpll0a。近年來隨著結(jié)腸癌發(fā)病率的增高，深入研究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機制，做到早預(yù)見、早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為結(jié)腸癌防治的重點。大量數(shù)據(jù)表明PIK3CA中約90%突變發(fā)生在螺旋區(qū)(exon9)和激酶區(qū)(eXon20)這兩個熱點區(qū)域。這兩個突變熱點均能增強PI3K的脂質(zhì)激酶活性，因此，檢測PIK3CA蛋白不僅可以做到結(jié)腸癌的早期診斷及判斷預(yù)后，對于結(jié)腸癌患者選擇合理的化療藥物提高化療效果亦具有重要的臨床意義。
目前，PIK3CA基因突變現(xiàn)有的檢測方法包括普通測序法、焦磷酸測序法以及熒光定量PCR法等。在實際應(yīng)用中，用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因突變的方法主要為直接測序法，盡管該法為金標(biāo)準(zhǔn)，但是如果突變率低于15%，會發(fā)生漏檢的現(xiàn)象，且試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費時費力，因而一定程度上限制了該法的應(yīng)用。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是ー種新的序列分析技術(shù),是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進行序列驗證，而這種分析往往測幾十bp就可以滿足需要。在這種情況下，Sanger法未必是最合適的DNA序列分析技木。而焦磷酸測序技術(shù)是目前最適合這些應(yīng)用的DNA序列分析技木。其特點是操作簡便、大通量、自動化，適合大量樣本的快速檢測，根據(jù)峰值對序列的突變位點進行判讀，從而實現(xiàn)PIK3CA基因突變位點的定點檢測
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供用ー種快速，準(zhǔn)確，高通量的PIK3CA基因熱點突變(E542K、E545K和H1047R)檢測試劑盒。用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水こ醇、PCR擴增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應(yīng)液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX ;檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX，其序列為9F Biot i n-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG, 9R GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC,9RCX CCACAGAAAATCTTTCTCCT ；20F BiOt in-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT,20R TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC,20RCX :GTTGTCCAGCCACCA。進ー步地，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟(I)采集待測血液樣本，提取DNA ；(2)以該DNA為模板，用權(quán)利要求I所述用于擴增樣本DNA中PIK3CA基因的對應(yīng)PCR引物9F、9R、20F、20R進行擴增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(3)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物用測序引物9RCX、20RCX進行焦磷酸測序，確定是否存在突變。優(yōu)選地，步驟(2)的PCR反應(yīng)按以下條件進行擴增94°C 5min ；98°C 30s,58°C 30s、68°C 30s, 35 個循環(huán)；最后 68°C 5min。本發(fā)明根據(jù)PIK3CA基因熱點突變位，分別設(shè)計了外顯子9和20PCR擴增引物以及焦磷酸測序引物。表I.外顯子9-20引物序列
權(quán)利要求
1.用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水乙醇、PCR擴增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應(yīng)液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX ;檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX，其序列為9F Biotin-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG，9R GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC,9RCX CCACAGAAAATCTTTCTCCT ；20F Biotin-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT，20R TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC,20RCX :GTTGTCCAGCCACCA。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟 (1)采集待測血液樣本，提取DNA； (2)以該DNA為模板，用權(quán)利要求I所述用于擴增樣本DNA中PIK3CA基因的對應(yīng)PCR引物9F、9R、20F、20R進行擴增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (3)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物用測序引物9RCX、20RCX進行焦磷酸測序，確定是否存在突變。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)的PCR反應(yīng)按以下條件進行擴增94°C 5min ；98°C 30s、58°C 30s,68°C 30s，35 個循環(huán)；最后 68°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測結(jié)直腸癌PIK3CA基因熱點突變位點的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、全血DNA抽提試劑、無水乙醇、PCR擴增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品以及焦磷酸測序反應(yīng)液，其特征在于所述試劑盒包括檢測9外顯子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、測序引物9RCX；檢測20外顯子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、測序引物20RCX?？蓹z測出與結(jié)直腸癌相關(guān)的PIK3CA基因熱點突變位點(E542K、E545K和H1047R)多態(tài)性，特異性好，準(zhǔn)確度高。
文檔編號C12Q1/68GK102816839SQ20121023413
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者薛群, 王淑一, 徐建成, 鐘丹 申請人:杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司