專利名稱：一種基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分子檢測(cè)與納米材料的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及到納米Pd在生物分 子(DNA、蛋白質(zhì)等分子)標(biāo)記、自催化信號(hào)放大，提供了一種除傳統(tǒng)放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記及 納米金標(biāo)記之外的一種新型生物分子標(biāo)記與檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物分析和生物信息采集是生物醫(yī)學(xué)研究和疾病臨床診斷的基礎(chǔ)，如何建立一個(gè) 靈敏度高、選擇性好、成本低、分析速度快、自動(dòng)化及能在復(fù)雜體系中在線連續(xù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn) 的檢測(cè)方法，對(duì)疾病的預(yù)防、診斷和治療有著重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)檢測(cè)信息量 的多少，通常將檢測(cè)技術(shù)分為單個(gè)生物傳感器、生物傳感芯片及生物芯片等幾個(gè)方面。其本 質(zhì)均是利用生物分子識(shí)別原理，將其過(guò)程中產(chǎn)生的各種變化轉(zhuǎn)換成光、電、磁、壓電、聲等物 理信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析。在各種檢測(cè)手段中，電化學(xué)檢測(cè)與光學(xué)檢測(cè)是研究最多的兩大類型 檢測(cè)技術(shù)。特別是先對(duì)生物分子進(jìn)行熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光底物酶標(biāo)記，然后通過(guò)光學(xué)信號(hào) 檢測(cè)的路線，仍然是現(xiàn)在的主流檢測(cè)手段。但以上傳統(tǒng)方法同時(shí)也存在各種局限性，如前者 容易出現(xiàn)重復(fù)性差、而后者往往存在熒光分子的光漂白現(xiàn)象、動(dòng)力學(xué)范圍窄及需要精密的 光學(xué)系統(tǒng)等缺點(diǎn)，所以不斷尋找新的檢測(cè)手段仍是科學(xué)家的夢(mèng)想。近年來(lái)，納米材料在生物分子的標(biāo)記與檢測(cè)中的應(yīng)用已成為生物分析領(lǐng)域最具 活力的研究方向。納米材料通常具有比表面積大、高活性、極微小性等特點(diǎn)，而這些特性與 傳感器所要求的多功能化、微型化、高速化等要求相對(duì)應(yīng)。此外，納米顆粒還在光學(xué)、磁性、 催化等方面表現(xiàn)出一些特異性能。比如，由于半導(dǎo)體納米粒子具有熒光產(chǎn)率極高、發(fā)射峰 窄、Mocks位移隨粒徑可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，自1998年kience報(bào)道用于生物大分子的標(biāo)記以來(lái)， 量子點(diǎn)就被廣泛地用于各種生物分子的發(fā)光材料標(biāo)記，為開(kāi)辟高靈敏度與多通道的同時(shí)檢 測(cè)的光學(xué)生物傳感器供了可能。利用各種金屬納米顆粒(Au、Ag)的表面等離子體共振對(duì)光 學(xué)影響的特性而發(fā)展起來(lái)各種標(biāo)記與檢測(cè)方法更是其中的一個(gè)亮點(diǎn)，其中最為典型的就是 圍繞納米Au所開(kāi)展的一系列工作。如Mirkin教授等利用納米Au在DNA片段作為組裝分 子的引導(dǎo)下可形成超分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，建立了用巰基化寡核苷酸探針標(biāo)記納米Au并檢測(cè) 特定多核苷酸序列的新方法。1997年，他們利用納米Au粒子在聚集過(guò)程中距離變化而產(chǎn)生 紅色到黃色的顏色變化，檢出lOfmol/L的多聚核苷酸。2000年，他們結(jié)合納米Au標(biāo)記與 銀染顯色技術(shù)，有效地放大了雜交信號(hào)，比現(xiàn)有最靈敏的共聚焦誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法靈敏100 倍。2002年，他們加以改進(jìn)使得正配/單堿基錯(cuò)配的信號(hào)強(qiáng)度比大大提高，達(dá)到了 105:1， 而檢測(cè)靈敏度提高到500fmol。另外，在專利ZL2113147. 3中，劉等人也提出利用一種基因 芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)方法。在本發(fā)明中，我們提出了一種新型的利用納米Pd進(jìn)行生物分子標(biāo)記，并結(jié)合納米 Pd的催化性能，利用化學(xué)鍍進(jìn)行信號(hào)放大，最終借助化學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的性能如光學(xué)、磁 性等特性進(jìn)行檢測(cè)的一種新型生物分子檢測(cè)路線，如圖1所示。與目前各種文獻(xiàn)及專利所 報(bào)道的方法相比，該路線具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)從目標(biāo)分子與探針?lè)肿拥姆磻?yīng)動(dòng)力學(xué)角度看，納米Pd標(biāo)記時(shí)更利于反應(yīng)的進(jìn)行。因?yàn)檫B有納米顆粒的目標(biāo)分子向探針表面的擴(kuò)散速度 一般反比于顆粒的粒徑，即顆粒的直徑越小，其反應(yīng)速度越快。此外，由于納米Pd粒徑表面 對(duì)生物分子的非特異性吸附較少，從而更利于標(biāo)記的目標(biāo)生物分子在溶液中分散、保存，有 效避免了一些其它納米顆粒標(biāo)記目標(biāo)生物分子時(shí)所出現(xiàn)的顆粒間相互團(tuán)聚現(xiàn)象；(2)相對(duì) 于其它檢測(cè)手段來(lái)說(shuō)，通過(guò)Pd的催化作用進(jìn)行化學(xué)沉積技術(shù)路線更為簡(jiǎn)單、方便，不需要 昂貴的檢測(cè)儀器。這一點(diǎn)類似于專利ZL2113147. 3，但鑒于目前Pd的價(jià)格要低于Au，因此 該技術(shù)路線在成本上將更為低廉。同時(shí)，又不喪失檢測(cè)靈敏度，溶液中只需少量的目標(biāo)分子 結(jié)合到探針?lè)肿由希涂梢酝ㄟ^(guò)Pd的催化作用進(jìn)行檢測(cè)。(3)跟專利ZL2113147. 3所用的 相對(duì)納米金標(biāo)記銀染方法相比，由于納米Pd是傳統(tǒng)的催化材料，被廣泛地應(yīng)用各種催化反 應(yīng)中，因而具有更廣的催化性能，不僅能催化Ag+，同時(shí)還可以催化Cu2+、CO2+、Ni2+等各種金 屬離子。因此，從催化放大效應(yīng)及隨后的所鍍(或所染)金屬性質(zhì)來(lái)看，我們所提路線將更優(yōu) 于傳統(tǒng)的Au標(biāo)銀染技術(shù)。比如，傳統(tǒng)的Au標(biāo)銀染技術(shù)雖然也是通過(guò)納米Au對(duì)Ag+的還原 有催化作用，而將Ag沉積在Au顆粒表面。但最終信號(hào)檢測(cè)是通過(guò)肉眼來(lái)觀察單質(zhì)銀所呈現(xiàn) 的黑色斑點(diǎn)，或用普通的掃描儀掃描后再用相關(guān)軟件來(lái)分析信號(hào)的灰度。很顯然，這種信號(hào) 強(qiáng)度取決于銀沉積斑點(diǎn)的大小與顏色深度。但以納米Pd為標(biāo)記時(shí)，不僅可以通過(guò)沉積的顏 色來(lái)檢測(cè)(如Cu的沉積)，而且還可以利用通過(guò)催化M或Co等磁性材料進(jìn)行磁學(xué)檢測(cè)如利 用巨磁阻效應(yīng)的磁敏元件進(jìn)行信號(hào)讀取，此時(shí)，其檢測(cè)靈敏度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上面的顏色檢測(cè)。 另外，也可利用電化學(xué)手段如循環(huán)伏安法等對(duì)上述Pd催化沉積結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提出一種基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生 物檢測(cè)方法，目的之一是提出一種對(duì)生物分子如(DNA或蛋白質(zhì)等)進(jìn)行納米Pd標(biāo)記的方 法，即先通過(guò)巰基或氨基等功能團(tuán)與Pd表面的配位絡(luò)合作用，將特定穩(wěn)定劑連接到納米顆 粒表面，同時(shí)再利用穩(wěn)定劑上的其他功能團(tuán)如羧基等進(jìn)一步將生物分子如(DNA或蛋白質(zhì) 等)連接到其表面。最終要求以上所制顆粒在緩沖溶液中
有著良好的分散性。本發(fā)明的目的之二是著眼于Pd的催化性能，通過(guò)化學(xué)鍍方法，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)物的信號(hào) 放大，最終借助于沉積后的各種物理性質(zhì)如光、磁、電等進(jìn)行檢測(cè)。技術(shù)方案根據(jù)上述目標(biāo)，首先要尋找到一種合適的納米Pd顆粒制備與表面修 飾路徑，要求所得顆粒能滿足進(jìn)行生物分子標(biāo)記與檢測(cè)的一些基本要求如粒徑較小、均 一、能穩(wěn)定存在緩沖溶液中如PBS以及在方便與生物分子連接的同時(shí)，能降低對(duì)其他生物 分子的非特異性吸附。其次，找到一種簡(jiǎn)易的基于Pd顆粒的催化沉積過(guò)程，要求該過(guò)程對(duì) 生物分子之間的相互作用無(wú)明顯影響，同時(shí)又能具有明顯的信號(hào)放大與方便檢測(cè)。本發(fā)明的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法利用納米鈀顆 粒對(duì)
生物分子進(jìn)行標(biāo)記，并結(jié)合納米鈀的催化性能，利用化學(xué)鍍進(jìn)行信號(hào)放大，最終借助化 學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的光學(xué)、磁性特性進(jìn)行檢測(cè)。所述的納米鈀顆粒，其粒徑在O-IOOnm之間，以乙醇或水合胼為還原劑，以檸檬酸 鈉、PVP、PEG-SH、CTAB或SDS為穩(wěn)定劑還原得到。
所述的生物分子包含DNA片段、蛋白質(zhì)。 在對(duì)納米鈀表面修飾生物分子之前，利用二步法，將HS- (CH2) n-C00H或H2N- (CH2) n-C00H取代穩(wěn)定劑分子連接到鈀顆粒表面；所謂兩步法是指第一步先將納米鈀顆粒表面的 穩(wěn)定劑被TA取代，然后利用第二步，再將納米鈀顆粒表面的TA部分被HS-(CH2)n-COOH取 代；其中，η在4-20之間；
直接將獲得的Pd納米顆粒與所述生物分子直接孵育制得納米Pd顆粒標(biāo)記生物分子。將所獲得的HS-(CH2)n-COOH修飾鈀納米顆粒與生物分子孵育制得納米Pd顆粒標(biāo) 記生物分子。在納米鈀顆粒標(biāo)記的生物分子與探針?lè)肿影l(fā)生生物作用之后，利用化學(xué)鍍過(guò)程， 借助Pd的催化作用，在納米鈀顆粒周圍進(jìn)一步沉積上金屬顆粒進(jìn)行信號(hào)放大。化學(xué)鍍過(guò)程指在不通電的情況下，利用氧化還原反應(yīng)在納米Pd周圍獲得一層金 屬單質(zhì)或合金；其中，涉及的金屬包括鎳、銅、鋅、鈷、銀、金、鐵或它們間組合成的合金。所述的檢測(cè)是基于上述化學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的光學(xué)、磁性及其它特性；光學(xué)指沉積 后的顏色變化，能依據(jù)肉眼進(jìn)行判斷，活用灰度掃描儀進(jìn)行；磁性指鍍層所表現(xiàn)出的磁學(xué)特 性，借助巨磁阻效應(yīng)和超導(dǎo)量子干涉儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；其他特性包括將以上鍍層溶解后，再 借助電化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)溶解后的金屬離子濃度。該檢測(cè)過(guò)程不僅適用于生物芯片檢測(cè)，進(jìn)行高通量的篩選，同時(shí)也可用于單個(gè)生 物傳感器，進(jìn)行單個(gè)生物分子的檢測(cè)。有益效果與前面已報(bào)道的文獻(xiàn)或?qū)＠啾?，盡管本發(fā)明中所陳述的技術(shù)方案，從 某種程度看，上述路線有點(diǎn)類似“Au標(biāo)銀染”技術(shù)，同樣也是利用金屬納米顆粒標(biāo)記，再利 用其催化作用進(jìn)行信號(hào)放大，但從信號(hào)檢測(cè)的靈敏度角度看，該路線又要優(yōu)于“Au標(biāo)銀染”。 因?yàn)榍罢叩拇呋^(guò)程更廣，價(jià)格也更為低廉。從納米材料與生物檢測(cè)相結(jié)合的學(xué)科發(fā)展趨 勢(shì)看，本專利所延伸出的納米Pd標(biāo)記生物分子技術(shù)將擴(kuò)大了生物分子標(biāo)記技術(shù)，并在其他 生物檢測(cè)技術(shù)如電化學(xué)檢測(cè)中發(fā)揮一定作用，迎合了學(xué)科的發(fā)展。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的描述
圖1、基于納米Pd標(biāo)記自催化放大的檢測(cè)過(guò)程示意圖。圖Ia為DNA微陣列，圖Ib為待 測(cè)DNA與Pd標(biāo)記DNA在生物分子作用下結(jié)合到特定的序列上，圖Ic化學(xué)鍍后的微陣列，圖 Id與圖Ic 一樣顯示了化學(xué)鍍后的微陣列表面，在納米Pd顆粒周圍沉積上一層金屬層。圖2、基于兩步法進(jìn)行Pd納米顆粒表面修飾的示意圖，第一步先用硫辛酸將前 面的穩(wěn)定劑取代，第二步，再用HS-(CH2)n - COOH將硫辛酸取代，最終得到Pd - S-(CH2)n -COOH納米顆粒。圖3、基于鍍層磁學(xué)特性的檢測(cè)示意圖。圖3a、圖北顯示了經(jīng)過(guò)DNA-Pd NPs與不 同序列雜交及化學(xué)鍍后的微陣列，圖3c、圖3d分別顯示了利用巨磁阻效應(yīng)的檢測(cè)頭進(jìn)行信 號(hào)讀取，其中，圖3c處由于沒(méi)有鍍層，因此信號(hào)為零，圖3d因鍍層的存在，而給出響應(yīng)信號(hào)。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)上面技術(shù)路線作進(jìn)一步解釋，首先以檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑，利用共沉淀法制備了平均粒徑在IOnm左右的Pd納米顆粒。在進(jìn)行DNA標(biāo)記時(shí)，可以利用直接法或間接法兩 種途徑將其連接到納米Pd表面。前者指將先前制得納米Pd顆粒直接與巰基或氨基修飾的 DNA片段孵育而得到。后者指在連接DNA分子之前，先用兩步法，如圖2所示，將壓^⑴吐、 -COOH (其中，η在4-20之間)取代前面制備Pd顆粒的穩(wěn)定劑，然后再在EDC與NHS的作 用下，將氨基修飾的DNA，通過(guò)形成的希夫鍵(Schiff bond)連接到Pd納米顆粒表面，從而 完成目標(biāo)分子的納米Pd標(biāo)記。上述過(guò)程得到的Pd納米顆粒標(biāo)記生物分子在緩沖溶液中 將比直接法更為穩(wěn)定。完成納米鈀標(biāo)記后，通過(guò)生物分子之間的相互作用(如雜交過(guò)程)將 納米Pd顆粒標(biāo)記的目標(biāo)分子上連接到已知序列的生物芯片表面。在清洗掉非特異性吸附 在微陣列表面的目標(biāo)分子后，按照?qǐng)D1所示過(guò)程，將所得芯片浸人到含銅的化學(xué)鍍液中進(jìn) 行信號(hào)放大，數(shù)分鐘后取出芯片用水簡(jiǎn)單清洗，最終在連接目標(biāo)分子的Pd顆粒周圍沉積上 大量的銅顆粒。結(jié)果顯示，利用化學(xué)鍍非常好的區(qū)分了完全互補(bǔ)(銅顏色很深)、錯(cuò)配一個(gè) 堿基(銅顏色較淺)及錯(cuò)配兩個(gè)堿基(銅顏色較淺)的DNA序列，其靈敏度與Au標(biāo)銀染技術(shù) 相當(dāng)，能達(dá)到500fmol左右。需要說(shuō)明的是，上面所述中，納米Pd的制備是以檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑、乙醇為還原 劑在水溶液中制備。當(dāng)以PE(}2_-SH、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 或十二烷基酸鈉(SDS)等為穩(wěn)定劑，或以水合胼為還原劑時(shí)，所制得的納米Pd顆粒也同樣 適用于上面所提及的兩步法表面修飾過(guò)程，最終將其轉(zhuǎn)化為5-巰基十一烷酸修飾Pd納米 顆粒。此外，從修飾的生物分子類型看，不僅包含了氨基修飾DNA分子鏈，同時(shí)也可以擴(kuò)展 到蛋白質(zhì)分子，均可以利用希夫鍵將這些分子修飾到Pd顆粒表面。從化學(xué)鍍的過(guò)程看，納 米Pd不僅可以對(duì)Cu2+進(jìn)行催化沉積，同時(shí)還可以對(duì)Ni2+、Co2+等離子進(jìn)行沉積，從而實(shí)現(xiàn)檢 測(cè)信號(hào)放大。而當(dāng)以M2+、Co2+等離子為鍍液時(shí)，還可以根據(jù)所鍍層的磁學(xué)性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行定 量分析。圖3給出了以巨磁阻感應(yīng)傳感器為檢測(cè)磁頭的檢測(cè)示意圖，當(dāng)在沒(méi)有鍍層的位點(diǎn)， 其檢測(cè)信號(hào)為零，只有在完全正配的位點(diǎn)，才有檢測(cè)電流，從而提高了檢測(cè)靈敏度，便于進(jìn) 行高通量篩選。另外，從檢測(cè)技術(shù)角度看，上面所列舉的過(guò)程中是通過(guò)探針固定在玻璃基材 上所制的微陣列進(jìn)行檢測(cè)的，事實(shí)上該過(guò)程還適合單個(gè)生物傳感器、生物傳感芯片及生物 芯片等范圍。對(duì)于單個(gè)生物傳感器比如壓電石英晶體的生物傳感器，也可通過(guò)基于納米Pd 的催化沉積過(guò)程，進(jìn)行信號(hào)放大。實(shí)施例一以乙醇為還原劑、檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑制備納米Pd顆粒
以c (檸檬酸鈉)/ c (H2PdCl4) =10，c (H2PdCl4)=O. 5mM為例，先向IOOmL的圓底燒瓶 中加入15mL H2PdCl4溶液QmM)、0. 0882g檸檬酸鈉、2mL乙醇和43ml ddH20，機(jī)械攪拌加熱 回流池。溶液由棕黃色變成棕褐色，即得到檸檬酸鈉穩(wěn)定的Pd納米顆粒。接著，將所制顆 粒高速離心(12000rmin, 30min),除去上清液，再重新溶解于ddH20中，如此反復(fù)操作3次， 留著下一步使用。從表征結(jié)果可以看出，所得顆粒大小均一，呈圓形，平均粒徑在10 nm左 右ο實(shí)施例二 以乙醇為還原劑、PVP為穩(wěn)定劑制備納米Pd顆粒
將106. 4 mg PdCl2、6.0 mL濃度為0. 2 M的HCl水溶液加人到四4 mL 二蒸水中，超聲 30分鐘，配成2.0 mM &PdCl4溶液。取其中15 mL，并與35 mL水與乙醇的混合溶液(乙醇 的含量在10-70 vol %之間)及一定量的PVP (0. 333-133 mg之間)一起加入到100 mL的 圓底燒瓶中加熱回流池。反應(yīng)后，將所制顆粒高速離心(12000rmin，30min)，除去上清液，再重新溶解于ddH20中，如此反復(fù)操作3次，留著下一步使用。實(shí)施例三以PEG 2k-SH為穩(wěn)定劑、水合胼為還原劑制備納米Pd顆粒、
將0.500 g PdCl2、0. 33 g NaCl加人到250 mL 二蒸水中，超聲30分鐘，配成0. Oil M Na2PdClyK溶液。然后將0.55 mmol PEG 2k_SH溶于10 mL以上制備的Na2PdCl4水溶液中。 在劇烈攪拌下，向該混合溶液中逐滴加入10 mL含有0.22 mmol水合胼及0. 22 mmol氫氧 化鈉的水溶液。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液的顏色迅速變?yōu)楹谏?。滴加完后，反?yīng)在繼續(xù)攪拌30 分鐘。反應(yīng)后，將所制顆粒高速離心(12000rmin, 30min),除去上清液，再重新溶解于ddH20 中，如此反復(fù)操作3次，留著下一步使用。實(shí)施例四以CTAB為穩(wěn)定劑、乙醇為還原劑制備納米Pd顆粒
在30 ° C下，將4 g乙酰丙酮鈀、5 g CTAB溶解于200 mL體積比為5/1的甲苯/四 氫呋喃混合溶液中，并向其中加入25 mL無(wú)水乙醇。接著，在65 ° C下，將上面所得混合 溶液加熱回流12 h。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液的顏色逐漸轉(zhuǎn)為棕黑色。反應(yīng)結(jié)束后，攪拌下向 所得混合溶液中加入IOOmL無(wú)水乙醇，以促進(jìn)Pd納米顆粒從溶液中沉積出來(lái)。去掉上清液 后，將所得沉淀用乙醇溶液清洗三次，以便除去多余的穩(wěn)定劑及殘留的甲苯溶液。最后，用 水清洗兩次，從而將所制Pd納米顆粒轉(zhuǎn)移到水溶液中，配成lmg/ml的pd納米顆粒水溶液， 留著下一步使用。實(shí)施例五Pd納米顆粒的HS-DNA直接修飾
將2 mL實(shí)施例一至四所制備的Pd膠體溶液與1 OD巰基探針Pl(Pd-5’-HS-AGC TCT CAA ACT TTT _3’，其最終濃度大約在3. 51 μ M)混合，室溫下孵育16 h。加入3 ml磷酸 緩沖液(10 mM PB，0. 1 M NaCl，pH 7)，繼續(xù)孵育 48 h。然后在 14000rpm 下離心 25 min, 以分離未標(biāo)記的DNA。離心后除去上層清液，底層的黑色沉淀重新用5 ml磷酸緩沖液(10 mM PB，0.1 M NaCl, pH 7)稀釋，再次在HOOOrpm下離心25 min，除去上清液，下層黑色 沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液貯存于4°C備用。
實(shí)施例六利用兩步法對(duì)Pd納米顆粒表面進(jìn)行的HS-(CH2)n-COOH修飾 對(duì)部分前面所得Pd納米顆粒還可以利用兩步法(其過(guò)程如圖2所示)，對(duì)其表面進(jìn)行 HS- (CH2) η-COOH,以便進(jìn)一步提高所得Pd納米顆粒在緩沖溶液中的穩(wěn)定性及對(duì)生物分子的 非特異性吸附。第一步，將2 ml實(shí)施例一、實(shí)施例二與實(shí)施例四所制備的膠體Pd溶液與1 ml lmol/L的TA水溶液混合、超聲2分鐘，然后再室溫下孵育8 h。然后，在HOOOrpm下離心25 min,除去未交換到Pd表面的TA及交換下來(lái)的檸檬酸鈉穩(wěn)定劑(或其他穩(wěn)定劑)。重復(fù)以上 過(guò)程兩次，每次離心后除去上層清液，底層的黑色沉淀重新用5 ml水溶液稀釋分散。第二 步，將以上溶液分散在2 ml水中，并加入1 ml 0.5 mol/L的HS-(CH2) n-C00H水溶液混合， 孵育M小時(shí)。之后，在HOOOrpm下離心30 min,除去未交換到Pd表面的HS- (CH2) n_C00H及 交換下來(lái)的TA。緩沖沖液每次的DNA接著，加入3 ml磷酸緩沖液(10 mM PB，0. 1 M NaCl, PH 7)，重復(fù)以上過(guò)程兩次，每次離心后除去上層清液，底層的黑色沉淀重新用2 ml (10 mM PB，0.1 M NaCl, pH 7)緩沖溶液稀釋分散。最后，將下層黑色沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液貯存于 4°C備用。實(shí)施例七將 Pd-S-(CH2)5-COOH 納米顆粒與 KN-DNAOl2N AGC TCT CAA ACT TTT_3’ )直接修飾。 將以上實(shí)施例六所得ImlPd-S-(Cffi) 5-C00H溶液，在14000rpm下，離心30min，除 去上清液，然后將底層的黑色沉淀用MES緩沖液稀釋至1ml，加入0. 4mg EDC(約2mM)和 0. 6mg NHS室溫反應(yīng)15分鐘。然后，將1 OD的H2N AGC TCT CAA ACT TTT -3，溶液加入 上述溶液中，繼續(xù)孵育Mh。反應(yīng)后，將以上混合溶液在14000rpm下離心30min。去除上清 液后，將下層黑色沉淀加入Iml 2XPBS液(10 mM PB，0.3 M NaCl, pH 7)，母液貯存于4°C實(shí)施例八DNA微陣列的制備及與Pd納米顆粒修飾目標(biāo)DNA之間的雜交
利用點(diǎn)樣儀將以下四條16個(gè)堿基的寡核苷酸探針(又上海生工合成)點(diǎn)在事先經(jīng)過(guò)醛 基化修飾的玻璃載片表面，并進(jìn)行孵育固定。5，-AGC TCT CAA ACT TTT C _3， 正配
5，-AGC TCT CAC ACT TTT C -3， 錯(cuò)配 1 個(gè)堿基 5，-AGC TCT CCC ACT TTT C -3， 錯(cuò)配 2 個(gè)堿基 5，-AGC TCT GCC ACT TTT C -3， 錯(cuò)配 3 個(gè)堿基
然后與實(shí)施例五或?qū)嵤├叩玫降腜d-5’-HN AGC TCT CAA ACT TTT _3’進(jìn)行雜交，雜 交液為MicroHyb，雜交條件與熒光法相同。雜交后，分別用2XSSC/0. 1%SDS和0. IXSSC/ 0. P/oSDS溶液各清洗10 min,除去非特異性吸附在玻璃片上的Pd納米顆粒。實(shí)施例九將雜交后的微陣列進(jìn)行銅化學(xué)鍍
將實(shí)施例八所得雜交后的片基浸入銅染鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液成分 由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液3g CuSO4,4g NaOHU4g 酒石酸鈉鉀、IOOml水，B溶液37. 的福爾馬林溶液?；瘜W(xué)鍍前，直接將以上A、B兩種溶液 混合，然后將以上獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)。室溫下反應(yīng)10 min，水洗吹干。結(jié)果顯示，利 用化學(xué)鍍非常好的區(qū)分了完全互補(bǔ)(銅顏色很深)、錯(cuò)配一個(gè)堿基(銅顏色較淺)及錯(cuò)配兩 個(gè)堿基(銅顏色較淺)的DNA序列。其靈敏度與Au標(biāo)銀染技術(shù)相當(dāng)，能達(dá)到500fmol左右。實(shí)施例十將雜交后的微陣列進(jìn)行鎳化學(xué)鍍
將實(shí)施例八所得雜交后的片基浸入鎳染鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液成 分由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液為還原液，胺基硼烷 (DMAB )0. 39/ L0另外，還原劑還可以為NaBH4 ,KBH4等堿金屬硼氫化物、三甲胺基硼烷、 三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及胼等，以DMAB為佳。B溶液中為NiSO4 (以Ni2 +計(jì)Vg^L “1 4 7、NaH2PO2 · H2O/ g · L - 1 20 40 蘋果酸 / g · L - 1 10 30 琥珀酸 / g · L- 1 5 15。化學(xué)鍍前，直接將以上A、B兩種溶液混合，并將其pH值調(diào)至4 5。然后將以上 獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)，70 93°C下反應(yīng)10 min，水洗吹干。實(shí)施例十一將雜交后的微陣列進(jìn)行鎳、鈷合金化學(xué)鍍
將實(shí)施例八所得雜交后的片基浸入鎳、鈷混合鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液 成分由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液為還原液，胺基硼 烷(DMAB )0. 39/ L0另外，還原劑還可以為NaBH4 ,KBH4等堿金屬硼氫化物、三甲胺基硼 烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及胼等，以DMAB為佳。B溶液中為NiSO4 30 g/L、CoS04 8-14 g/L、NaH2 PO2 20 g/L、C6H5O7Na3 64 g/L、絡(luò)合劑 0. 020 g/L、穩(wěn)定劑 0· 003 g/L、表面活性 劑0. 5 g/L?；瘜W(xué)鍍前，直接將以上A、B兩種溶液混合，并將其pH值調(diào)至8 8.5。然后
8將以上獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)，30 40°C下反應(yīng)10 min，水洗吹干。實(shí)施例十二 鑒于鍍層的磁性特性進(jìn)行的信號(hào)檢測(cè)
當(dāng)以Co、Ni或其混合物為化學(xué)鍍物質(zhì)時(shí)，由于所形成的鍍層不僅具有類似前面Cu鍍 層所表現(xiàn)出的顏色變化，同時(shí)他們自身還具有磁性特性，而這些特性可以通過(guò)不同的生物 磁場(chǎng)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行信號(hào)讀取，如自旋閥傳感器(Spin Valves)、巨磁阻感應(yīng)傳感器(GMR Sensors )、超導(dǎo)量子干涉儀(SQUIDs)、各向異性磁阻(AMR)環(huán)式傳感器、小規(guī)模的霍 耳組合傳感器(Hall Crosses)以及隧道結(jié)(TMR)傳感器等。下面以巨磁阻感應(yīng)傳感器為例說(shuō)明其應(yīng)用(其原理過(guò)程請(qǐng)見(jiàn)圖3)。當(dāng)實(shí)施例十 和實(shí)施例十一將雜交后的微陣列進(jìn)行化學(xué)鍍后，先用去離子水清洗芯片3遍，除去游離的 Ni2+、Co2+離子及其他鍍液成分，然后再用PBS緩沖溶液清洗2遍，最后再用雙蒸水清洗一 次。在用氬氣將芯片吹過(guò)后，置于真空干燥箱里過(guò)夜。接著，將芯片置于實(shí)驗(yàn)室自制的GMR 傳感器裝置中進(jìn)行信號(hào)讀取。其中，GMR讀取頭由spin valve構(gòu)成，靈敏度為1.3 mV/V*0e， 線性范圍士200e。參照文獻(xiàn)，采用惠斯通電橋可以把電阻信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷盒盘?hào)輸出。由于 對(duì)沿表面的磁場(chǎng)分量非常敏感。當(dāng)外加磁場(chǎng)傾斜時(shí)，GMR傳感器的基準(zhǔn)信號(hào)會(huì)發(fā)生變化，產(chǎn) 生的有效GMR信號(hào)也會(huì)發(fā)生變化。把傳感器表面的平均磁場(chǎng)和傳感器靈敏度直接相乘，就 得到GMR傳感器的電阻信號(hào)變化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，上述信號(hào)的變化能非常好的反映微陣列中 DNA序列的變化，當(dāng)序列完全配對(duì)時(shí)與錯(cuò)配一個(gè)時(shí)電信號(hào)，可以產(chǎn)生約20 μ V的電信號(hào)差 別。這與前面的灰度測(cè)試結(jié)果相吻合，充分的說(shuō)明該路線的可行性。
權(quán)利要求
1.一種基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特征是利用納米鈀顆 粒對(duì)生物分子進(jìn)行標(biāo)記，并結(jié)合納米鈀的催化性能，利用化學(xué)鍍進(jìn)行信號(hào)放大，最終借助化 學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的光學(xué)、磁性特性進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特 征是所述的納米鈀顆粒，其粒徑在O-IOOnm之間，以乙醇或水合胼為還原劑，以檸檬酸鈉、 PVP, PEG-SH、CTAB或SDS為穩(wěn)定劑還原得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特征 是所述的生物分子包含DNA片段、蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其 特征是所述納米鈀表面修飾生物分子，在標(biāo)記之前，利用二步法，將HS-(CH2)n-COOH或 H2N-(CH2)n-COOH取代穩(wěn)定劑分子連接到鈀顆粒表面；所謂兩步法是指第一步先將納米鈀顆 粒表面的穩(wěn)定劑被TA取代，然后利用第二步，再將納米鈀顆粒表面的TA部分被HS-(CH2) n-C00H取代；其中，η在4-20之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特征 是所述鈀納米顆粒與生物分子直接孵育制得納米鈀顆粒標(biāo)記生物分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特 征是將所述HS-(CH2)n-COOH修飾鈀納米顆粒與生物分子孵育制得納米鈀顆粒標(biāo)記生物分 子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特征 是所述利用化學(xué)鍍進(jìn)行信號(hào)放大是在納米鈀顆粒標(biāo)記的生物分子與探針?lè)肿影l(fā)生生物作 用之后，利用化學(xué)鍍過(guò)程，借助鈀的催化作用，在納米鈀顆粒周圍進(jìn)一步沉積上金屬顆粒進(jìn) 行信號(hào)放大。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其 特征是所述化學(xué)鍍過(guò)程指在不通電的情況下，利用氧化還原反應(yīng)在納米鈀周圍獲得一層 金屬單質(zhì)或合金；其中，涉及的金屬包括鎳、銅、鋅、鈷、銀、金、鐵或它們間組合成的合金。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特征 是所述的檢測(cè)是基于上述化學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的光學(xué)、磁性及其它特性；光學(xué)指沉積后的 顏色變化，能依據(jù)肉眼進(jìn)行判斷，活用灰度掃描儀進(jìn)行；磁性指鍍層所表現(xiàn)出的磁學(xué)特性， 借助巨磁阻效應(yīng)和超導(dǎo)量子干涉儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；其他特性包括將以上鍍層溶解后，再借 助電化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)溶解后的金屬離子濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，其特 征是該檢測(cè)過(guò)程適用于生物芯片檢測(cè)、進(jìn)行高通量的篩選、用于單個(gè)生物傳感器或進(jìn)行單 個(gè)生物分子的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提出一種基于納米鈀標(biāo)記及其催化沉積放大的生物檢測(cè)方法，并結(jié)合納米Pd的催化性能，利用化學(xué)鍍進(jìn)行信號(hào)放大，最終借助化學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的性能如光學(xué)、磁性等特性進(jìn)行檢測(cè)的一種生物分子檢測(cè)方法。該路線中，首先合成了粒徑在1-100nm左右的Pd顆粒，然后借助表面化學(xué)技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行修飾，使其能穩(wěn)定存在于緩沖溶液中，并將所需標(biāo)記生物分子連接到Pd顆粒表面，從而完成生物分子的納米Pd標(biāo)記。接著，在完成生物分子相互作用后，利用Pd的催化特性，通過(guò)化學(xué)鍍過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)信號(hào)放大。最后，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的手段是基于上述化學(xué)鍍后所表現(xiàn)出的性能如光學(xué)、磁性及其它特性。該路徑對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較低，大大的拓寬了上述檢測(cè)路線在未來(lái)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102147358SQ20111002392
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 沈彬, 王志飛, 顏士飛 申請(qǐng)人:東南大學(xué)