一類納米限域功能化材料及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類納米限域功能化材料及其制備方法和應(yīng)用。該納米限域功能化材料以具有一定納米孔分布的聚合物整體材料或聚合物微球材料為基礎(chǔ)材料，在其表面修飾羥基乙胺官能團(tuán)，所得材料對(duì)分子尺寸與納米孔尺寸相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)具有可逆的相互作用。一方面，該材料上的納米孔能對(duì)分子尺寸相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)生限域效應(yīng)，對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)生顯著的親和力。另一方面，該材料納米孔內(nèi)的羥基乙胺配基可以和蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基發(fā)生非共價(jià)的協(xié)同作用。該材料在高pH條件下與相應(yīng)的蛋白質(zhì)具有相當(dāng)強(qiáng)的結(jié)合力，當(dāng)環(huán)境pH調(diào)節(jié)切換為酸性時(shí)，該材料上的結(jié)合蛋白質(zhì)被可逆地釋放。利用以上特性，該材料可應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化、分離、富集、固載與藥物遞送等領(lǐng)域。
【專利說明】一類納米限域功能化材料及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能化材料領(lǐng)域，也涉及蛋白質(zhì)的純化、分離、富集、固載與藥物遞送領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)具有重要的作用，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含量差異大，因此蛋白質(zhì)的純化和分離工作顯得非常重要。各種類型的功能化材料被用于蛋白質(zhì)的純化和分離，如尺寸排阻材料、反相材料、正相材料、親水材料、疏水材料、離子交換材料、親和材料等等。其中，親和材料在蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和研究中占據(jù)核心位置，很多蛋白質(zhì)的純化與富集主要依靠親和材料來(lái)完成。目前，按照配基來(lái)源可以將親和材料分為生物配基型和非生物配基型。常見的生物配基有抗體、蛋白A、凝集素和核酸適配體等。生物配基型親和材料具有特異性好的優(yōu)點(diǎn)，但存在穩(wěn)定性差、成本高和使用條件比較苛刻等缺點(diǎn)。非生物配基有染料、金屬離子螯合物和取代硼酸等。非生物配基型親和材料雖然特異性較差，但具有成本低、穩(wěn)定性好和使用條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]上述材料在用于純化和分離蛋白質(zhì)時(shí)，一般要求材料的孔徑至少是目標(biāo)蛋白質(zhì)尺寸的5-10倍，很少有報(bào)道利用與蛋白質(zhì)尺寸相當(dāng)?shù)目讖絹?lái)結(jié)合蛋白質(zhì)。最近，我們已發(fā)展出兩類獨(dú)特的仿生親和材料，包括硼親和仿生整體材料[劉震、劉云春、路越。中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?2011110347517.4]和硼親和分子印跡聚合物[李澧、劉震。中國(guó)發(fā)明專利，專利號(hào):ZL201110416198.8]，不僅利用了非生物配基的化學(xué)選擇性，還結(jié)合了材料本身的孔徑性質(zhì)，如納米孔的分子尺寸 排阻效應(yīng)和印跡空腔的形狀選擇性，從而顯著地提高了該些材料對(duì)蛋白質(zhì)的特異性和結(jié)合。此外，我們還觀察到，若印跡空腔與模板蛋白質(zhì)具有良好的尺寸和形狀互補(bǔ)性，即便親和配基沒有發(fā)揮作用，分子印跡聚合物材料對(duì)模板蛋白質(zhì)已有相當(dāng)強(qiáng)的親和力(Shuangshou Wang, Jin Ye, Zijun Bie, Zhen Liu.Chem.Sc1., DO1: 10.1039/C3SC52986J)。受以上兩類材料中納米孔所起作用的啟發(fā)，本專利旨在利用具有明顯納米孔分布的多孔材料發(fā)展出創(chuàng)新的功能材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有用于蛋白質(zhì)分析的功能化材料中普適性和易操控性不足的問題，本發(fā)明首次提出依靠限域效應(yīng)并輔以協(xié)同效應(yīng)來(lái)可逆地結(jié)合和釋放蛋白質(zhì)，即以具有一定納米孔分布的聚合物整體材料或聚合物微球材料為基礎(chǔ)材料，以能夠和蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基發(fā)生相互作用的羥基乙胺官能團(tuán)為配基，制備能夠通過調(diào)控環(huán)境PH來(lái)可逆地結(jié)合和釋放相應(yīng)尺寸大小蛋白質(zhì)的納米限域功能化材料。
[0005]為了解決
【發(fā)明內(nèi)容】
中的技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]該納米限域功能化材料以具有一定納米孔分布的聚合物整體材料或聚合物微球材料為基礎(chǔ)材料，在所述基礎(chǔ)材料表面進(jìn)行羥基乙胺功能化修飾，從而得到納米限域功能化材料。[0007]本發(fā)明中，所述納米限域功能化材料的孔徑在2-100nm的范圍有一定的分布。
[0008]本發(fā)明中，所述納米限域功能化材料在高pH (pH ≥ 6.0)條件下與蛋白質(zhì)作用力強(qiáng)，能夠結(jié)合蛋白質(zhì)；而在低pH (pH ≤ 3.0)條件下與蛋白質(zhì)作用力弱,從而能將被結(jié)合的蛋白質(zhì)釋放；高PH條件下結(jié)合的蛋白質(zhì)，在環(huán)境切換為低pH時(shí)所述納米限域功能化材料上結(jié)合的蛋白質(zhì)能夠被可逆地洗脫。
[0009]本發(fā)明中，所述納米限域功能化材料的形式包括整體材料或微球材料；但不限于這兩種形式，還可以是其他形式的材料，如納米粒子、薄膜等。
[0010]本發(fā)明中，所述納米限域功能化材料的表面必須分布有羥基乙胺配基。
[0011]本發(fā)明中，所述羥基乙胺配基是通過氨類化合物和環(huán)氧官能團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)得到的。
[0012]本發(fā)明中，所述氨類化合物可以是氨水、乙胺、乙二胺等能夠與環(huán)氧發(fā)生開環(huán)反應(yīng)的含有氨基官能團(tuán)的化合物。
[0013]制備上述納米限域功能化材料的方法，包括以下步驟:
[0014]I)制備具有連續(xù)納米孔孔徑分布的和具有環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料；
[0015]2)將氨類化合物與步驟I)中得到的多孔基礎(chǔ)材料表面的環(huán)氧官能團(tuán)反應(yīng)，即得到納米限域功能化材料。
[0016]步驟I)中，將交聯(lián)劑、含有環(huán)氧官能團(tuán)的單體、致孔劑和引發(fā)劑混合成均一溶液，在75°C溫度下反應(yīng)12h，即得到具有連續(xù)納米孔孔徑分布的含有環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料。
[0017]步驟2)中，將氨類化合物溶于有機(jī)溶劑中，在60°C溫度條件下與所述多孔基礎(chǔ)材料發(fā)生環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)12h后，即得到納米限域功能化材料。
[0018]本發(fā)明納米限域功能化材料可應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化、分離、富集、固載與藥物遞送。
[0019]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次描述了一種專門利用納米孔的限域效應(yīng)以結(jié)合蛋白質(zhì)的納米限域功能化材料。本發(fā)明納米限域功能化材料以在一定納米孔范圍內(nèi)具有一定孔徑分布的多孔材料為基礎(chǔ)材料，在基礎(chǔ)材料表面進(jìn)行羥基乙胺功能化修飾。一方面，該基礎(chǔ)材料上的納米孔能對(duì)分子尺寸相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)生限域效應(yīng)；另一方面，該基礎(chǔ)材料納米孔內(nèi)的羥基乙胺配基可以和蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基發(fā)生非共價(jià)的協(xié)同作用，且在高pH (pH≥6.0)時(shí)作用力強(qiáng)而在低pH (pH≤3.0)時(shí)作用力弱。從而，該材料在高pH條件下與相應(yīng)的蛋白質(zhì)具有高結(jié)合力，解離常數(shù)在10_6~10_7M范圍內(nèi)；而當(dāng)環(huán)境調(diào)節(jié)切換為酸性時(shí)，該材料上結(jié)合的蛋白質(zhì)可以被可逆地洗脫。利用以上特性，該納米限域功能化材料可應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化、分離、富集、固載與藥物遞送。和已有的其他材料相比，該納米限域功能化材料的優(yōu)勢(shì)在于:1)僅結(jié)合與納米孔尺寸相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)，其他分子尤其是小分子化合物的保留弱；2)結(jié)合/釋放通過改變pH來(lái)調(diào)節(jié)，條件溫和，操作簡(jiǎn)便；3)成本低，穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1納米限域功能化材料的制備示意圖。
[0021]圖2納米限域功能化材料可逆地結(jié)合和釋放蛋白質(zhì)的原理圖。[0022]圖3環(huán)氧基整體材料及其衍生的功能化整體材料的紅外表征圖，其中，a為環(huán)氧基整體材料；b為羥基乙胺功能化整體材料；c為羥基乙胺乙烷功能化整體材料；d為羥基二乙二胺功能化整體材料。
[0023]圖4環(huán)氧基微球材料和羥基二乙二胺功能化微球材料的紅外表征圖，其中，a為環(huán)氧基微球材料；b為羥基二乙二胺功能化微球材料。
[0024]圖5環(huán)氧基整體材料和羥基二乙二胺功能化整體材料的形貌表征圖，其中，A-1和A-2分別為環(huán)氧基整體材料的200，000倍和500，000倍放大圖；B_1和B-2為羥基二乙二胺功能化整體材料的200，000倍和500，000倍放大圖。
[0025]圖6環(huán)氧基微球材料和羥基二乙二胺功能化微球材料的形貌表征圖，其中，A-1和A-2分別為環(huán)氧基微球材料的50，000倍和200，000倍放大圖；B_1和B-2為羥基二乙二胺功能化微球材料的50，000倍和200，000倍放大圖。
[0026]圖7環(huán)氧基整體材料和羥基二乙二胺功能化整體材料的孔徑分布圖，其中，A為環(huán)氧基整體材料；B為羥基二乙二胺功能化整體材料。
[0027]圖8環(huán)氧基微球材料和羥基二乙二胺功能化微球材料的孔徑分布圖，其中，A為環(huán)氧基微球材料；B為羥基二乙二胺功能化微球材料。
[0028]圖9羥基二乙二胺功能化整體材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。上樣緩沖液:20mM磷酸鹽(pH=7.0);洗脫液:100mM醋酸溶液；樣品:lmg/mL蛋白質(zhì)溶液；進(jìn)樣量:600nL ;流速:
1.0 μ L/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):214nm。其中，a表示空白、b表示牛血清白蛋白、c表示人血清白蛋白、d表示轉(zhuǎn)鐵蛋白、e表示β -乳球蛋白A、f表示β -乳球蛋白B、g表示血紅蛋白、h表示甲種胎球蛋白的單克隆抗體、i表示癌胚抗原的單克隆抗體、j表示前列腺特異抗原的單克隆抗體、k表示甲種胎球蛋白、I表示卵清白蛋白、m表示溶菌酶、η表示促紅細(xì)胞生成素、O表示β-酪蛋白、P表示親和 素、q表示胰蛋白酶。
[0029]圖10羥基二乙二胺功能化微球材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。樣品濃度:0.5mg/mL蛋白質(zhì)；上樣緩沖液:20mM磷酸鹽(pH=7.0);洗脫液:100mM醋酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。所測(cè)蛋白質(zhì)包括卵清白蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRA)、血紅蛋白(ΗΕ0)、溶菌酶(LYS)、β-酪蛋白(CAS)、胰蛋白酶(TRY)。
[0030]圖11人血清白蛋白功能化整體住(b)對(duì)DL-色氨酸的手性分離色譜圖，并以羥基二乙二胺功能化整體住(a)為對(duì)照柱。流動(dòng)相:67mM磷酸緩沖液(pH=7.4);進(jìn)樣體積:50nL ；樣品濃度:lmg/mL ;流速:0.6 μ L/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。
[0031]圖12辣根過氧化物酶在胰蛋白酶功能化整體住上酶解后的肽段質(zhì)譜圖。酶解緩沖液:50mM碳酸氫銨緩沖液(pH=8.5);酶解時(shí)間:2小時(shí)；酶解溫度:37°C?！锉硎捐b定出的糖蛋白。
[0032]圖13羥基二乙二胺功能化整體材料去除人類血清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖，其中，A為人類血清中的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖出為羥基二乙二胺功能化整體材料從人類血清中富集到的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。
[0033]圖14人類血清被羥基二乙二胺功能化整體材料去除蛋白質(zhì)后的小分子肽段質(zhì)譜圖，其中，A為人類血清中的肽段質(zhì)譜圖；B為Zip-Tip C18材料從人類血清中富集到的肽段質(zhì)譜圖；(:為羥基二乙二胺功能化整體材料去除人類血清中蛋白質(zhì)后肽段的質(zhì)譜圖山為羥基二乙二胺功能化整體材料和Zip-Tip C18材料共同處理人類血清后得到的肽段的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明納米限域功能化材料以在納米孔徑為2-100nm的范圍內(nèi)具有連續(xù)孔分布的聚合物整體材料和聚合物微球材料為基礎(chǔ)材料，在其表面進(jìn)行羥基乙胺功能化修飾。
[0035]制備上述納米限域功能化材料的方法，包括以下步驟:
[0036]I)制備在一定孔徑范圍(孔徑為2-100nm)具有連續(xù)孔徑分布的和環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料；具體為:將交聯(lián)劑、含有環(huán)氧官能團(tuán)的單體、致孔劑和引發(fā)劑混合成均一溶液，在75°C溫度下反應(yīng)12h，即得到具有一定納米孔分布的含有環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料。
[0037]2)將氨類化合物與步驟I)中得到的多孔基礎(chǔ)材料表面的環(huán)氧官能團(tuán)反應(yīng)，即得到納米限域功能化材料；具體為:將氨類化合物溶于有機(jī)溶劑中，在60°C溫度條件下與所述多孔基礎(chǔ)材料發(fā)生環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)12h后，即得到納米限域功能化材料。
[0038]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0039]實(shí)施例1:環(huán)氧基整體材料的制備
[0040]環(huán)氧基整體材料采用熱引發(fā)自由基聚合反應(yīng)合成。先將含有環(huán)氧官能團(tuán)的單體如甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)47mg、交聯(lián)劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)43mg、致孔劑十二醇125mg和二甲亞砜140mg與引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)Img混合，渦旋5分鐘，然后超聲30分鐘，得到均一的預(yù)聚液。然后將此預(yù)聚液在75°C條件下反應(yīng)12小時(shí)。聚合反應(yīng)完成后，先后用甲醇和乙腈(ACN)洗滌未反應(yīng)的物質(zhì)。洗滌干凈后，在60°C的真空條件下干燥12小時(shí)，即得到具有一定納米孔分布的環(huán)氧基整體材料，最后放入0-4°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。所述環(huán)氧基整體材料的紅外表征圖如圖3中a圖所示，形貌表征圖如圖5中A-1和A-2所示，孔徑分布圖如圖7中A圖所示。
[0041]實(shí)施例2:羥基乙胺功能化整體材料的制備
[0042]如圖1所示，將實(shí)施例1中制備的環(huán)氧基整體材料和過量的NH3.H2O-ACN溶液(NH3.H2O-ACN溶液是由質(zhì)量百分比為25%的NH3.H2O和ACN溶劑按照體積比1:1混合而成)混合在一起，然后將該混合物在60°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢后用甲醇洗滌24h，隨后在60°C真空下干燥12h。由此得到的材料即為羥基乙胺功能化整體材料。所述羥基乙胺功能化整體材料的紅外表征圖如圖3中b圖所示，環(huán)氧官能團(tuán)在990.7和756.1cnT1之間的吸收峰消失了，說明氨水和環(huán)氧官能團(tuán)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)，生成了羥基乙胺官能團(tuán)。
[0043]實(shí)施例3:羥基乙胺乙烷功能化整體材料的制備
[0044]如圖1所示，將實(shí)施例1中制備的環(huán)氧基整體材料和過量的NH2C2H5-ACN(NH2C2H5-ACN是由NH2C2H5溶劑和ACN溶劑按照體積比1:1混合而成)混合在一起，然后將該混合物在60°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢后用甲醇洗滌24h，隨后在60°C真空下干燥12h。由此得到的材料即為羥基乙胺 乙烷功能化整體材料。所述羥基乙胺乙烷功能化整體材料的紅外表征圖如圖3中c圖所示，環(huán)氧官能團(tuán)在990.7和756.1cnT1之間的吸收峰消失了，說明乙胺和環(huán)氧官能團(tuán)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)，生成了乙烷羥基乙胺官能團(tuán)。
[0045]實(shí)施例4:羥基二乙二胺功能化整體材料的制備
[0046]如圖1所示，將實(shí)施例1中制備的環(huán)氧基整體材料和過量的NH2C2H4NH2ACN(NH2C2H4NH2ACN是由NH2C2H4NH2溶劑和ACN溶劑按照體積比1:1混合而成)混合在一起，然后將該混合物在60°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢后用甲醇洗滌24h，隨后在60°C真空下干燥12h。由此得到的材料即為羥基二乙二胺功能化整體材料。所述羥基二乙二胺功能化整體材料的紅外表征圖如圖3中d圖所示，形貌表征圖如圖5中B-1和B-2所示，孔徑分布圖如圖7中B圖所示，說明該材料在一定的納米孔范圍內(nèi)有連續(xù)的孔徑分布。
[0047]實(shí)施例5:羥基二乙二胺功能化微球材料的制備
[0048]將購(gòu)買的環(huán)氧基多孔微球材料和過量的NH2C2H4NH2/ACN (NH2C2H4NH2/ACN是由NH2C2H4NH2溶劑和ACN溶劑按照體積比1:1混合而成)混合在一起，然后將該混合物在60°C下反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢后用甲醇洗滌24h，隨后在60°C真空下干燥12h。由此得到的即為羥基二乙二胺功能化微球材料。環(huán)氧基多孔微球材料和羥基二乙二胺功能化微球材料的紅外表征圖如圖4所示，環(huán)氧官能團(tuán)在986.4CHT1的吸收峰的消失，表明乙二胺和環(huán)氧官能團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)。形貌表征如圖6所示，孔徑分布如圖8所示，說明該材料在一定的納米孔范圍內(nèi)有連續(xù)的孔徑分布。
[0049]實(shí)施例6:羥基乙胺功能化整體材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放
[0050]將實(shí)施例1中的預(yù)聚液按照文獻(xiàn)[J.Chromatogr.A, 1305 (2013) 123 - 130]中報(bào)道的方法，制備成環(huán)氧基整體柱；然后按照實(shí)施例2中的方法，制備羥基乙胺功能化整體柱。采用高效液相色譜法對(duì)羥基乙胺功能化整體柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放實(shí)驗(yàn)。儀器的基本參數(shù)設(shè)置如下:流速1.0 μ L/min,進(jìn)樣量600nL,檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)述如下:先用上樣液(20mM磷酸鹽，pH=7.0)平衡柱子，然后進(jìn)樣；接著用上樣液沖洗15分鐘，然后切換為IOOmM醋酸溶液，洗脫被柱子抓住的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，該材料能夠抓取牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β -乳球蛋白Α、血紅蛋白、甲種胎球蛋白的單克隆抗體、甲種胎球蛋白、卵清白蛋白、溶菌酶等蛋白質(zhì)，并且能夠在酸性條件下洗脫被結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0051]實(shí)施例7:羥基乙胺乙烷功能化整體材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放
[0052]將實(shí)施例6中制備的環(huán)氧基整體柱，按照實(shí)施例3中的方法，制備成羥基乙胺乙烷功能化整體柱。采用高效液相色譜法對(duì)羥基乙胺乙烷功能化整體柱進(jìn)行了蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放實(shí)驗(yàn)，條件同實(shí)施例6。結(jié)果表明，該材料能夠結(jié)合牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β_乳球蛋白Α、血紅蛋白、甲種胎球蛋白的單克隆抗體、甲種胎球蛋白、卵清白蛋白、溶菌酶等蛋白質(zhì)，并且能夠在酸性條件下洗脫被結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0053]實(shí)施例8:羥基二乙二胺功能化整體材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放
[0054]將實(shí)施例6中制備的環(huán)氧基整體柱，按照實(shí)施例4中的方法，制備成羥基二乙二胺功能化整體住。采用高效液相色譜法對(duì)羥基二乙二胺功能化整體柱進(jìn)行了蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放實(shí)驗(yàn)，條件同實(shí)施例6。結(jié)果表明，如圖9所示，該材料能夠抓取牛血清白蛋白、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β -乳球蛋白Α、β -乳球蛋白B、血紅蛋白、甲種胎球蛋白的單克隆抗體、癌胚抗原的單克隆抗體、前列腺特異抗原的單克隆抗體、甲種胎球蛋白、卵清白蛋白、溶菌酶、促紅細(xì)胞生成素、酪蛋白、親和素、胰蛋白酶等蛋白質(zhì)，并且能夠在酸性條件下洗脫被結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0055]實(shí)施例9:羥基二乙二胺功能化微球材料對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放
[0056]將實(shí)施例5中制備的羥基二乙二胺功能化微球材料，在20mM磷酸鹽pH=7.0條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合和釋放實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確秤取5.0OOmg羥基二乙二胺功能化微球材料，然后加入0.5mg/mL蛋白質(zhì)溶液ImL,在室溫下振蕩I小時(shí)。隨后,在10，000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心3分鐘，去除上清液后，用緩沖液洗滌三次，每次lmL，以去除非結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后加入120 μ L洗脫液(洗脫液是IOOmM醋酸溶液)，振蕩I小時(shí)。最后，在10，000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心3分鐘，取出洗脫液，測(cè)定其在280nm下的吸光度，其吸光度的大小可以代表該材料結(jié)合蛋白質(zhì)的量。同時(shí)，用環(huán)氧基多孔微球材料作為對(duì)照。結(jié)果表明，如圖10所示，羥基二乙二胺功能化微球材料能夠抓取卵清白蛋白、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、β_酪蛋白、胰蛋白酶等蛋白質(zhì)，并且能夠在酸性條件下洗脫被結(jié)合的蛋白質(zhì)。
[0057]實(shí)施例10:人血清白蛋白功能化整體柱的制備和在手性分離中的應(yīng)用
[0058]在氮?dú)鈮毫ο?，先?7mM磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)將60cm長(zhǎng)的的羥基二乙二胺功能化整體柱(制備方法見實(shí)施例8)平衡I小時(shí)，然后將過量的lmg/mL的人血清白蛋白溶液(采用67mM pH=7.4磷酸鹽緩沖液配制)慢慢通過柱子，最后用磷酸鹽緩沖液沖洗，至沖洗液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止，即得到人血清白蛋白功能化整體住。將制備得到的人血清白蛋白功能化整體住用于DL-色氨酸的手性分離，結(jié)果見圖11，可以看出固載在羥基二乙二胺功能化整體材料上的人血清白蛋白仍然保持著手性分離能力。在反復(fù)使用過程中，如果手性分離能力下降，可以用酸性溶液(比如IOOmM醋酸溶液)將固載的人血清白蛋白洗脫下來(lái)，然后用前述方法重新制備人血清白蛋白功能化整體住，即可完成人血清白蛋白功能化整體柱的再生，此再生優(yōu)勢(shì)是通過共價(jià)鍵固載蛋白質(zhì)的材料不具備的。
[0059]實(shí)施例11:胰蛋白酶功能化整體住的制備和在蛋白質(zhì)酶解方面的應(yīng)用
[0060]在氮?dú)鈮毫ο拢扔?0mM碳酸氫銨緩沖液(ρΗ=8.5)將25cm長(zhǎng)的羥基二乙二胺功能化整體住平衡I小時(shí)，然后將過量的lmg/mL的胰蛋白酶溶液(采用5OmM pH=8.5碳酸氫銨沖液配制)慢慢通過柱子，最后用碳酸氫銨緩沖液沖洗，至沖洗液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止，即得到胰蛋白酶功能化整體住。
[0061]在氮?dú)鈮毫ο?，將胰蛋白酶功能化整體住中的緩沖液吹干。然后，在氮?dú)鈮合伦⑷雔mg/mL的辣根過氧化物酶`溶液(采用50mM pH=8.5碳酸氫銨緩沖液配制)，立即用硅膠將柱子兩端密封，放入到37°C的水浴鍋內(nèi)反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用5μ L緩沖液將柱內(nèi)酶解液沖出，收集沖出液直接用于質(zhì)譜分析。從圖12可以看出，一共檢測(cè)到249個(gè)肽段信號(hào)，其中包括8個(gè)糖肽信號(hào)對(duì)應(yīng)于過氧化物酶的6個(gè)糖基化位點(diǎn)。結(jié)果表明，固載在整體材料上的胰蛋白酶仍然保持著酶解活性，能夠酶解蛋白質(zhì)。與文獻(xiàn)中報(bào)道的整體柱酶解反應(yīng)器相比[Anal.Chem.2013, 85，2847-2852]，該胰蛋白酶功能化整體柱所需胰蛋白酶的量較少；另外，使用完畢后可以用酸性溶液將剩余的胰蛋白酶洗脫下來(lái)，然后用前述方法重新制備胰蛋白酶功能化整體住。
[0062]實(shí)施例12:羥基二乙二胺功能化整體住用于血清中蛋白質(zhì)的富集和去除
[0063]先用20mM磷酸鹽(pH=7.0)緩沖液將I μ L血清稀釋10倍得到血清稀釋液，然后將該血清稀釋液在氮?dú)鈮毫ο侣ㄟ^羥基二乙二胺功能化整體柱，收集流出液；接著用磷酸鹽緩沖液(20mM，pH=7.0)沖洗，至沖洗液中檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止；最后用IOOmM醋酸溶液洗脫被柱子富集到的蛋白質(zhì)，并收集洗脫液。收集到的洗脫液可以直接用于質(zhì)譜分析，從圖13可以看出，血清中的高豐度蛋白質(zhì)幾乎均可以在中性條件下被羥基二乙二胺功能化整體住抓住，并在酸性條件下洗脫下來(lái)。收集到的流出液經(jīng)過冷凍干燥和2 μ L0.1%三氟乙酸溶液復(fù)溶后，用質(zhì)譜分析流出液中的肽段(見圖14C，13個(gè)峰)；也可以用Zip-Tip C18材料除鹽后，再用質(zhì)譜分析(見圖14D，67個(gè)峰)；為了證實(shí)羥基二乙二胺功能化整體住的優(yōu)勢(shì)，用Zip-Tip C18材料直接吸附血清稀釋液中肽段，然后用于質(zhì)譜分析(見圖14B，2個(gè)峰)。比較圖14中的四張質(zhì)譜圖，可以看出當(dāng)血清中的高豐度蛋白質(zhì)被去除后，可以明顯提高小分子肽段的檢測(cè)靈敏度。
[0064]實(shí)施例13:羥基二乙二胺功能化整體材料與蛋白質(zhì)解離常數(shù)的測(cè)定
[0065]用20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)配制一系列濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。在氮?dú)鈮毫ο?，先?0μ L磷酸鹽緩沖液(20mM，pH=7.0)平衡20厘米長(zhǎng)的羥基二乙二胺功能化整體住；再用110 μ L蛋白質(zhì)溶液通過該整體柱，并收集流出液(記為溶液Α);然后用IOyL磷酸鹽緩沖液洗滌該整體柱；最后用110 μ LlOOmM醋酸溶液洗脫被整體柱結(jié)合的蛋白質(zhì)，并收集洗脫液(記為溶液B)。對(duì)系列蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、溶液A和溶液B進(jìn)行紫外吸光度檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。根據(jù)Scatchard方程計(jì)算解離常數(shù)和表觀最大結(jié)合容量，結(jié)果見表1。
[0066]實(shí)施例14:羥基二乙二胺功能化微球材料與蛋白質(zhì)解離常數(shù)的測(cè)定
[0067]用20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)配制一系列濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取ImL蛋白質(zhì)溶液與0.5mg微球材料于1.5mL離心管中，振蕩12小時(shí)，以充分達(dá)到吸附平衡狀態(tài)；然后，在10，000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心3分鐘，收集上清液；隨后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次lmL，用離心法去除洗滌液；最后加入100 μ LlOOmM醋酸溶液，振蕩I小時(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)解吸，在15000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心3分鐘，收集洗脫液。對(duì)系列蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、上清液和洗脫液進(jìn)行紫外吸光度檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。根據(jù)Scatchard方程進(jìn)行解離常數(shù)和表觀最大結(jié)合容量的計(jì)算，結(jié)果見表1。
[0068]表1羥基二 乙二胺功能化整體材料和微球材料與蛋白質(zhì)的解離常數(shù)和表觀最大結(jié)合容量。
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一類納米限域功能化材料，其特征在于，所述納米限域功能化材料以具有一定納米孔分布的整體材料或微球材料為基礎(chǔ)材料，且在所述基礎(chǔ)材料表面分布羥基乙胺配基，并通過調(diào)節(jié)PH來(lái)可逆地結(jié)合或釋放蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米限域功能化材料，其特征在于，所述納米限域功能化材料在pH > 6.0條件下結(jié)合蛋白質(zhì),而在pH≤3.0條件下釋放被結(jié)合的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米限域功能化材料，其特征在于，所述納米限域功能化材料的形式包括聚合物整體材料，或者聚合物微球材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米限域功能化材料，其特征在于，所述羥基乙胺配基是通過氨類化合物和環(huán)氧官能團(tuán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米限域功能化材料，其特征在于，所述氨類化合物可以是氨水、乙胺、乙二胺等含有氨類官能團(tuán)的化合物。
6.一種權(quán)利要求1所述的納米限域功能化材料的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: O制備具有連續(xù)納米孔孔徑分布的和具有環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料； 2)將氨類化合物與步驟I)中得到的多孔基礎(chǔ)材料表面的環(huán)氧官能團(tuán)反應(yīng)，即得到納米限域功能化材料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米限域功能化材料的制備方法，其特征在于:步驟I)中，將交聯(lián)劑、含有環(huán)氧官能團(tuán)的單體、致孔劑和引發(fā)劑混合成均一溶液，在75°C溫度下反應(yīng)12h，即得到具有連續(xù)納米孔孔徑分布的含有環(huán)氧官能團(tuán)的多孔基礎(chǔ)材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米限域功能化材料的制備方法，其特征在于:步驟2)中，將氨類化合物溶于有機(jī)溶劑中，在60°C溫度條件下與所述多孔基礎(chǔ)材料發(fā)生環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)12h后，即得到納米限域功能化材料。
9.權(quán)利要求1所述的納米限域功能化材料在蛋白質(zhì)的純化、分離、富集、固載與藥物遞送中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/36GK103772736SQ201410008416
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】劉震, 李前進(jìn), 涂雪瑩 申請(qǐng)人:南京大學(xué)