一種利用snp提高白樺細(xì)胞中總?cè)坪妄R墩果酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具利用體涉及一種利用SNP提高白樺細(xì)胞中白樺三萜和齊墩果酸含量的方法。以白樺花藥懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，按50g/L接種量接種于100mL?B5液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：120rpm，25℃，光照強(qiáng)度2000lx，光周期16h，濕度40％～50％，培養(yǎng)周期為10d。培養(yǎng)基成分為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及濃度為0.2mg/L6-BA和0.6mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0，121℃高溫高壓滅菌20min。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第8天加入SNP使其終濃度為1mmol/L，培養(yǎng)12h后收獲，齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDW，是對(duì)照組的569％。培養(yǎng)48h收獲，細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪窟_(dá)到23.86mg/gDW，為對(duì)照組的143.20％。該申請(qǐng)發(fā)明為解決天然植物藥物來(lái)源緊缺和工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)白樺三萜和齊墩果酸藥物提供了一種新途徑。
【專利說(shuō)明】—種利用SNP提高白樺細(xì)胞中總?cè)坪妄R墩果酸含量的方法
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用SNP提高白樺細(xì)胞中總?cè)坪妄R墩果酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白樺樹(shù)皮中具有重要的三萜類物質(zhì)，三萜類物質(zhì)可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者抑制血管生成等方式發(fā)揮抗腫瘤作用，此外三萜類物質(zhì)還有抗炎、抗病毒的作用。隨著三萜化合物生物活性的發(fā)現(xiàn)其在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的價(jià)值逐步顯現(xiàn)，目前已有以齊墩果酸等為主要成分的藥物投入臨床使用。然而，樹(shù)木生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，若獲得白樺三萜需對(duì)樹(shù)木進(jìn)行砍伐或扒皮，破壞資源，加之其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工方法合成效率低，成本高等因素而成為制約其不能進(jìn)行臨床大規(guī)模應(yīng)用的主要原因。以細(xì)胞全能性為基礎(chǔ)建立起來(lái)的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為植物藥生產(chǎn)提供了一條新途徑。由于利用植物細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)植物天然活性物質(zhì)具有不受氣候、病蟲(chóng)害等自然條件的影響，而且不占用土地，不消耗自然資源，生產(chǎn)周期短和人為可控等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是解決植物藥生產(chǎn)與天然植物資源可持續(xù)發(fā)展之間矛盾的一種新型生物技術(shù)。大量研究表明NO是植物次生代謝產(chǎn)物合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子，具有重要作用。但目前尚未見(jiàn)使用NO的供體物質(zhì)SNP促進(jìn)白樺花藥的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行合成白樺三萜和齊墩果酸的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
: [0003]為保護(hù)白樺自然資源，建立可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的資源生產(chǎn)程序，利用來(lái)自白樺花藥誘導(dǎo)的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行總?cè)坪妄R墩果酸的合成與生產(chǎn)，同時(shí)利用高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。為進(jìn)行工業(yè)化法大規(guī)模生產(chǎn)總?cè)坪妄R墩果酸類藥物的提供了新方法。
[0004]技術(shù)方案是:在超凈工作臺(tái)上，切下雄穗，用70%酒精浸泡5min，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒20min，然后放于已滅菌的培養(yǎng)皿中，選擇適宜大小的雄穗，在解剖鏡下用解剖針剝開(kāi)雄穗，取出花藥，接種到預(yù)先經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的各種組合的培養(yǎng)基上(NT+1.0mg/L 水解酪蛋白 +3%蔗糖 +0.5 ~4.0mg/L2，4_D，0.2 ~4.0mg/L KT)進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。每瓶接種大約30-35個(gè)花藥。先用暗培養(yǎng)一周后進(jìn)行光培養(yǎng)。培養(yǎng)約7周后，獲得花藥培養(yǎng)愈傷組織。愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后，迅速增殖。
[0005]選擇細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，松散且總?cè)莆镔|(zhì)含量高的愈傷組織，進(jìn)行繼代和懸浮培養(yǎng)。并在有利于白樺懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累的B5+0.1~0.3mg/L6-BA+0.5~1.0mg/L TDZ懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞系。獲得高產(chǎn)白樺三萜和齊墩果酸懸浮細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)濾，烘干，粉碎，有機(jī)溶劑(95%乙醇)提取步驟，利用液相色譜方法對(duì)白樺酯醇和齊墩果酸檢測(cè)和定量分析。
[0006]本專利具有以下特點(diǎn):[0007]I)生產(chǎn)環(huán)境不受地域、季節(jié)、水質(zhì)、病蟲(chóng)害、氣候等自然環(huán)境的影響。
[0008]2)生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)過(guò)程不產(chǎn)生大量廢渣廢水，安全無(wú)污染，具有生態(tài)效益。
[0009]3)培養(yǎng)的白樺懸浮細(xì)胞具有生產(chǎn)白樺三萜和齊墩果酸等多種物質(zhì)的能力，實(shí)現(xiàn)了白樺天然植物資源及其藥用成分的開(kāi)發(fā)利用。
[0010]4)利用高效液相色譜方法進(jìn)行齊墩果酸進(jìn)行檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，提取溶劑清潔無(wú)毒，操作方便。
[0011]5)為解決抗艾滋病和抗腫瘤天然藥物來(lái)源緊缺，加速臨床大規(guī)模應(yīng)用，提供一種新途徑，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0012]I)植物材料來(lái)源
[0013]白樺取自東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園內(nèi)的開(kāi)花優(yōu)樹(shù)。選擇雄穗，取出花藥，消毒后接種到預(yù)先經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的各種組合的培養(yǎng)基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖+0.5~4.0mg/L2,4-D, 0.2~4.0mg/L KT)進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后，迅速增殖。 挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織將其多次繼代后轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)6代以上的轉(zhuǎn)接，建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞體系，懸浮培養(yǎng)繼代周期為15d，接種量為5g細(xì)胞于10mL液體培養(yǎng)基中。
[0014]2)培養(yǎng)條件
[0015]以白樺花藥懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，按50g/L接種量接種于10mL B5液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為:120rpm，25°C，光照強(qiáng)度2000Ix，光周期16h，濕度40 %~50 %，培養(yǎng)周期為1d0培養(yǎng)基成分為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及濃度為0.2mg/L6-BA和0.6mg/L TDZ,蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L，pH5.5~6.0，121 °C高溫高壓滅菌20min。
[0016]3)誘導(dǎo)子添加
[0017]SNP(Sodium Nitroprusside)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于滅菌蒸懼水中后經(jīng)
0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，在白樺花藥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時(shí)添加入培養(yǎng)基中，終濃度分別為lmmol/L,添加后12h,48h收獲細(xì)胞。
[0018]4)總?cè)频奶崛〖昂繙y(cè)定
[0019]精密稱取0.05g細(xì)胞干樣，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超聲40min，取100 μ L上清液于1ml離心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 μ L5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷卻。乙酸乙酯定容至5ml后測(cè)定其在551nm的吸光值(對(duì)照組為200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0020]總?cè)频臉?biāo)準(zhǔn)曲線以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行繪制，其回歸方程為y =43.044x-0.6438，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997，齊墩果酸在4~32mg/L含量范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
[0021]5)齊墩果酸的提取及含量測(cè)定
[0022]齊墩果酸的提取參照譚朝陽(yáng)[80]等的方法，具體方法如下:精密稱取0.5g細(xì)胞干樣，加入25mL鹽酸-乙醇溶液(2: 8)，加熱回流3h，放冷，搖勻并濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液15mL,加蒸餾水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低溫蒸干，加Iml甲醇溶解殘?jiān)?，并將其?.45 μ m有機(jī)濾膜濾過(guò)，此為樣品檢測(cè)液，然后利用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。
[0023]高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件:用Waters公司600-717-2487色譜系統(tǒng)，色譜柱HiQ sil C18V4.6mmX 250mm ;流動(dòng)相為乙腈:水=9:1 ;柱溫25V ;靈敏度16AUFS ;流速
1.0mT,/miη ;檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm,進(jìn)樣 20uL。
[0024]齊墩果酸線性關(guān)系考察:精密吸取濃度為0.5mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、
0.5、l、2、3、4、5mL，分別置于5mL容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μ L進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。齊墩果酸回歸方程為:y = 107x+33446, R2 = 0.9992。結(jié)果表明，齊墩果酸在0.2-5.0 μ g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
[0025]本發(fā)明的效果:本發(fā)明利用SNP來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生產(chǎn)的能力，獲得的白樺總?cè)坪妄R墩果酸含量大大提高。由上述技術(shù)方案，以白樺花藥懸浮細(xì)胞為材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果是:SNP處理后，白樺花藥懸浮細(xì)胞中齊墩果酸含量為1.3089mg/gDW，是對(duì)照組的569%。細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪窟_(dá)到23.86mg/gDW，為對(duì)照組的143.20%。因此，這是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的白樺總?cè)坪妄R墩 果酸的生產(chǎn)方法。
【權(quán)利要求】
1.本專利提出NO促進(jìn)白樺三萜合成技術(shù)為:以白樺花藥懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，按50g/L接種量接種于10mL B5液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為:120rpm，25°C，光照強(qiáng)度20001x，光周期16h，濕度40%~50%，培養(yǎng)周期為10d。培養(yǎng)基成分為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及濃度為 0.1 ~0.3mg/L6-BA 和 0.5 ~4.0mg/L TDZ,蔗糖 20g/L,酸水解酪蛋白 lg/L，ρΗ5.5 ~6.0，121 °C高溫高壓滅菌20min。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)第8天加入SNP使其終濃度為lmmol/L，培養(yǎng)12h后收獲，齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDff,是對(duì)照組的569 %。培養(yǎng)48h收獲，細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪窟_(dá)到23.86mg/gDW，為對(duì)照組的143.20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的方法，其中的液體培養(yǎng)基為為B5基本培養(yǎng)基，附加激素及濃度為0.1~0.3mg/L6-BA和0.5~4.0mg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的方法，其中的白樺花藥細(xì)胞接種量為5g鮮細(xì)胞含10ml培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速120r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的方法， 其中SNP溶液通過(guò)0.22um無(wú)菌膜過(guò)濾除菌，在懸浮培養(yǎng)第八天加入，培養(yǎng)周期為10天，且SNP的終濃度為lmmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的方法，其中的收獲時(shí)間為SNP添加12-24h后收獲懸浮細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的方法，其中SNP處理后齊墩果酸含量最高為1.3089mg/gDff,是對(duì)照組的569%。細(xì)胞內(nèi)總?cè)坪窟_(dá)到23.86mg/gDff,為對(duì)照組的143.20%。
【文檔編號(hào)】C12P33/00GK104031970SQ201410260611
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月22日
【發(fā)明者】詹亞光, 曾凡鎖, 辛穎, 劉堃, 齊鳳慧, 范桂枝, 尹靜, 由香玲 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 詹亞光, 曾凡鎖