人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)樣干細(xì)胞、方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生和擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)樣干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的方法。至少部分程度上通過表達(dá)低水平的IL-6對(duì)這些hES-MSCs進(jìn)行鑒定。這些細(xì)胞可用于預(yù)防和治療T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病，尤其是多發(fā)性硬化癥，以及用于將藥劑遞送通過血腦屏障和血脊髓屏障。還提供選擇臨床級(jí)別hES-MSC的方法以及修飾MSC以產(chǎn)生具有獨(dú)特生物標(biāo)記特性的MSC的方法。修飾的MSC可用于治療各種疾病。
【專利說明】人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)樣干細(xì)胞、方法及其應(yīng)用
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年7月12日提交的美國專利申請(qǐng)61/670, 787的優(yōu)先權(quán)和2013 年2月11日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)61/762, 961的優(yōu)先權(quán)。在此以其整體引入作為參考。
[0003] L 簡(jiǎn)介
[0004] 本發(fā)明涉及一種從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法使用多步法培 養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，包括以下：在足以形成胚狀體的條件下培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞；在擴(kuò)增血管瘤集 落形成細(xì)胞的條件下培養(yǎng)胚狀體，其中所用培養(yǎng)基包含所述胚狀體；在誘導(dǎo)血管瘤集落形 成細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的條件下培養(yǎng)血管瘤集落形成細(xì)胞。本發(fā)明還公開了人胚胎干 細(xì)胞衍生的、具有高度免疫抑制能力的間充質(zhì)樣干細(xì)胞的鑒定方法。本發(fā)明還涉及人胚胎 干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（hES-MSCs);包含所述人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的 溶液和藥物制劑；使用所述人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞治療和預(yù)防疾病的方法，具 體的疾病是T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病，最具體的疾病是多發(fā)性硬化癥；使用所述人胚 胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞穿過血腦屏障和血脊髓屏障以遞送藥物的方法。這里還提供 了使用hES-MSCs調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制針對(duì)自體抗原的免疫應(yīng)答和修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的方法。這里提供了包含hES-MSCs的組合物，所述hES-MSCs應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)；這里提供 了修飾MSC的方法，該方法通過改變基因表達(dá)而提高M(jìn)SC的免疫抑制能力。這里還提供了 使用hES-MSCs作為藥物和/基因遞送系統(tǒng)的方法。
[0005] 2.背景
[0006] 多發(fā)性硬化癥（MS)是一種慢性的自身免疫性疾病，該疾病由外周免疫細(xì)胞通過 損傷的血腦屏障（BBB)或血脊髓屏障（BSCB)滲透入中樞神經(jīng)系統(tǒng)所引起。外周免疫細(xì)胞 滲透入中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)引起神經(jīng)軸突周圍的髓鞘發(fā)生炎癥并且導(dǎo)致脫髓鞘以及軸突形成 斑痕（McFarland和Martin (2007))。多發(fā)性硬化癥會(huì)出現(xiàn)幾乎所有的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這些 癥狀包括身體障礙和認(rèn)知障礙。該疾病在全球的發(fā)病率大約〇. 1%，并且常見于青少年（最 常見的是女性）（Benit〇-Le〇n(2011))。根據(jù)美國國家多發(fā)性硬化癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，美國食品和 藥物管理局批準(zhǔn)的用于治療多發(fā)性硬化癥的藥物超過70多種，包括阿沃納斯（IFNf3 -Ia)、 倍泰龍（IFNIB-Ib)、Gilenya(-種鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑）、醋酸格拉替雷（或共聚物 1)和那他珠單抗（人源化抗整合蛋白-α抗體）。然而，這些藥物僅能暫時(shí)緩解病癥并且伴 隨著嚴(yán)重的副作用，包括感染增加、心臟病發(fā)作、中風(fēng)、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、心律失常、 疼痛、抑郁癥、疲勞、黃斑水腫和勃起功能障礙（Johnston和So (2012) ;Weber等（2012))。
[0007] 由于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)具有免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)再生作用（Auletta等，（2012); Pittenger等，（1999))，以及修復(fù)血腦屏障的潛在能力（Chao等（2009) ;Menge等（2012))， 使得移植MSCs已經(jīng)成為一種潛在的、有吸引力的療法。多能性的MSCs可以分化為多種細(xì) 胞系，包括脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞?？梢詮呐咛?、新生兒以及成體組織如羊膜、臍 帶和脂肪中獲得MSCs。與目前的藥物療法相比，MSCs具有多個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如，這些細(xì) 胞可以用作多個(gè)并且可能協(xié)同作用的治療因子的載體，可以迀移到受損組織，通過分泌調(diào) 節(jié)物質(zhì)和細(xì)胞 -細(xì)胞接觸以發(fā)揮局部作用（Uccelli and Prockop (2010a))。重要地，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)MSCs能有效地治療小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)，這是一種公認(rèn)的MS動(dòng)物 模型（Gordo 等（2008a) ;Gordon 等（2010) ;Morando 等（2012) ;Peron 等（2012) ;Zappia 等（2005) ;Zhang等（2005))，并且對(duì)臨床試驗(yàn)的MS患者也有療效（Connick等（2012); Karussis 等（2010) ;Mohyeddin Bonab 等（2007) ;Yamout 等（2010))。外源性不是問題，因 為小鼠和人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC)可以減緩EAE小鼠的疾病惡化（Gordon等 (2008a) ;Gordon 等（2010) ;Morando 等（2012) ;Peron 等（2012) ;Zappia 等（2005) ;Zhang 等（2005))〇
[0008] 然而，把這些在小鼠中的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移至人時(shí)存在著一些缺陷。第一，骨髓（或其他 成體組織）來源有限并且不同捐獻(xiàn)者的骨髓質(zhì)量不一，限制了 MSCs的研宄和應(yīng)用，以及阻 礙MSCs作為醫(yī)藥產(chǎn)品大規(guī)模臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)化。第二，這些成體組織來源的MSCs是一群 高度混雜的細(xì)胞，也許只有一部分細(xì)胞具有免疫抑制能力。為了獲得足夠多臨床級(jí)別的 MSCs，需要在體外擴(kuò)增這些細(xì)胞，這可能會(huì)降低它們的免疫抑制能力和歸巢能力（Javazon 等（2004))。第三，需要考慮BM-MSCs可能會(huì)惡性轉(zhuǎn)化的安全性（Wong (2011))和傳播捐獻(xiàn) 者病原體的可能性。最后，BM-MSC治療小鼠 EAE模型在不同的報(bào)道中療效不一（Gordo等 (2008a) ;Payne 等（2012) ;Zappia 等（2005) ;Zhang 等（2005))，進(jìn)而引發(fā)對(duì) BM-MSC 治療 MS功效的懷疑。
[0009] 因此，需要開發(fā)新的療法來治療多發(fā)性硬化癥和其它自身免疫性疾病。還需要無 限量、實(shí)全、穩(wěn)定性高和來源一致的MSCs來治療和預(yù)防這些疾病和其他疾病。
[0010] 有報(bào)道指出，人胚胎干細(xì)胞（hESC)可以分化為胚狀體（EB)，然后分化為具有成血 管細(xì)胞（HB)活性的細(xì)胞池，即這些細(xì)胞可進(jìn)一步分化為血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血 細(xì)胞（Chyou等（2008) ;Lu等（2007) ;Lu等（2009))。因此可推斷，在這些包含HB的細(xì)胞 中，有一部分能分化為MSCs，這將避免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所引起的問題。這些人胚胎干細(xì)胞 衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞是不限量的、安全的并且來源一致的，可以用于治療和預(yù)防多發(fā)性硬 化癥。本文還揭示了通過微陣列分析和其它分析鑒定出多個(gè)重要因子在hES-MSC和BM-MSC 間差異表達(dá)。
[0011] 3.發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明基于一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即是在胚胎干細(xì)胞衍生的包含HB的細(xì)胞中，一 部分細(xì)胞也可以高效地分化為MSC，并且這些細(xì)胞高度一致，該細(xì)胞命名為"hES-MSC"。使 用本發(fā)明的方法可從多個(gè)hESC系制備hES-MSC，它們?cè)隗w外全都顯著地抑制T細(xì)胞的增殖 和分化并且在體內(nèi)減少EAE小鼠的疾病評(píng)分，伴隨著減少脫髓鞘、減少T細(xì)胞浸潤和中樞神 經(jīng)系統(tǒng)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。相反地，盡管多個(gè)來源的BM-MSC在體外能下調(diào)T細(xì)胞的增 殖和分化，但是它們對(duì)EAE小鼠的治療根本沒有作用。
[0013] 因此，本發(fā)明提供了一種從人胚胎干細(xì)胞在體外產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)的方 法，克服了上述問題。由本文公開的新方法產(chǎn)生hES-MSC的能力允許生產(chǎn)這些細(xì)胞，這些細(xì) 胞可用于各種治療應(yīng)用，包括多發(fā)性硬化癥和其它自身免疫性疾病的治療和預(yù)防。另外，由 本文所述方法生產(chǎn)的hES-MSC具有穿過血-腦屏障（BBB)和血-脊髓屏障的能力，進(jìn)而允 許它們用于各種治療應(yīng)用，包括藥物遞送。本發(fā)明所述的方法提供進(jìn)一步的效用，因?yàn)樗鼈?能夠大量產(chǎn)生在商業(yè)范圍內(nèi)可使用的hES-MSC。
[0014] 另外，本發(fā)明包括通過這種方法生產(chǎn)的人胚胎來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種在體外產(chǎn)生和擴(kuò)增人胚胎來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的 方法，所述方法包括以下步驟：
[0016] a.在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含人胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基含有至少一 種生長因子，并且該生長因子的含量足以誘導(dǎo)所述胚胎干細(xì)胞分化為胚狀體；
[0017] b.將胚狀體分散成單細(xì)胞，在包含所述來自胚狀體的單細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加至少 一種生長因子，并繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，所述生長因子在所述人血管瘤集落培 養(yǎng)物中存在的量足以擴(kuò)增人血管瘤集落形成細(xì)胞；
[0018] c.將該人血管瘤集落形成細(xì)胞分散成單細(xì)胞；
[0019] d.在有血清或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單細(xì)胞，該培養(yǎng)基的量足以誘導(dǎo)所述血管瘤 集落形成單細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0020] 在某些實(shí)施方式中，所得的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞至少約90%、91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%表達(dá)0)73。
[0021] 在某些實(shí)施方式中，所得的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞至少約95%表達(dá)⑶73。在某些 實(shí)施方式中，所得的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞超過95 %表達(dá)⑶73。
[0022] 在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基含有生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、骨形態(tài) 發(fā)生蛋白（BMP)、干細(xì)胞因子（SCF)、Flt-3L(FL)、促血小板生成素（TPO)、促紅細(xì)胞生成素 (EPO) 〇
[0023] 在某些實(shí)施方式中，含血清培養(yǎng)基包含有胎牛血清、L-谷酰胺。無血清培養(yǎng)基包 含敲除血清替代品（knockout serum replacement，K0SR)或牛血清白蛋白（BSA)0
[0024] 在某些實(shí)施方式中，有一個(gè)額外的步驟，該步驟使用從Igy至200gy的γ射線輻 射獲得的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0025] 在某些實(shí)施方式中，所述用于產(chǎn)生和擴(kuò)增人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可以獲得 至少10000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少50000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少100000個(gè) 人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少500000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X IO6個(gè)人胚胎-間 充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X IO6個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X 10 7個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、 至少5 X IO7個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少IX 10 8個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X 10 8 個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少IX IO9個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X 10 9人胚胎-間 充質(zhì)干細(xì)胞或至少IX 101°個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞。這些方法可以獲得10000至100億 個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97 %、98 %或99 %人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)一種或更多種hES-MSC差異標(biāo)記。在某 些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記是⑶73、⑶90和⑶105。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述hES-MSCs顯著性地降低EAE小鼠的疾病評(píng)分，同時(shí)伴隨 著減少脫髓鞘、T細(xì)胞滲入和小神經(jīng)膠質(zhì)的反應(yīng)。另外，在體內(nèi)和體外與骨髓來源間充質(zhì) 干細(xì)胞（BM-MSC)相比較，hES-MSCs具有更強(qiáng)的免疫抑制活性。本文還提供了在hES-MSC 和BM-MSCs之間差異表達(dá)的重要蛋白/分子。本文提供了鑒定免疫抑制活性得到改善的 hES-MSCs的方法，所述方法通過檢測(cè)所述蛋白/分子標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行。本文還公開了基因 修飾的方法，通過這種基因修飾改善hES-MSCs的免疫抑制活性。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種包含人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞的溶液，該溶液包含 至少10000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少50000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少100000個(gè) 人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少500000個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X IO6個(gè)人胚胎-間 充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X IO6個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X 10 7個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、 至少5 X IO7個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少IX 10 8個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X 10 8 個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少IX IO9個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少5 X 109個(gè)人胚胎-間 充質(zhì)干細(xì)胞或者至少IX 101°個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0028] 在某些實(shí)施方式中，2ml體積的培養(yǎng)物中包含至少10000個(gè)細(xì)胞，IOml體積的培養(yǎng) 物中包含至少100000個(gè)細(xì)胞，IOOml體積的培養(yǎng)物中包含至少1000000個(gè)細(xì)胞，IOOOml體 積的培養(yǎng)物中包含至少10000000個(gè)細(xì)胞，以及4000ml培養(yǎng)基中達(dá)到5X IO8個(gè)細(xì)胞。
[0029] 可以將這些溶液注射入受試者。可以凍存這些溶液。可以把這些溶液用于制造成 藥劑，以應(yīng)用于施用人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞可以治療的疾病。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)可適合注射入病人體內(nèi)的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞溶液 的方法，所述方法包括以下步驟：利用前面段落描述的方法分離細(xì)胞溶液，然后將細(xì)胞接種 至可適合注射患者的液體中。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)適合凍存人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞溶 液的方法，該方法包含以下步驟：利用前面段落所描述的方法分離細(xì)胞，然后將細(xì)胞置于可 適合凍存的溶液中。
[0031] 還有，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞，其表達(dá)一種或者多種 細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白或其組合，所述標(biāo)記蛋白包括⑶73、⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶44、 CD146和CD166。在另一個(gè)實(shí)施方式中，人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或者低水平表達(dá)的一 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞標(biāo)記蛋白或其組合，所述標(biāo)記包括⑶34、⑶31、⑶45。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或者低水平表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)促炎癥蛋白或其組合，所述促 炎癥蛋白包括 MMP2、RAGE、IFNy Rl、IFNy R2、IL-12、TNFa、IL-6 和 VCAMl。在某些實(shí)施方 式中，上述標(biāo)記在人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平至少是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一半。
[0032] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種包含人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中 人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞標(biāo)記蛋白，包括⑶73、⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、 ⑶54、⑶144、⑶146和⑶44。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)物中的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞 不表達(dá)或者低水平表達(dá)一種或者多種細(xì)胞標(biāo)記蛋白，包括⑶34、⑶31和⑶45。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)物中的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或者低水平表達(dá)一種或者多種促 炎癥蛋白，包括 MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、IL-6 和 VCAMl。
[0033] 在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含至少IX IO6個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、 至少I X IO7個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X 10 8個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少I X 10 9 個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞、至少IX IOltl個(gè)人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞。對(duì)于IX 10 6個(gè)細(xì)胞，初 始細(xì)胞培養(yǎng)物的體積是10-20ml。
[0034] 在另一些實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，至少約90%的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì) 胞表達(dá) CD73 蛋白，至少多于 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的人 胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)⑶73蛋白。
[0035] 在另一些實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，至少約75%、80%、85%、90%、95%、 99 %的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)至少一種選自⑶90、⑶105、⑶44和⑶29的細(xì)胞標(biāo)記蛋 白。
[0036] 在另一些實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，至少約80%、85%、90%、95%、99% 的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或低水平表達(dá)至少一種細(xì)胞標(biāo)記，包括⑶34、⑶31和⑶45。
[0037] 在另一些實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中，至少約75%、80%、85%、90%、95%、 99 %的人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)或低水平表達(dá)至少一種促炎癥蛋白，包括：MMP2、 RAGE、IFNy RU IFNy R2、IL-12、TNFa、IL-6 和 VCAMl。在某些實(shí)施方式中，所述 hES-MSC 表達(dá)高水平的⑶24、TGF β 2或其組合。
[0038] 在某些實(shí)施方式中，所述hES-MSC或前面的段落所述的細(xì)胞培養(yǎng)物被γ射線輻 射。
[0039] 本文提供了藥物制劑，包括前面的段落所述的hES-MSC或細(xì)胞培養(yǎng)物中任意之一 和藥學(xué)上可接受的載體劑。
[0040] 本文提供了所述hES-MSC或前面的段落所述細(xì)胞培養(yǎng)物的冷凍保存的制品。
[0041] 本文為有需要其的受試者提供了治療和預(yù)防T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病的方 法，該方法包括以下步驟：向有需要其的受試者施用治療有效量的包括前面段落中所描述 hES-MSC溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑。所述T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病包括但不限于克 羅恩病、炎癥性腸病、移植物抗宿主疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，還有T細(xì)胞介 導(dǎo)的延遲型超敏反應(yīng)（屬于第四型過敏反應(yīng)），如1型糖尿病、MS、RA、橋本甲狀腺炎、克羅 恩病、接觸性皮炎和硬皮病等。
[0042] 在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的受試者為哺乳動(dòng)物或者鳥類，最為優(yōu)選的是人類。在某 些實(shí)施方式中，所述溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物和藥物制劑包括已被輻射或未經(jīng)輻射的hES-MSC。
[0043] 在某些實(shí)施方式中，所述用于治療和預(yù)防疾病的方法包括與一種或多種用于治療 和預(yù)防的藥物聯(lián)合使用的療法。
[0044] 在某些實(shí)施方式中，所述治療和預(yù)防需要其的受試者的多發(fā)性硬化癥的方法包 括以下步驟：向有需要其受試者給予治療有效量的包括前面段落描述的包含hES-MSC的 溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑，所述多發(fā)性硬化癥可以是復(fù)發(fā)/維持型多發(fā)性硬化癥、進(jìn) 展/復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性多發(fā)性硬化癥或繼發(fā)性多發(fā)性硬化癥。受試者優(yōu)選哺乳 動(dòng)物，并且最優(yōu)選為人。所述溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或者藥物制劑可包括經(jīng)輻射或未經(jīng)輻射的 hES-MSC〇
[0045] 所述方法進(jìn)一步包括給予受試者其它治療藥劑，該藥物包括但不限于芬戈莫德、 促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH)、甲潑尼龍、地塞米松、IFNf3-la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、環(huán)磷酰胺、 甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺胺吡啶。還有，在另外一個(gè)實(shí) 施方式中，為了將治療藥劑遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一種或多種治療藥劑可以連接至hES-MSC 以便穿過血腦屏障和/或血脊髓屏障。
[0046] 本文提供一種穿過血腦屏障和/或血脊髓屏障遞送藥劑的方法，該方法包括以下 步驟：將藥劑連接或綴合至hES-MSC，然后向有需要其受試者施用hES-MSC和藥劑連接的復(fù) 合物，其中，所述hES-MSC能夠透過血腦屏障和/或血脊髓屏障，所述藥劑能夠治療、預(yù)防或 診斷有需要其受試者的疾病或損傷。所述hES-MSC可以是單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、溶液或藥 物制劑的形式。所述藥劑可以包括但不限于藥物、蛋白質(zhì)、DNA、RNA和小分子物質(zhì)。
[0047] 本文提供一種選擇用于治療自身免疫性疾病的臨床級(jí)別hES-MSC的方法，所述 hES-MSC具有以下特征：（i)含有>95%的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)含有>80%的細(xì)胞表達(dá) 組-2標(biāo)記；（iii)含有〈5 %的細(xì)胞表達(dá)組-3標(biāo)記；（iv)表達(dá)IL-10和TGF β ; (V)含有〈2 % 的細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-12和TNFa ; (Vi)含有〈0.001%的細(xì)胞共表達(dá)所有組-4標(biāo)記。其中 組-1 標(biāo)記是：CD73、CD90、CD105、CD146、CD166 和 CD44。組-2 標(biāo)記是：CD13、CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標(biāo)記是：CD45、CD34、CD31 和 SSEA4。組-4 標(biāo)記是：0CT4、NAN0G、TRA-l-60 和 SSEA4〇
[0048] 本文提供一種修飾間充質(zhì)干細(xì)胞以生產(chǎn)修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的方法，所述修 飾的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有以下特征：（i)含有>95%的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)含有 >80 %的細(xì)胞表達(dá)組-2標(biāo)記；（iii)含有〈5 %的細(xì)胞表達(dá)組-3標(biāo)記；（iv)表達(dá)IL-10和 TGF β ; (V)含有〈2 %的細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL_12和TNFa ; (Vi)含有少于0.001 %的細(xì)胞共表 達(dá)所有組-4標(biāo)記。其中組-1標(biāo)記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44。組-2標(biāo) 記是 CD13、CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標(biāo)記是 CD45、CD34、CD31 和 SSEA4。組-4 標(biāo)記是： 0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
[0049] 本文提供了條件培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基濃縮液、細(xì)胞裂解物或其衍生品，包括所述 MSC分泌的一種或多種生物分子。本文提供了一種利用本文所述MSC作為飼養(yǎng)細(xì)胞以擴(kuò)增 骨髓造血干細(xì)胞和臍帶造血干細(xì)胞的方法。在某些實(shí)施方式中，所述適合于本公開方法的 MSC表達(dá)Str〇3。在某些實(shí)施方式中，MSC與骨髓造血干細(xì)胞和/或臍帶造血干細(xì)胞共培養(yǎng)。 在某些實(shí)施方式中，所述MSC是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。本文提供了一種由本文所述MSC和骨髓 造血干細(xì)胞組成的共培養(yǎng)物。本文提供了一種由本文所述MSC和臍帶造血干細(xì)胞組成的共 培養(yǎng)物。
[0050] 本文還公開了包含本文所述MSC的試劑盒。在某些實(shí)施方式中，所述試劑包含 hES-MSC和細(xì)胞遞送載體。
[0051] 4.附圖簡(jiǎn)述
[0052] 為了說明本發(fā)明，在附圖中描繪了本發(fā)明的一些特定實(shí)施方式。然而，應(yīng)該理解本 發(fā)明并不局限于附圖中所描繪的具體布置和手段。
[0053] 圖IA-D是hESC(CT2)經(jīng)多步驟分化為MSCs的相差圖像。（hESC :人胚胎干細(xì)胞； EB :胚狀體；HB-富集的：成血管細(xì)胞-富集的；hES-MSC :人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì) 胞）
[0054] 圖2A-C描繪了細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，該細(xì)胞來源于第9天成血管 細(xì)胞富集的培養(yǎng)物。
[0055] 圖3A-I描繪了細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，該細(xì)胞來源于第14天的成 血管細(xì)胞富集的培養(yǎng)物。
[0056] 圖4顯示了第10代hES-MSC的核型分析，其中hES-MSC是由H9-hESC細(xì)胞系衍生 的。
[0057] 圖5A-C顯示了 EAE模型小鼠的疾病評(píng)分，該小鼠在臨床疾病發(fā)作前給予hES-MSCs 處理。在EAE誘導(dǎo)免疫后6天，IOhES-MSC或未分化的hESC或鹽水對(duì)照（PBS)經(jīng)腹腔注射 到小鼠。圖A顯示用hES-MSC注射的小鼠（CT2)，圖B顯示用hES-MSC注射的小鼠（MA09)， 圖C顯示用hES-MSC注射的小鼠（H9)。N = 5小鼠/組。**P〈0. 01。
[0058] 圖6A-F是小鼠在免疫后第28-32天的累積疾病評(píng)分（圖A-C)和最大疾病評(píng)分 (圖D-F)的柱狀圖，小鼠免疫如圖5所示。N=每組5只小鼠。**P〈0. 01。
[0059] 圖7是EAE模型小鼠的疾病評(píng)分圖，該小鼠在臨床疾病發(fā)作后給予hES-MSCs或鹽 水對(duì)照（PBS)處理。在小鼠免疫18天后，I X IO6個(gè)hES-MSC腹腔注射入小鼠。N=每組6 只小鼠。
[0060] 圖8A-B是EAE模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（CD25+FOXP3+)的流式細(xì)胞 術(shù)分析結(jié)果，該小鼠在免疫15天后用鹽水對(duì)照（PBS)或hESC細(xì)胞系CT2衍生的hES-MSCs 處理。
[0061] 圖9A-F是描繪EAE模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的⑶4+細(xì)胞、⑶8 +細(xì)胞、Thl⑶4 +T細(xì)胞 和Thl7CD4+T細(xì)胞的總數(shù)量圖（圖A-D)，該小鼠在免疫15天后用鹽水對(duì)照、hESC或hES-MSC 處理。圖E-F顯示經(jīng)PBS或hES-MSC處理EAE小鼠的⑶4+T細(xì)胞的IL-17和IFN- γ的表 達(dá)。N=每組 4 只小鼠。*Ρ〈0·05，#Ρ〈(λ01。
[0062] 圖10A-D顯示經(jīng)hES-MSC (圖a和c)或鹽水（PBS)(圖b和d)處理的EAE模型小 鼠的腰脊髓橫截面免疫組化檢測(cè)結(jié)果，其中髓鞘堿性蛋白（MBP ;紅色），⑶3 (綠色）標(biāo)記T 細(xì)胞，IBAl (綠色）標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0063] 圖11是脊髓的髓鞘堿性蛋白（MBP)的定量分析結(jié)果，該結(jié)果是采用相對(duì)熒光強(qiáng)度 (RFI)測(cè)量數(shù)字捕獲脊髓半切術(shù)的MBP表達(dá)進(jìn)行的。
[0064] 圖12A-C顯示了 EAE模型小鼠的疾病評(píng)分，該小鼠在臨床疾病發(fā)作前用鹽水 (PBS)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC)或hES-MSC處理。圖A顯示經(jīng)PBS、hES-MSCs(MA09)或 三種不同來源之一的BM-MSCs處理的5組小鼠。圖B顯示在臨床疾病發(fā)作前，經(jīng)PBS、BM-MSC 或hES-MSC (CT2)處理的小鼠。圖C顯示經(jīng)PBS、BM-MSC或hES-MSC (MA09)處理的小鼠。對(duì) 于所有試驗(yàn)，N = 5只小鼠每組，在hES-MSC和三種BM-MSC處理的小鼠之間，*#P〈0. 001。
[0065] 圖13A-D顯示了 EAE模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的CD4+、CD8+、Thl或Thl7T細(xì)胞的總 數(shù)，該小鼠被鹽水對(duì)照（PBS)、BM-MSCs (BM-MSC細(xì)胞系1、2、3)或hES-MSC處理。（N = 4只 小鼠每組，*Ρ〈〇· 05, #Ρ〈0· 01)
[0066] 圖14Α-Ε顯示了 EAE模型小鼠脊髓橫截面的髓鞘定量分析結(jié)果，該小鼠被鹽水 (PBS)、BM-MSCs(BM-MSC細(xì)胞系1、2、3)或hES-MSCs處理，利用熒光髓鞘染色（綠色）以及 用DAPI復(fù)染（藍(lán)色），指示核細(xì)胞的滲透。
[0067] 圖15A-B取免疫14天后EAE模型小鼠的脊髓做冰凍切片（60 μ m)，然后檢測(cè)熒 光標(biāo)記的hES-MSC和BM-MSC的定位（圖A和B)。該小鼠接受腹腔注射GFP+hESC-MSC、 GFP+BM-MSC或PBS對(duì)照。小鼠在注射MSC后被實(shí)施安樂死，并且進(jìn)行免疫染色，其中GFP (綠 色；示蹤注射的hES-MSC或BM-MSC)、CD31 (紅色；血管）和DRAQ5 (藍(lán)色；細(xì)胞核）。圖A是 薄壁組織的發(fā)炎的小靜脈。圖B顯示腦膜的小靜脈。所選擇的等值面繪制的3D重構(gòu)ROI (白 色虛線框）顯示在下一個(gè)到原始圖像以便增強(qiáng)空間透視。該插圖分別顯示GFP-DRAQ5(上 方插圖）單獨(dú)的GFP的通道（下方插圖）。
[0068] 圖16A-B分別顯示增殖的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的比例，該T細(xì)胞在體外與兩種 hES-MSCs (MA09或CT2)或三種BM-MSC細(xì)胞系之一（1、2或3)或PBS (無 MSCs)共培養(yǎng)。由 所示濃度的抗-CD3抗體刺激T細(xì)胞，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析CFSE的稀釋以檢測(cè)T細(xì)胞 的增殖。T細(xì)胞和MSCs以10 :1的比例混合。N =每組3個(gè)重復(fù)。
[0069] 圖17顯示⑶4+或⑶8+T細(xì)胞的增殖，該T細(xì)胞與BM-MSC、hES-MSC或?qū)φ眨o MSC)共培養(yǎng)，并且用0 μ g/ml (NC)、0. 1 μ g/ml或0. 3 μ g/ml抗-CD3抗體刺激T細(xì)胞。流式 細(xì)胞術(shù)直方圖顯示分化的⑶4+或⑶8+T細(xì)胞的百分比，這是以CFSE稀釋信號(hào)而定的。
[0070] 圖18A-J描繪了 IFNy +或IL-17+幼稚CD4+T細(xì)胞的胞內(nèi)FACS染色，該T細(xì)胞與 hES-MSC、三種BM-MSC細(xì)胞系之一（#2、#3或#6)或?qū)φ眨o MSCs)共培養(yǎng)，并且用TPA/離 子霉素刺激與幼稚⑶4+T細(xì)胞共溫育的hES-MSC或BM-MSC，然后Thl和Thl7分化5天。顯 示的數(shù)據(jù)是4組獨(dú)立試驗(yàn)中的1組。
[0071] 圖19A-B通過微陣列分析測(cè)定hES-MSC或BM-MSC的相對(duì)基因表達(dá)水平。N = 2， *P〈0. 05, **P〈0. 01。
[0072] 圖20A-F通過胞內(nèi)FACS染色檢測(cè)3個(gè)BM-MSC細(xì)胞系和3個(gè)hES-MSC細(xì)胞系的 IL-6和IL-10的表達(dá)。
[0073] 圖21A-D通過胞內(nèi)FACS染色用IFNγ培養(yǎng)的BM-MSC或hES-MSC(CT2)中的IL-6 顯示IL-6的表達(dá)。NC是陰性對(duì)照。
[0074] 圖22A-C顯示增殖的、CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞的比例，該T細(xì)胞被不同劑量的 抗-⑶3抗體刺激，并且以10 :1的比例與三種BM-MSC細(xì)胞系（#2、#3或#6)之一共培養(yǎng)，或 不與其共培養(yǎng)。在培養(yǎng)物中添加抗-人IL-6抗體（10 μ g/ml)或同型對(duì)照（IgGk)，如所示 的。N = 4個(gè)重復(fù)每組數(shù)據(jù)點(diǎn)，**P〈0. 01。
[0075] 圖23A-B顯示IL-6中和抗體（a IL-6)增強(qiáng)BM-MSC在體外對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞 增殖的抑制作用。NC表示T細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)無 MB-MSC或抗-IL6抗體。
[0076] 圖24A-J通過胞內(nèi)FACS染色檢測(cè)IFNy +或IL-17+CD4+T細(xì)胞的比例，該T細(xì)胞 在體外用TPA/離子霉素刺激。在Thl7分化的條件下，hES-MSC或BM-MSC以1 :10比例與 小鼠幼稚CD4+T細(xì)胞共溫育5天，該培養(yǎng)物中存在或不存在抗人IL-6抗體（10 μ g/ml)。
[0077] 圖25顯示EAE模型小鼠的臨床疾病評(píng)分，該小鼠被注射經(jīng)輻射的 hES-MSC(Irr-hES-MSC ;來自 MA09)、hES-MSCs (來自 MA09)或鹽水（PBS)。N = 5 只小鼠每 組，***p〈0. 001。
[0078] 圖26顯示表達(dá)熒光素酶的hES-MSC (CT2)的免疫染色。利用抗-熒光素酶的抗體 (綠色）對(duì)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的表達(dá)熒光素酶的hES-MSCs進(jìn)行免疫染色，并用DAPI (藍(lán)色） 復(fù)染細(xì)胞核。
[0079] 圖27A-B顯示在注射EAE小鼠后表達(dá)D-熒光素酶的未輻射hES-MSC或輻射 (Irr-hES-MSC)在不同時(shí)間點(diǎn)（天）的定位。使用Xenogen IVIS 100成像系統(tǒng)采集圖像。 在EAE模型小鼠的背部和腹部圖像中顯示表達(dá)D-熒光素的、未被輻射的（圖A)和被輻射 的（圖 B) hES-MSC (CT2)。
[0080] 圖28A-D顯示GSK3抑制劑BI0((2' Z，3' E)-6-溴靛紅-3' -肟，6-BI0)對(duì)來源于 人胚胎干細(xì)胞的胚狀體（EB)分化的影響。BIO顯著地促進(jìn)BM形成和使培養(yǎng)物在第7天獲 得細(xì)胞數(shù)量增多。
[0081] 圖29是顯示BIO促進(jìn)EB形成數(shù)量的柱狀圖。
[0082] 圖30是流式細(xì)胞術(shù)圖，顯示BIO處理提高成血管細(xì)胞的形成效率。
[0083] 圖31顯示微陣列分析不同hES-MSC細(xì)胞系和BM-MSC細(xì)胞系的⑶10表達(dá)水平。
[0084] 5.發(fā)明詳述
[0085] 5. 1 定義
[0086] 在本發(fā)明的上下文和每個(gè)術(shù)語應(yīng)用的特定上下文范圍內(nèi)，本說明書中應(yīng)用的術(shù)語 在本領(lǐng)域中一般具有它們的常規(guī)含義。在下文或本發(fā)明的其他部分對(duì)某些術(shù)語進(jìn)行了討論 以對(duì)本發(fā)明的方法描述及如何使用它們，為實(shí)施者提供額外的指導(dǎo)。此外，可以理解為，同 樣的事務(wù)可以以一種以上的方式敘述。因此，對(duì)本文所論述的任一個(gè)或多個(gè)術(shù)語都可使用 選擇性的語言和同義詞，無論該術(shù)語是否詳述或討論于此，對(duì)其都沒有任何特殊的意義。本 文提供了某些術(shù)語的同義詞。描述一個(gè)或多個(gè)同義詞并不排除使用其它的同義詞。這些或 其他在本說明書中任何地方的實(shí)施方式的用途僅僅是說明性的，并且決不限制本發(fā)明或任 何舉例說明的術(shù)語的范圍和含義。
[0087] 術(shù)語"hESC"是人胚胎干細(xì)胞，包括從胚胎、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、卵裂球或細(xì)胞系產(chǎn)生的多能 性的干細(xì)胞。
[0088] 術(shù)語"hES-HB-MSC"是經(jīng)過中間步驟成血管細(xì)胞或血管瘤集落形成而衍生的間充 質(zhì)干細(xì)胞。
[0089] 本文所使用的術(shù)語"hES-MSC"或"hES-MSCs"或"人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞"或"人胚胎 干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞"或"hES-MSC群"指人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞"iPSCs" 使用任何方法衍生的間充質(zhì)樣干細(xì)胞、間充質(zhì)樣基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或間充質(zhì)基質(zhì)細(xì) 胞。本文使用的hES-MSC包括hES-MSC單細(xì)胞、hES-MSC細(xì)胞系、一批hES-MSC、大量hES-MSC 或 hES-MSC 群。
[0090] 本文使用的術(shù)語"臨床級(jí)別hES-MSC"指具有以下特征的MSC :適合在臨床上用于 人、鳥類或其它動(dòng)物。本文使用的臨床級(jí)別hES-MSC包括MSC單細(xì)胞、MSC細(xì)胞系、一批MSC、 大量MSC或MSC群。
[0091] 本文使用的術(shù)語"hES-MSC群體"指包括具有適合用于治療的特征的hES-MSC群體 和不具有適合用于治療的特征的hES-MSC群體。
[0092] 術(shù)語" iPS-MSC"和" iPS-MSCs "和"人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞"在全 文中可互換使用。對(duì)這些細(xì)胞的描述可基于多種結(jié)構(gòu)和功能特性，包括但不限于表達(dá)或缺 乏表達(dá)一種或多種標(biāo)記。iPS-MSCs是多能性的并且能分化產(chǎn)生其它譜系的細(xì)胞類型。
[0093] 本文使用的短語"治療有效量"指其數(shù)量足以引起改善受試者的臨床顯著癥狀，或 延遲或最小化或減輕一種或多種與所述疾病有關(guān)的癥狀，或者導(dǎo)致受試者在生理學(xué)上所希 望的有益改變。
[0094] 術(shù)語"治療"是指減緩、緩解、改善或減輕至少一種疾病的癥狀，或在發(fā)病后逆轉(zhuǎn)其 發(fā)作。
[0095] 術(shù)語"預(yù)防"指在發(fā)病前起作用，以防止形成該疾病或減輕疾病的嚴(yán)重程度或延緩 其發(fā)展的過程。
[0096] 本申請(qǐng)中使用的術(shù)語"受試者"指具有免疫系統(tǒng)的動(dòng)物，例如禽類和哺乳動(dòng)物。哺 乳動(dòng)物包括犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、牛、馬、豬、羊和靈長類動(dòng)物。禽類包括但不限 于家禽、鳴禽和猛禽。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于獸醫(yī)，例如，治療玩賞動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物公園 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和在野外動(dòng)物。本發(fā)明特別適合于人類醫(yī)藥應(yīng)用。
[0097] 術(shù)語"需要其"是受試者已知或懷疑患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展成疾病，包括但不限于多發(fā) 性硬化癥和其他T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫疾病，或與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血-腦屏障或血一脊髓屏 障相關(guān)的疾病。
[0098] 一個(gè)需要治療的受治療者是已經(jīng)發(fā)生疾病的受試者。一個(gè)需要預(yù)防的受試者是具 有發(fā)生該疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者。
[0099] 本文使用的術(shù)語"藥劑"指一種產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生效果的物質(zhì)，可以包括但不限于化 學(xué)品、醫(yī)藥品、藥物、生物劑、小分子、抗體、核酸、肽類和蛋白質(zhì)。
[0100] 5. 2胚胎干細(xì)胞在體外經(jīng)過成血管細(xì)胞分化以獲得間充質(zhì)樣干細(xì)胞
[0101] 本發(fā)明提供了一種從人胚胎干細(xì)胞（hES)衍生的成血管細(xì)胞（HB)產(chǎn)生和擴(kuò)增間 充質(zhì)樣干細(xì)胞的方法。所獲得的細(xì)胞定義為hES-MSCs?？煞蛛x和/或純化這些hES-MSCs。
[0102] 人胚胎干細(xì)胞經(jīng)不同的方法誘導(dǎo)得到間充質(zhì)干細(xì)胞樣的細(xì)胞（Barbieri等 (2005) ;01ivier 等（2006) ;Sanchez 等（2011) ;Brown 等（2009))。然而，所有這些方法涉 及共培養(yǎng)和手工挑選步驟，限制細(xì)胞的產(chǎn)量和純度，并且導(dǎo)致所得細(xì)胞的質(zhì)量不一。
[0103] 為了解決這些問題，本發(fā)明提供了衍生間充質(zhì)干細(xì)胞的新方法，該方法先是將胚 胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成胚狀體，然后分化為成血管細(xì)胞，最后分化為間充質(zhì)干細(xì)胞?？梢约俣ㄓ捎?間充質(zhì)細(xì)胞和成血管細(xì)胞都起源于中胚層祖細(xì)胞（MP) (Huber等（2004))，那么hESC經(jīng)過 EB而衍生HB的方法可實(shí)際上富集MP，以至于根據(jù)隨后的培養(yǎng)條件可進(jìn)一步分化為HB或 MSCs。如圖1所示，通過hESC分化為EB，再分化為HB，最后分化為MSCs的方法可獲得MSCs。
[0104] 盡管hESC表達(dá)低水平的主要組織相容性復(fù)合體抗原，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些抗原在 hESC分化的多種細(xì)胞中表達(dá)水平更高（Draper等，2002 ;Drukker等，2006 ;Drukker等， 2002)，因此，如果把這些分化的細(xì)胞移植至患者體內(nèi)將引起對(duì)免疫排斥極大的關(guān)注。相 反，MSC表達(dá)低水平的共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體抗原，并且已經(jīng)被應(yīng)用于同種 或異種移植模型以治療自身免疫性疾病（Gordon等，2008b ;Grinnemo等，2004 ;Rafei等， 2009a ;Rafei等，2009b ;Tse等，2003) dES-MSC和成體組織來源的MSC-樣，表達(dá)低水平的 共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體抗原，并且不需要長期移植就能發(fā)揮免疫抑制作用。 由于MSC和患者的主要組織相容性復(fù)合體抗原不匹配，因此無需擔(dān)憂免疫排斥。一個(gè)hESC 系就足以產(chǎn)生無限供應(yīng)的大規(guī)模的hES-MSC，并且容易控制質(zhì)量，適合工業(yè)化生產(chǎn)，成為一 種治療MS和其他以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的自體免疫疾病的患者潛在的療法。
[0105] Lu等（2007)和Lu等（2008)已經(jīng)報(bào)告hES形成EB，然后分化為HB的方法，該方 法也可參見美國專利申請(qǐng)公開2012/0027731，它們都以其整體內(nèi)容納入作用參考。
[0106] 可以從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生人血管瘤集落形成細(xì)胞。這種胚胎干細(xì)胞包括來源于或 通過以下方法獲得的胚胎干細(xì)胞，例如囊胚、鋪板的ICMs、一個(gè)或多個(gè)卵裂球、或植入前階 段胚胎的其它部分或胚胎樣組織，無論是否通過受精、體細(xì)胞核移植（SCNT)、孤雌生殖、雄 核發(fā)育或其它有性或無性繁殖方法。
[0107] 此外或可供選擇地，可從胚胎衍生的其它細(xì)胞中產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。例如 可通過來源于或使用鋪板的胚胎、ICMS、胚泡、一個(gè)或多個(gè)卵裂球、滋養(yǎng)層干細(xì)胞、胚胎生 殖細(xì)胞、或植入前階段的胚胎其它部分或胚胎樣組織，無論是否通過受精、體細(xì)胞核移植 (SCNT)、孤雌生殖、雄核發(fā)育或其它有性或無性繁殖的方法產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞（不 需要通過胚胎干細(xì)胞衍生這一步驟）。相似地，可以使用從胚胎衍生的細(xì)胞分化的部分細(xì)胞 或細(xì)胞系產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。例如，如果一個(gè)人胚胎干細(xì)胞系被用來生產(chǎn)比血管瘤 集落形成細(xì)胞發(fā)育更原始的細(xì)胞，那么就發(fā)育潛力和可塑性而言，這種胚胎來源的細(xì)胞可 以產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。
[0108] 另外或可供選擇地，可從其它分娩前和圍產(chǎn)后的原料，包括但不限于臍帶、臍帶 血、羊膜液、羊膜干細(xì)胞和胎盤中產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。
[0109] 值得注意的是，當(dāng)從人胚胎組織產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞時(shí)，形成胚狀體這一步 驟可能是必需的。然而，考慮到在早期發(fā)育期間，胚狀體的形成有助于（至少部分）重現(xiàn)胚 層的三維相互作用，當(dāng)胚胎衍生的細(xì)胞已經(jīng)具有實(shí)質(zhì)上與胚狀體形成一樣用途的結(jié)構(gòu)和組 織時(shí)，這樣一個(gè)步驟不一定是必需的。舉個(gè)例子，當(dāng)從接種的囊胚中產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì) 胞時(shí)，囊胚中的細(xì)胞已經(jīng)形成一定程度的三維結(jié)構(gòu)。同樣地，形成胚狀體這個(gè)步驟并不是提 供細(xì)胞間信號(hào)、感應(yīng)信號(hào)和三維結(jié)構(gòu)所必需的。
[0110] 可使用胚胎衍生的細(xì)胞產(chǎn)生血管瘤集落形成細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述胚胎 衍生的細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在另一些實(shí)施方式中，所述胚胎衍生的細(xì)胞是鋪板的胚胎、內(nèi)細(xì) 胞團(tuán)、滋養(yǎng)層/滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞、一個(gè)或多個(gè)卵裂球、滋養(yǎng)層干細(xì)胞或早期植入前胚胎的其 它部分。對(duì)于上文提到的任何一個(gè)，所述胚胎衍生的細(xì)胞可來自以下方式制備的胚胎：受 精、體細(xì)胞核移植（SCNT)、孤雌生殖、雄核發(fā)育或其它有性或無性繁殖的方法。
[0111] 人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以是這種方法的起始材料?？梢园幢绢I(lǐng)域已知 的任何方法培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，例如存在或不存在飼養(yǎng)細(xì)胞。添加終濃 度為0. 05UM-0. 2uM的GSK3抑制劑BIO可提高胚狀體形成和后續(xù)的成血管細(xì)胞形成效率， 縮短培養(yǎng)時(shí)間。
[0112] 在此闡述的實(shí)施方式中，共使用了 4種hESC細(xì)胞系，分別是H9(來自WiCell Research Institute) (Thomson等（1998))、CT2(來自康涅狄格大學(xué)干細(xì)胞中心（Lin 等（2010) )、MA09 (美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的、臨床級(jí)別的細(xì)胞系，來自先進(jìn)細(xì)胞技 術(shù)公司）（Klimanskaya等（2006))和ES03_Envy (Envy，帶GFP標(biāo)簽的細(xì)胞系，來自ES International)(Costa 等（2005))〇
[0113] 在通過產(chǎn)生和擴(kuò)增人成血管細(xì)胞以獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法中，其第一步是將人 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中并誘導(dǎo)分化為胚狀體。為了誘導(dǎo)形成胚狀體，胚胎干細(xì) 胞可在無血清培養(yǎng)基中沉淀和重懸，如DMEM/F12、HPGM(Lonza)、StemSpan H3000 (Stemcell Technologies)、Stempro-34、QBSF-60、Xvivo-15、IMDM，Stemline I 或 II 培養(yǎng)（Sigma. TM.)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了一種或多種形態(tài)發(fā)生因子和細(xì)胞因子，然后鋪在低粘附培養(yǎng)皿上。形 態(tài)發(fā)生因子和細(xì)胞因子可包括但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白（如BMP-2、BMP-4或BMP-7,但不 是BMP-3)、VEGF、SCF和FL。骨形態(tài)發(fā)生蛋白和VEGF可單獨(dú)使用，也可以和其它因子結(jié)合 使用。在細(xì)胞培養(yǎng)的0-72小時(shí)期間，可在培養(yǎng)基中添加所述形態(tài)發(fā)生因子和細(xì)胞因子。在 以下這些條件下溫育，在存在早期造血擴(kuò)增因子的條件下溫育，該早期造血擴(kuò)增因子包括 但不限于促促血小板生成素（TPO)、Flt-3配體和干細(xì)胞因子（SCF)，允許鋪板的胚胎干細(xì) 胞形成胚狀體。除了 TP0、Flt-3配體SCF，VEGF、BMP-4也可添加至所述培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí) 施方式中，人胚胎干細(xì)胞首先生長在含BMP-4和VEGF165 (如25-100ng/ml)的培養(yǎng)基中，隨 后生長在含BMP-4、VEGF165、SCF、TPO和Flt-3配體（如10-50ng/ml)的培養(yǎng)基中。在細(xì) 胞鋪板48-72小時(shí)后可添加所述額外的因子。
[0114] 接下來，從早期胚狀體（EBs)中分離人成血管細(xì)胞。從早期胚狀體中分離成血管 細(xì)胞以支持該細(xì)胞體外擴(kuò)增。對(duì)于人細(xì)胞，可從生長少于10天的胚狀體中獲得成血管細(xì) 胞。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，生長了 2-6天的人胚狀體就能產(chǎn)生成血管細(xì)胞。根據(jù)一 個(gè)實(shí)施方式，可從生長了 4-6天的人胚狀體中鑒定和分離成血管細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，在分離成血管細(xì)胞之前，人胚狀體生長了 2-5天。在某些實(shí)施方式中，在分離成血管細(xì) 胞之前，人胚狀體生長了 3-4. 5天。
[0115] 在某些實(shí)施方式中，使用TrypLE-LE(Invitrogen)、胰酶/EDTA或膠原酶B來清洗 和分離早期胚狀體。然后將選擇數(shù)量的細(xì)胞（如2-5X IO5個(gè)細(xì)胞）和無血清甲基纖維素 培養(yǎng)基混合，該培養(yǎng)基是最有利于成血管細(xì)胞生長的，比如BL-CFU培養(yǎng)基，例如干細(xì)胞技 術(shù)公司目錄H4436、H4536或成血管細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基（HGM)或任何以下培養(yǎng)基：含1. 0%甲 基纖維素的MDM、l-2%牛血清白蛋白、0. ImM 2-巰基乙醇、10yg/ml rh-胰島素、200 yg/ ml 鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白、20ng/ml rh-GM_CSF、20ng/ml rh-IL_3、20ng/ml rh-IL_6、20ng/ ml rh-G-CSF("rh"表示重組人）?？稍谠撆囵B(yǎng)基中補(bǔ)充早期細(xì)胞因子，包括但不限于EPO、 TP0、SCF、FL、Flt-3、VEGF、BMPs，比如 BMP2、BMP4 和 BMP7,但不是 BMP3 和 H0XB4(或另一種 同源異型框蛋白）。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在ΕΡ0、ΤΡ0和FL存在的情況下生長。在 某些實(shí)施方式中，H9是起始的人胚胎干細(xì)胞，在培養(yǎng)基中添加 EPO、TPO和FL。除了 EPO、TPO 和FL，用于培養(yǎng)H9或其它ES衍生的細(xì)胞的培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含VEGF、BMP-4和HoxB4。
[0116] 通過這種方法獲得的細(xì)胞（該細(xì)胞可培養(yǎng)在BL-CFU培養(yǎng)基中），包括成血管細(xì)胞， 接鋪在超低粘附培養(yǎng)皿，并在〇) 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至獲得成血管細(xì)胞集落。一些細(xì)胞也許可 以形成次級(jí)EBs。再經(jīng)約3-6天，在某些情況下3-4. 5天，可觀察至成血管細(xì)胞集落。成血 管細(xì)胞集落具有與眾不同的葡萄樣形態(tài)和/或小體積，因此可區(qū)別于其它細(xì)胞如次級(jí)EBs。 另外，可通過以下方式鑒定成血管細(xì)胞：檢測(cè)特定標(biāo)記的表達(dá)（如早期造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì) 胞標(biāo)記的表達(dá)）和是否具有至少都能分化為造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力。例如，當(dāng)成血管 細(xì)胞缺少成熟內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞的某些特征時(shí)，可通過特定標(biāo)記鑒定這些細(xì)胞（例如 CD133、SCA-1、CD34、CD45、CD31、cKit、巢蛋白 +、Stro-1、Stro-3、CD71+)。成血管細(xì)胞也 可能表達(dá)GATA-1、GATA-2蛋白、CXCR-4、TPO和EPO受體。進(jìn)一步地，成血管細(xì)胞的特征可 在于表達(dá)特定的基因，這些基因與成血管細(xì)胞和早期前成紅細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，例如SCULM02、 FLT-I、胚胎胎兒球蛋白基因、NF-E2、GATA-I、EKLF、ICAM-4、glycophoriuns 和 EPO 受體。
[0117] 可根據(jù)大小和/或形態(tài)以及以下程序分離成血管細(xì)胞。在生長3至7天后，混合 細(xì)胞中包含有EBs和成血管細(xì)胞，其中EBs為圓形并呈現(xiàn)多細(xì)胞塊狀，而成血管細(xì)胞是葡萄 樣形態(tài)，比EBs小并且是單細(xì)胞。因此，可根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)和大小分離成血管細(xì)胞。例如在 顯微鏡下觀察該細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可手工挑選成血管細(xì)胞。該細(xì)胞隨后可形成集落，每個(gè)集落 含100-150個(gè)細(xì)胞。
[0118] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用胰酶替代物TrypLE、胰酶或膠原酶B將滋養(yǎng)細(xì)胞消化成單 細(xì)胞。將獲得的單細(xì)胞在優(yōu)化的間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基中重懸，如含2-20%胎牛血清 (FBS)或人AB血清（ABHS)的a -MEM培養(yǎng)基、含2-20 % FBS或ABHS的高糖DMEM培養(yǎng)基。可 用含5-20%敲除血清替代物（KOSR)或牛血清白蛋白（BSA)或任何其它可用的商業(yè)化無血 清MSC培養(yǎng)基替代FBS。在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中血清、KOSR或BSA的濃度約為5-20 %。 在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選胎牛血清。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞的培養(yǎng)密度約10-1000細(xì)胞/ cm2。在某些實(shí)施方式中，在模擬組織的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，如基質(zhì)膠。
[0119] 在約24小時(shí)后，大量細(xì)胞（5-10%)貼壁于培養(yǎng)皿，約6-14天后，成血管細(xì)胞開 始向間充質(zhì)干細(xì)胞分化。可通過紡錘樣形態(tài)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞。也可通過以下方式鑒定鑒 定間充質(zhì)干細(xì)胞：表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記CD146和CD166 ;不表達(dá)或表達(dá)低水平的某些細(xì)胞表面 標(biāo)記如CD31、CD34和CD45。間充質(zhì)干細(xì)胞的特征還在于，具有多能性并能夠分化成脂肪細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞。來源不同細(xì)胞的⑶10的表達(dá)水平可能有差別，CT2和H9-MSC表 達(dá)低水平的CD10,而MA09-MSC表達(dá)高水平的CD10,這種表達(dá)差異與它的免疫抑制功能不相 關(guān)，但可能與其它功能相關(guān)，如纖維化和下游的分化。在某些實(shí)施方式中，少于28%、27%、 26%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%的 hES-MSC 表達(dá) CD10。
[0120] 在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，額外添加輻射hES-MSCs的步驟。該照射可以采用 任何本領(lǐng)域已知的輻射方法，包括但不限于伽馬輻射，如銫-137伽馬輻射，或X-射線光子 福射。福射的優(yōu)選量在5和20000gy之間，更優(yōu)選的在50和IOOgy之間，最優(yōu)選的是80gy。
[0121] 5. 3人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（hES-MSC)和iPS-MSC
[0122] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞，定義為hES-MSC。這 些細(xì)胞是獨(dú)特的，具有多種治療用途和其它用途。因此，本發(fā)明包括多種包含hES-MSCs制 劑和組合物，其中制劑包括藥物制劑。
[0123] 術(shù)語"hES-MSC"和"hES-MSCs"和"人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞"和"人胚 胎間充質(zhì)干細(xì)胞"在全文中可互換使用。對(duì)這些細(xì)胞的描述可基于眾多結(jié)構(gòu)和功能特征，包 括但不限于表達(dá)或不表達(dá)一種或多種標(biāo)記。hESC-MSCs是多能性的并且能分化產(chǎn)生其它譜 系的細(xì)胞類型。
[0124] 術(shù)語" iPS-MSC"和" iPS-MSCs "和"人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞"在全 文中可互換使用。對(duì)這些細(xì)胞的描述可基于眾多結(jié)構(gòu)和功能特征，包括但不限于表達(dá)或不 表達(dá)一種或多種標(biāo)記。iPS-MSCs是多能性的并且能分化產(chǎn)生其它譜系的細(xì)胞類型。
[0125] 可根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特征鑒定人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。具體地，根據(jù)成 纖維細(xì)胞樣細(xì)胞體和紡錘樣形態(tài)鑒定hES-MSCs。
[0126] 可以通過檢測(cè)一種或多種細(xì)胞標(biāo)記的DNA、RNA或蛋白的表達(dá)或不表達(dá)鑒定 hES-MSCs。如果細(xì)胞具有以下特征，那么該細(xì)胞可被認(rèn)為是hESC-MSCs :表達(dá)細(xì)胞表面 ⑶73,或表達(dá)至少一種或多種以下細(xì)胞表面標(biāo)記：⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶44、 ⑶146和⑶166、或不表達(dá)或表達(dá)低水平的至少以下一種細(xì)胞表面標(biāo)記：⑶34、⑶31或⑶45。
[0127] 可選擇地或另外地，對(duì)hES-MSCs的鑒定可根據(jù)它們表達(dá)低水平的以下一種或多 種促炎蛋白：MMP2、RAGE、IFNGR2、TNF a、IL-12A、IL-6和CAM1。以上所述的基因表達(dá)模式 是與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比較的。尤其是，IL-6在BM-MSCs的表達(dá)量高于hES-MSCs。IL-6 是一種多效的細(xì)胞因子，參與造血細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的交叉作用，包括炎癥的 發(fā)生和終止。
[0128] 可選擇地或另外地，類似于其它類型的MCS，根據(jù)表達(dá)高水平免疫抑制的、非經(jīng)典 的MHC抗原HLA-G和HLA-ABC，以及表達(dá)低水平的MHC II類抗原HLA-DR和共刺激分子CD80 鑒定hES-MSCs，該方法類似于鑒定其它類型的MCS。
[0129] 該hES-MSCs的特征還在于它們能夠抑制體外受到刺激的T細(xì)胞增殖。這個(gè)特征 是與BM-MSCs形成鮮明對(duì)比，因?yàn)锽M-MSCs具有更低的抑制體外受到刺激的T細(xì)胞增殖的 能力。
[0130] 因此，本文所描述的人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞至少具有以下一種特征： 1.分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞；2.具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；3.表達(dá)CD73、 CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146 和 / 或 CD166 ;5.不表達(dá)或低水平表達(dá) CD34、 CD31 和 / 或 CD45 ;6.不表達(dá)或低水平表達(dá) MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、 IL-6和/或VCAM1，特別是IL-6 ;7.低水平表達(dá)MHC抗原HLA-G和/或HLA-ABC，或不表達(dá) HLA-DR和/或CD80;8.在體外抑制受到刺激后的T細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方式中，所述 hES-MSCs具有至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或所有8種特 征。
[0131] 此外，本文所述的人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞具有穿過血腦屏障和血脊髓 屏障的獨(dú)特能力，這種穿透能力使該細(xì)胞特別適合治療和診斷應(yīng)用。如本文所示，本文所述 的hES-MSCs具有迀移進(jìn)出脊髓的血管、穿過血脊髓屏障的能力，以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作 用，這種作用包括但不限于遞送用于治療和診斷的藥物。這與BM-MSCs不具有此功能形成 比對(duì)。
[0132] 在某些實(shí)施方式中，所述hES-MSC被γ或X射線輻射。這個(gè)實(shí)施方式包括具有至 少一種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或全部8種上文所列 舉特征的hES-MSC，這些hES-MSC已經(jīng)受到輻射。
[0133] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括hES-MSC。在某些實(shí)施方式中，所述 hES-MSC分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述hES-MSC表 達(dá)0)73、0)90、0)105、0)13、0)29、0)54、0)44、0)146和/或0)166。在某些實(shí)施方式中，所 述細(xì)胞表達(dá)低水平的或不表達(dá)CD34、CD31和/或CD45。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞表達(dá) 低水平或不表達(dá) MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、IL-6 和 / 或 VCAMl，特別是 IL-6。在某些其他的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體抗原HLA-G和/或 HLA-ABC，并且表達(dá)低水平的或不表達(dá)HLA-DR和/或⑶80。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在 體外抑制受到刺激后的T細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可以穿過血腦屏障和 血脊髓屏障。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞已經(jīng)被輻射。
[0134] 在另一方面，本文提供了一種包含hES-MSC的藥物制劑。在某些實(shí)施方式中，所述 hES-MSCs可分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述hES-MSC 表達(dá)0)73、0)90、0)105、0)13、0)29、0)54、0)44、0)146和/或0)166。在某些實(shí)施方式中， 這些細(xì)胞表達(dá)低水平或不表達(dá)⑶34、⑶31和/或⑶45。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞表達(dá) 低水平的或不表達(dá)MMP2、RAGE、IFNγRl、IFNγR2、IL-12、TNFa、IL-6和/或VCAMl，特別是 IL-6。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體抗原HLA-G和/或HLA-ABC， 并且表達(dá)低水平的或不表達(dá)HLA-DR和/或⑶80。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可以穿越血 腦屏障和血脊髓屏障。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞已經(jīng)被輻射?？梢允褂萌魏嗡帉W(xué)可接 受的載體或賦形劑制備所述藥物制劑。
[0135] 在某些實(shí)施方式中，所述組合物或藥物制劑包含至少10000個(gè)hES-MSC、至少 50000 個(gè) hES-MSC、至少 100000 個(gè) hES-MSC、至少 500000 個(gè) hES-MSC、至少 I X IO6個(gè) hES-MSC、 至少 5 X IO6個(gè) hES-MSC、至少 I X 10 7個(gè) hES-MSC、至少 5 X 10 7個(gè) hES-MSC、至少 I X 10 8個(gè) hES-MSC、至少 5 X IO8個(gè) hES-MSC、至少 I X 10 9個(gè) hES-MSC、至少 5 X 10 9個(gè) hES-MSC 或至少 IX 101。個(gè) hES-MSC。
[0136] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種人血管瘤集落細(xì)胞或其部分分化的或最終 分化的細(xì)胞的冷凍保存制劑。
[0137] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 hES-MSCs的治療用途或hES-MSCs組合物或 hES-MSCs制劑，包括已被輻射的hES-MSCs。這種細(xì)胞和制劑可用于治療整個(gè)說明書中所述 的任何病癥和疾病，以及可以應(yīng)用于遞藥系統(tǒng)，以使藥物穿越血腦屏障和血脊髓屏障。
[0138] 5. 4選擇和生產(chǎn)hES-MSC群體
[0139] 本文提供了一種鑒別具有高度免疫抑制能力的hES-MSC的方法，其中，該方法通 過鑒別hES-MSC的生物標(biāo)記譜進(jìn)行，所述hES-MSC是用于治療的、臨床級(jí)別的、具有高度免 疫抑制效力。在某些實(shí)施方式中，這些臨床級(jí)別的hES-MSC具有以下特性：（i)包含>95% 的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)包含>80 %的細(xì)胞表達(dá)組-2標(biāo)記；（iii)包含〈5 %的細(xì)胞表 達(dá)組-3標(biāo)記；（"）表達(dá)幾-10和了6叩；（￥)包含〈2%的細(xì)胞表達(dá)11^-6、幾-12和了嚦€1 ; (vi)包含〈0.001 %的細(xì)胞共表達(dá)所有組-4標(biāo)記。其中，組-1標(biāo)記是：⑶73、⑶90、⑶105、 CD146、CD166 和 CD44。組-2 標(biāo)記是：CD13、CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標(biāo)記是：CD45、CD34、 CD31 和 SSEA4。組-4 標(biāo)記是：0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
[0140] 在某些實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)標(biāo)記的差異表達(dá)，該標(biāo)記編碼抗炎癥因子 (AIF)和促炎癥因子（PIF)。在某些實(shí)施方式中，所述抗炎癥因子是IL-10和TGF02。在 某些實(shí)施方式中，促炎癥因子的表達(dá)上調(diào)。在某些實(shí)施方式中，以上標(biāo)記在hES-MSC的表達(dá) 量至少是BM-MSC的1. 5倍。在某些實(shí)施方式中，促炎癥因子是IL-6、IL-12、TNFa、CCL2、 VCAM1、RAGE和MMP2。在某些實(shí)施方式中，促炎癥因子的表達(dá)下降。在某些實(shí)施方式中，以 上標(biāo)記在hES-MSC的表達(dá)量至少比BM-MSC的少一半。在另一個(gè)實(shí)施方式，在具有高度免疫 抑制能力的hES-MSC中，IL-6陽性的細(xì)胞比率少于5%、4%、3%、2%或1%。在某些實(shí)施方 式中，hES-MSC表達(dá)低水平的IL12、TNFa、RAGE和其它PIF。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC 可能表達(dá)高水平的TGF β 2和IL-10。在某些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記的表達(dá)是以BM-MSC為對(duì) 照。
[0141] 這里提供臨床級(jí)別的hES-MSC群體的鑒定方法。為了確定hES-MSC群體是否適 合應(yīng)用治療，需要檢測(cè)該細(xì)胞特異性生物標(biāo)記的表達(dá)。這些生物標(biāo)記包括例如，（1)間充質(zhì) 干細(xì)胞特異性的標(biāo)記：⑶73、⑶90、⑶105、⑶166和⑶44(第一組）；（2)間充質(zhì)干細(xì)胞特 異性的標(biāo)記：CD13、CD29、CD54、CD49E、SCA-I和STRO-I (第二組）；（3)造血干/祖細(xì)胞的 標(biāo)記：CD45、CD34和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記CD31 ; (4)免疫標(biāo)記：HLA-ABC、HLA-G、CD80和CD86 ; (5)細(xì)胞因子：IL-10、TGF0、IL-6 和 IL-12 ; (6)多能性的標(biāo)記：0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA-4。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC群體包含超過95%、96%、97%、98%或99%的細(xì)胞表 達(dá)至少一種組-1標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC群體包含超過80%、85%、90%、95 % 或99%的細(xì)胞表達(dá)至少一種組-2標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC群體包含少于0. 1%、 0. 08%、0. 05%、0. 03%、0. 02%或0. 01 %的細(xì)胞表達(dá)至少一種組-3標(biāo)記。在某些實(shí)施方式 中，hES-MSC群體包含超過80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的細(xì)胞表達(dá)IL-10和/或TGF β。 在某些實(shí)施方式中，hES-MSC群體包含少于5%、4%、3%、2%、1%的細(xì)胞表達(dá)11^-6和/或 IL-12。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC群體包含少于0. 001 %的細(xì)胞表達(dá)至少一種組6標(biāo)記。 在某些實(shí)施方式中，臨床前級(jí)別的hES-MSC作為陽性對(duì)照，與臨床級(jí)別的hES-MSC相比較。 在某些實(shí)施方式中，通過多色流式細(xì)胞術(shù)和/或免疫熒光分析hES-MSC的特征。在某些實(shí) 施方式中，hES-MSC 群體表達(dá) CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-17、TNFa、TGF0、IFNy、GM-CSF、G-CSF、bFGF、CXCL5、VEGF、TPO 或其組合。在某些實(shí) 施方式中，還對(duì)hES-MSC群體作以下分析：（1)存在外源性材料如內(nèi)毒素和殘留的細(xì)胞因子 /生長因子，和/或（2)基因異常（利用核型分析和全基因組測(cè)序）。
[0142] 對(duì)所述MSC表達(dá)譜的檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知的。這些方法包括但不限于：流式細(xì) 胞術(shù)、多重芯片、RT-PCR、RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡。在某些實(shí)施方式中，對(duì)所述MSC表達(dá)譜 的分析采用基于多種細(xì)胞因子分析的流式微球檢測(cè)、基于多種細(xì)胞因子分析的Iuminex系 統(tǒng)、基因表達(dá)的高通量分析、定量RT-PCR、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光報(bào)告系統(tǒng)、組織染色和免疫熒光染色。
[0143] 5. 4. 1.監(jiān)測(cè)核酸生物標(biāo)記的方法
[0144] 在具體的實(shí)施方式中，核酸屬于生物標(biāo)記譜中的一種生物標(biāo)記。這種生物標(biāo)記和 生物標(biāo)記譜相應(yīng)的特征可通過以下所述產(chǎn)生，如檢測(cè)一種或多種標(biāo)記的表達(dá)產(chǎn)物（如多核 苷酸和多肽）。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，這些生物標(biāo)記和生物標(biāo)記譜相應(yīng)的特征的獲得渠 道是：利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法檢測(cè)和/或分析這里公開的一種標(biāo)記所表達(dá)的 一種或多種核酸，所述的方法包括但不限于雜交、芯片分析、RT-PCR、核酸酶保護(hù)測(cè)定和RNA 印跡分析。
[0145] 在某些實(shí)施方式中，通過本方法檢測(cè)和/或分析的核酸和本發(fā)明的組合物包括 RNA分子，例如表達(dá)的RNA分子（包括mRNA分子）、mRNA的剪切變異體、調(diào)控RNA、cRNA分 子（如RNA分子在體外轉(zhuǎn)錄為cDNA分子）和其識(shí)別片段。
[0146] 在具體的實(shí)施方式中，在體外制備的核酸來自存在細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸，或從細(xì)胞 培養(yǎng)物分離的、或部分分離的核酸，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是本領(lǐng)域所熟知的。以上所述一般描 述在如，Sambrook等，2001，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（紐約冷泉 港），該文件全部內(nèi)容在此引入作為參考。
[0147] 5. 4. 1.1 核酸陣列
[0148] 在某些實(shí)施方式中，核酸陣列通過檢測(cè)任何一個(gè)或多個(gè)這里所述的生物標(biāo)記，獲 得生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記的特征。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，利用微陣列如cDNA微陣 列檢測(cè)生物標(biāo)記譜的生物標(biāo)記的特征值。下文和在實(shí)施方式中描述cDNA微陣列分析的示 例方法。
[0149] 在某些實(shí)施方式中，通過與陣列上可檢測(cè)的標(biāo)記的核酸雜交獲取生物標(biāo)記譜中的 生物標(biāo)記的特征值，所述標(biāo)記的核酸代表生物樣本中存在的mRNA轉(zhuǎn)錄體的核酸序列，或與 這些序列一致。所述生物樣品（如合成來自樣本的熒光標(biāo)記的cDNA)與包含一個(gè)或多個(gè)探 針斑點(diǎn)的微陣列相雜交。
[0150] 有不同的方法制備核酸陣列如微陣列，在下文描述其中一些方法。優(yōu)選地，陣列是 可復(fù)制的，允許生產(chǎn)給定陣列的多個(gè)拷貝并相互比較。優(yōu)選地，陣列由在結(jié)合（例如，核酸 雜交）條件下穩(wěn)定的材料制造。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道在陣列上雜交測(cè)試探針至探針斑 點(diǎn)所用的適宜支持物、基質(zhì)或載體，或?qū)⒛芾闷胀▽?shí)驗(yàn)確定這些適合的載體。
[0151] 在使用陣列如微陣列時(shí)可包括一個(gè)或多個(gè)測(cè)試探針。在某些實(shí)施方式中，每一個(gè) 這樣的測(cè)試探針包含一個(gè)與所要檢測(cè)的RNA或DNA的亞序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。每個(gè)探 針通常具有不同的核酸序列，并且每個(gè)探針在陣列的固體表面上的位置通常是已知的或可 確定的。對(duì)本發(fā)明有用的陣列可包括，例如寡核苷酸微陣列、基于cDNA的陣列、單核苷酸多 態(tài)性陣列、可變剪切體陣列和任何其他能夠提供本文所述標(biāo)記的表達(dá)的定性、定量或半定 量的陣列。某些類型的微陣列是可尋址的陣列。更具體地，一些微陣列是定位的、可尋址的 陣列。在一些實(shí)施方式中，陣列的每一個(gè)探針的位置是已知的。已知固體載體上的預(yù)定位 置，從而每個(gè)探針的身份（例如，序列）可以從其在陣列上（例如，載體或表面上）的位置 確定。在某些實(shí)施方式中，這些陣列是有序的陣列。微陣列一般描述于Draghici，2003，DNA 微陣列數(shù)據(jù)分析工具，Chapman和Hal 1/CRC，該文件全部內(nèi)容在此引入作為參考。
[0152] 5. 4. I. 2RT-PCR
[0153] 在某些實(shí)施方式中，為確定在一個(gè)或多個(gè)本文所述標(biāo)記的表達(dá)水平的生物標(biāo)記譜 中的生物標(biāo)記的特征值，該特征值的測(cè)量是通過使用逆轉(zhuǎn)錄（RT)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 從樣品中擴(kuò)增RNA。按照該實(shí)施方式，反轉(zhuǎn)錄可以定量或半定量的。本文所教導(dǎo)的RT-PCR 方法可以與上述的微陣列的方法結(jié)合使用。例如，可以進(jìn)行一個(gè)批量的PCR反應(yīng)，并且PCR 產(chǎn)物可被解析和用作微陣列上探針斑點(diǎn)。
[0154] 使用總RNA或mRNA作模板，并且與標(biāo)記（或多個(gè)）轉(zhuǎn)錄部分特異性配對(duì)的引物用 于啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的方法是眾所周知的，參照上述Sambrook等（2001年）。 可以根據(jù)已發(fā)表的或可從任何可公開獲得的序列數(shù)據(jù)庫，如GenBank中的已知核苷酸序列 設(shè)計(jì)引物。例如，可設(shè)計(jì)針對(duì)本文所述的任何標(biāo)記的引物。另外，可利用商購的軟件設(shè)計(jì)引 物（例如，Primer Designer LO和Scientific Software等）。反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物隨后被用作 PCR的模板。
[0155] PCR提供了一種通過使用由熱穩(wěn)定的、依賴DNA的DNA聚合酶催化多個(gè)循環(huán)的DNA 復(fù)制來擴(kuò)增感興趣的靶序列的快速擴(kuò)增特定核酸序列的方法。PCR反應(yīng)需要存在：被擴(kuò)增 的核酸、被擴(kuò)增核酸側(cè)翼的兩條單鏈寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸緩沖 液和鹽離子。PCR技術(shù)的方法是本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)。對(duì)PCR的使用可參考如Mullis和 Faloona，1987年，酶學(xué)方法，155:335。該文件全部內(nèi)容在此引入作為參考。
[0156] PCR擴(kuò)增需要模板DNA或cDNA (至少10fg，更有效地，I-IOOOng)和寡核苷酸引物 (至少25pmol)。典型的反應(yīng)混合物包括：2 μ I DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2. 5 μ I IOM PCR 緩沖 I (Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）、0· 4 μ I I. 25Μ 的 dNTP、0. 15 μ 1 (或 2. 5units)Taq DNA聚合酶（Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）和添加去離子水至總 體積25 μ 1。礦物油覆蓋PCR反應(yīng)體系，在用可編程熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0157] 定量RT_PCR( "QRT-PCR"）本質(zhì)是定量的，也可以提供對(duì)標(biāo)記表達(dá)水平的定量測(cè) 量。QRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)可以分兩步進(jìn)行，或者這兩個(gè)反應(yīng)可以同時(shí)發(fā)生。其中 一項(xiàng)技術(shù)使用特異轉(zhuǎn)錄的反義探針，通常有市售的試劑盒，如Applied Biosystems (福斯特 城，加利福尼亞州）的Taqman試劑盒（Perkin Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）。該探針 是特異性的PCR產(chǎn)物（例如，來自基因的核酸片段），并且含有猝滅基團(tuán)和絡(luò)合至所述寡核 苷酸5'末端的熒光報(bào)告基團(tuán)。不同的熒光標(biāo)記連接到不同的探針上，從而允許在一個(gè)反應(yīng) 中測(cè)量兩種探針。當(dāng)Taq DNA聚合酶被激活時(shí)，它利用其5'至3'外切酶活性清除結(jié)合于 模板上的熒光報(bào)告基團(tuán)。在不存在所述淬滅基團(tuán)時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)光。探針顏色的變化與每 一個(gè)特異性產(chǎn)物的含量成正比，并通過熒光計(jì)進(jìn)行測(cè)量。因此，可以測(cè)量每種顏色的量以及 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。所述PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，以便同時(shí)檢測(cè)許多不同來源的樣品。 所述的Taqman系統(tǒng)具有不需要凝膠電泳的附加優(yōu)點(diǎn)，并且使用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)可以定量分析。
[0158] 另一種可用于定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的技術(shù)使用一種嵌入染料，如市售的QuantiTect SYBR Green PCR(Qiagen公司，瓦倫西亞，加利福尼亞州）。在PCR反應(yīng)階段，SYBR Green染 料摻入雙鏈的PCR產(chǎn)物中，并且產(chǎn)生的熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物的量成正比。
[0159] RNA逆轉(zhuǎn)錄后都可以使用Taqman和QuantiTect SYBR系統(tǒng)。逆轉(zhuǎn)錄既可以在相同 的反應(yīng)體系作為PCR的步驟（一步法），也可以在PCR擴(kuò)增之前完成（兩步法）。此外，已 知的其它定量檢測(cè)mRNA表達(dá)的系統(tǒng)包括Molecular Beacons，該系統(tǒng)使用的探針具有熒光 分子和猝滅劑分子，這種探針可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)發(fā)夾形成時(shí)，熒光分子淬滅；當(dāng)探針雜 交至PCR產(chǎn)物時(shí)，發(fā)出熒光信號(hào)，根據(jù)雜交熒光信號(hào)的強(qiáng)度定量地檢測(cè)基因表達(dá)。
[0160] 5. 4. I. 3RNA 印跡試驗(yàn)
[0161] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何雜交技術(shù)可用于產(chǎn)生生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記的特 征值。在其他具體實(shí)施中，可通過RNA印跡分析獲得生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記的特征值（為 了定量特異的RNA分子）。按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的常規(guī)RNA雜交技術(shù)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 的RNA印跡可用于確定一種RNA轉(zhuǎn)錄物的大小，鑒定選擇性剪接的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，鑒定本文 所述的一個(gè)或多個(gè)基因在樣品中的相對(duì)量（尤其是mRNA)。在RNA印跡中，RNA樣本首先在 變性的瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)大小分離RNA，然后將RNA轉(zhuǎn)印至膜上，與標(biāo)記的探針交聯(lián) 和雜交?？梢允褂梅峭凰鼗蚋呋钚缘姆派湫詷?biāo)記的探針，包括隨機(jī)引發(fā)的、缺口轉(zhuǎn)移的、 或PCR產(chǎn)生的DNA探針、在體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針和寡核苷酸。另外，僅部分同源的序列（例 如，來自不同物種的cDNA或可能含有一個(gè)外顯子的基因組DNA片段）可以用作探針。標(biāo)記 的探針，例如放射性標(biāo)記的cDNA，要么包含全長、單鏈的DNA，要么是該DNA序列的片段，其 長度可以是至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少50個(gè)或至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸。可通過本技術(shù) 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的許多不同方法中的任何方法標(biāo)記探針。最常用于這些研宄的標(biāo)記是 放射性元素、酶、暴露于紫外時(shí)會(huì)發(fā)出熒光的化學(xué)物質(zhì)以及其它。許多熒光物質(zhì)是已知的并 且可以用作標(biāo)記。這些包括但不限于熒光素、羅丹明、金胺、得克薩斯紅、AMCA藍(lán)和熒光黃。 可以通過任何目前可用的計(jì)數(shù)方法來檢測(cè)放射性標(biāo)記。同位素包括但不限于3H、14C、32P、 35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I 和 186Re。酶標(biāo)記也是可用的，并且可以 通過任何現(xiàn)有的比色法、分光光度法、熒光光度法、電流分析法或氣體定量技術(shù)檢測(cè)。該酶 通過與橋接分子如碳化二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等反應(yīng)，偶聯(lián)于選擇的粒子?？梢允褂?本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種酶。這種酶的實(shí)例包括但不限于過氧化物酶、β -D-半乳糖 苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶?？蓞⒖济绹鴮＠?hào)3654090、3850752 和 4016043。
[0162] 5. 4. 2檢測(cè)蛋白的方法
[0163] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，可以通過檢測(cè)蛋白質(zhì)獲得生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記 特征值，例如，通過檢測(cè)本文所述的一種或多種標(biāo)記的表達(dá)產(chǎn)物（如核酸或蛋白質(zhì)）、或翻 譯后修飾的蛋白質(zhì)、或其它修飾的蛋白質(zhì)、或經(jīng)加工的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中， 可通過檢測(cè)和/或分析本文公開的標(biāo)記表達(dá)的一種或多種蛋白質(zhì)和/或其識(shí)別片段產(chǎn)生生 物標(biāo)記譜，其中，檢測(cè)和/或分析蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，包括但不 限于蛋白質(zhì)微陣列分析、免疫組織化學(xué)和質(zhì)譜分析。
[0164] 免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于檢測(cè)檢測(cè)蛋白質(zhì)的量和細(xì)胞培養(yǎng)物中目的蛋白。例 如，先進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫 共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)的量和樣本中感興趣的蛋白，其它檢測(cè)方法還有免疫化學(xué)等。用于檢測(cè) 目的蛋白質(zhì)的一種示例性試劑是能夠特異性結(jié)合到目的蛋白的抗體。優(yōu)選可檢測(cè)標(biāo)記的抗 體，不管是直接還是間接標(biāo)記。
[0165] 對(duì)于這樣的檢測(cè)方法，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)很容易分離得到在細(xì)胞培 養(yǎng)物中想要分析的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分離方法可參考，例如Harlow和Lane，1988年，抗體：實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（冷泉港，紐約），該文件全部內(nèi)容在此引入作為參考。
[0166] 在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)蛋白質(zhì)或目的蛋白的方法涉及蛋白質(zhì)一特異性抗體的相 互作用。例如，抗體導(dǎo)向目的蛋白?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生抗體。在 具體的實(shí)施方式中，抗體可以是多克隆抗體，或更優(yōu)選的是單克隆抗體?？梢允褂猛暾目?體或抗體片段（例如，單鏈抗體，F(xiàn)ab或F(ab'） 2。
[0167] 例如，能特異性結(jié)合目的蛋白的抗體或抗體片段可以用來定量或定性檢測(cè)蛋白質(zhì) 的存在。以上所述可以通過例如免疫熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)。另外，可以使用抗體（或其片段）在 組織學(xué)中原位檢測(cè)目的蛋白，如免疫熒光或免疫電鏡術(shù)?？赏ㄟ^從病人取生物樣本（如活 檢樣本）并對(duì)其添加針對(duì)目的蛋白的抗體完成原位檢測(cè)。施用抗體（或片段）時(shí)，優(yōu)選使 抗體（或片段）覆蓋生物樣本。通過使用這樣的方法，在特定的樣本中有可能不僅檢測(cè)目 標(biāo)蛋白是否存在，還檢測(cè)其分布。多種已知的組織學(xué)的方法（如染色方法）可實(shí)現(xiàn)這種原 位檢測(cè)。
[0168] 檢測(cè)目的蛋白的免疫測(cè)定法通常包括可檢測(cè)標(biāo)記的抗體與樣品溫育，該抗體能夠 鑒定目的蛋白。此外，免疫測(cè)定法還包括利用本領(lǐng)域所公知的任何技術(shù)檢測(cè)結(jié)合的抗體。為 下面更詳細(xì)地討論，術(shù)語"標(biāo)記"可以指直接標(biāo)記抗體，如耦合（也就是物理上連接）可檢 測(cè)的物質(zhì)到抗體上，也可指間接標(biāo)記抗體，該抗體通過與其它直接標(biāo)記的物質(zhì)反應(yīng)。間接標(biāo) 記的實(shí)例包括用熒光標(biāo)記第二抗體對(duì)第一抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0169] 該樣品可接觸固相支持物或載體如硝酸纖維素，或能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆粒或可溶 蛋白的其他固相支持物或載體。然后用適宜的緩沖液洗滌該支持物，接著用可檢測(cè)標(biāo)記的 指紋基因一特異性抗體處理。緊接著用緩沖液第二次洗滌固相支持物，以除去未結(jié)合的抗 體。最后可以通過常規(guī)的方法來檢測(cè)結(jié)合在固相支持物上標(biāo)記的量。
[0170] "固相支持物或載體"是指能夠結(jié)合抗原或抗體的任何支持物。熟知的支持物或載 體包括玻璃、聚苯乙稀、聚丙稀、聚乙稀、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯 酰胺和磁鐵礦。載體的性質(zhì)在一定程度上是可溶的，或?qū)τ诒景l(fā)明的目的是不可溶的。所 述載體材料可以具有任何可能的構(gòu)型，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。因此，支撐結(jié) 構(gòu)可以是球形，如珠子；或圓柱形的，如在試管的內(nèi)表面，或棒的外表面。優(yōu)選的支持物包括 聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道很多其它合適的、用于結(jié)合抗體或抗原的載體，或?qū)?能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。
[0171] 能夠可檢測(cè)地標(biāo)記特異地針對(duì)目的蛋白的抗體的一種方法是將該抗體與酶相連， 然后用于酶免疫分析（EIA)(可參照 Voller，1978，〃The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)〃， Diagnostic Horizons 2:1-7， Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md. ;Voller et al.，1978，J. Clin. Pathol. 31:507-520 ; Butler，J. E.，1981，Meth.Enzymol. 73:482-523 ;Maggio(ed.)，1980, Enzyme Immunoassay， CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la. ;Ishikawa 等，（eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo。每一個(gè)文件的全部內(nèi)容在此引入作為參考）。與抗體結(jié)合的酶與合適的底物 反應(yīng)，優(yōu)選為顯色底物。通過以這樣的方式，如過分光光度法、熒光法或視覺手段檢測(cè)產(chǎn)生 可檢測(cè)的化學(xué)物質(zhì)。可以用于可檢測(cè)標(biāo)記抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌 核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根 過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、 過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。所述檢測(cè)可以通過使用 比色方法完成，該方法采用酶的顯色底物。還可以通過將酶與底物反應(yīng)的程度與類似制備 的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行肉眼比較以完成檢測(cè)。
[0172] 還可以用各種其它免疫方法中的任何一種方法完成檢測(cè)。例如，利用放射性標(biāo)記 的抗體或抗體片段，可通過使用放射免疫測(cè)定法（RIA)檢測(cè)目的蛋白（參見，例如，溫特勞 布，1986,放射免疫測(cè)定原理，第七次培訓(xùn)課程放射性檢測(cè)技術(shù)，內(nèi)分泌學(xué)會(huì)，在此通過引用 將其整體并入本文）。放射性同位素（例如125I、131I、35S或3Η)可以通過如使用γ計(jì)數(shù) 器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影來檢測(cè)。
[0173] 另外，也可以用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)波長的光，就 能通過熒光檢測(cè)抗體的存在。其中最常用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻 紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰-苯二醛和熒光胺。
[0174] 也可以用發(fā)出熒光的金屬可檢測(cè)性地標(biāo)記抗體，如152EU或其它鑭系元素。這些 金屬可以通過金屬螯合基團(tuán)如二亞乙基三乙酸（DTPA)或乙二胺四乙酸（EDTA)連接到抗 體。
[0175] 還可以通過將抗體偶聯(lián)到化學(xué)發(fā)光的化合物上實(shí)現(xiàn)可檢測(cè)性地標(biāo)記抗體。檢測(cè)化 學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光就可以確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物 是魯米諾、異魯米諾、染色吖啶酯、咪唑、叮啶鹽和草酸酯。
[0176] 同樣地，生物發(fā)光化合物可用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā) 現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光，其中，催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率?？赏ㄟ^檢測(cè)發(fā)光的存在 來確定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標(biāo)記目的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和 水母發(fā)光蛋白。
[0177] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，除了抗體，特異性結(jié)合的分子如核酸適配體可用于結(jié)合生 物標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物標(biāo)記譜可包括傳染性病原體中可檢測(cè)的部分（例如，月旨 多糖或病毒蛋白）或其組分。
[0178] 在某些實(shí)施方式中，使用蛋白質(zhì)芯片測(cè)定法（例如，Protdr丨Chip?生物標(biāo)志 物系統(tǒng)，賽弗吉，弗里蒙特，加州）檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記特征值。也參見，例 如，Lin, 2004, Modern Pathology，l_9;Li，2004, Journal of Urology 171,1782-1787; Wadsworth, 2004, Clinical Cancer Research, 10, 1625-1632 ；Prieto,2003,Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies 26,2315-2328 ;Coombes，2003,Clinical Chemistry 49, 1615-1623 ；Mian,2003, Proteomics 3, 1725-1737 ；Lehre et al.,2003, BJU International 92, 223-225 ;和 Diamond，2003, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14, 760-765。其每一個(gè)在此通過引用以其整體并入本文D
[0179] 在一些實(shí)施方式中，珠測(cè)定法用于檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記特征值。Becton Dickinson公司的流式微球陣列法系統(tǒng)（CBA)就是一種珠測(cè)定法a CBA使用一系列顆粒與 離散的熒光強(qiáng)度同時(shí)檢測(cè)多種可溶性分析物。CBA與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合創(chuàng)建一種多元分析。 Becton Dickinson公司CBA的系統(tǒng)，具體的例子如Becton Dickinson人炎癥試劑盒，在基 于顆粒的免疫測(cè)定中，使用流式細(xì)胞術(shù)放大熒光檢測(cè)的靈敏度檢測(cè)可溶性分析物。CBA中的 每顆珠提供特異性蛋白的捕獲表面，類似于ELISA平板中單獨(dú)包被的孔。BD公司的CBA捕 獲珠復(fù)合物是懸浮的，以致于容許檢測(cè)多種小體積的化合物。
[0180] 在一些實(shí)施方式中，多重分析方法在美國專利5981180(下稱"180專利"）中描 述，通過引用將其整體并入，特別是用于教導(dǎo)通用方法、珠技術(shù)、系統(tǒng)硬件和抗體檢測(cè)，并且 用來檢測(cè)生物標(biāo)記譜的生物標(biāo)記。為了這種分析，合成微粒的基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含由不 同組的微粒組成。每組微粒可以有數(shù)千個(gè)不同的抗體俘獲試劑的分子固定在微粒表面并且 是顏色便編碼的，因?yàn)閾饺肓瞬煌康膬煞N熒光染料。兩種熒光染料的比率為每組微粒提 供了一個(gè)不同的發(fā)射光譜，因此鑒定微粒群中的微粒。美國專利號(hào)6268222和6599331也 都通過引用的方式整體并入，特別是用于教導(dǎo)標(biāo)記的微粒進(jìn)行多重分析的各種方法。
[0181] 5. 4. 3其它檢測(cè)方法
[0182] 在一些實(shí)施方式中，分離方法可以用于檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記特征值，以 至于能分析標(biāo)本中生物標(biāo)記的一個(gè)子集。例如，被分析的生物標(biāo)記可以是來自細(xì)胞提取物 的mRNA。這些細(xì)胞提取物已經(jīng)被分餾，僅僅獲得核酸生物標(biāo)記，或者這些生物標(biāo)記可以來自 樣本中蛋白總補(bǔ)體的一部分，其中，該樣本已經(jīng)通過色譜技術(shù)分餾。
[0183] 還可以通過使用如下所述的一種或多種方法產(chǎn)生生物標(biāo)記譜中的生物標(biāo)記的特 征值。例如，可包括核磁共振（NMR)波譜、質(zhì)譜法，如電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS)、ESI-MS/ MS、ESI-MSAMS) η (η是一個(gè)大于零的整數(shù)）、激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS)、 表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-T0F-MS)、解吸/電離上硅（DI0S)、二次 離子質(zhì)譜（SIMS)、四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF)、大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（APCI-MS)、 APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大氣壓光電離質(zhì)譜（APPI-MS)、APPI-MS/MS 和 APPI-(MS)n。其它 質(zhì)譜方法可包括，尤其是四極、傅里葉變換質(zhì)譜（FTMS)和離子阱。其它合適的方法可包括 化學(xué)提取分配、柱層析、離子交換層析、疏水（反相）液相色譜法、等電聚焦、一維聚丙烯酰 胺凝膠電泳（PAGE)、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-PAGE)或其它色譜法，例如薄層、氣相或 液相色譜法，或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物樣品可在應(yīng)用分離方法前先分 饋。
[0184] 在一個(gè)實(shí)施方式中，激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于檢測(cè)生物標(biāo)記譜中的生 物標(biāo)記的特征值，其中所述生物標(biāo)記是蛋白或蛋白片段，它們被離子化，并被激光輻射而 蒸發(fā)至固定的支持物。特征值是存在或不存在的峰，而所述峰代表這些碎片在質(zhì)譜的模 式。各種激光解吸/離子化技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，可參見Guttman et等，2001，Anal. Chem. 73:1252-62和Wei等，1999,Nature 399:243-246。每個(gè)內(nèi)容通過引用的方式將其整 體并入。
[0185] 激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠在一段相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)生成大量的信息。將生 物樣品加至不同樣的載體上，所述生物樣品或其子集結(jié)合所有的生物標(biāo)記。經(jīng)過或未經(jīng)過 純化或分餾的細(xì)胞裂解物或樣品，以體積低至〇. 5 μ L直接施加到這些載體表面。在施加至 載體表面之前，可將裂解物或樣品濃縮或稀釋。然后用于生成樣本或樣品激光解吸/電離 質(zhì)譜，所用時(shí)間只需要短短3小時(shí)。
[0186] 5. 5數(shù)據(jù)分析算法
[0187] hES-MSC生物標(biāo)記的表達(dá)譜是區(qū)分臨床級(jí)別和非臨床級(jí)別hES-MSC的參考因素。 這些生物標(biāo)記的識(shí)別及其相對(duì)應(yīng)的功能（例如，表達(dá)水平）可用于建立一個(gè)或多個(gè)的決 策規(guī)則。特定數(shù)據(jù)分析算法建立的一個(gè)或多個(gè)決策規(guī)則，可區(qū)分臨床級(jí)別和非臨床級(jí)別 hES-MSC。一旦使用這些典型的數(shù)據(jù)分析算法或本領(lǐng)域中已知的其它技術(shù)建立決策規(guī)則，這 些決策規(guī)則將被用于把hES-MSC群分類為兩個(gè)或更多的級(jí)別（例如臨床級(jí)別和非臨床級(jí) 別）。這是通過將決策規(guī)則應(yīng)用于從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的生物標(biāo)記譜實(shí)現(xiàn)的。因些，這樣的決 策規(guī)則在定義hES-MSC的質(zhì)量時(shí)具有巨大的價(jià)值。
[0188] 在某個(gè)實(shí)施方式中，本文提供了一種用于比較從待測(cè)和對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的生 物標(biāo)記譜的評(píng)價(jià)方法。在某些實(shí)施方式中，從對(duì)照群或待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的每種生物標(biāo) 記譜包括多個(gè)生物標(biāo)記譜中的其中一項(xiàng)特征值。在一些實(shí)施方式中，這種比較是通過：（i) 使用對(duì)照群的生物標(biāo)記建立一種決策規(guī)則；（ii)將所述決策規(guī)則應(yīng)用于待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物 的生物標(biāo)記譜。這樣，本發(fā)明的一些實(shí)施方式中應(yīng)用的決策規(guī)則用于確定待測(cè)細(xì)胞是臨床 級(jí)別或非臨床級(jí)別。在其它實(shí)施方式中，對(duì)照群是BM-MSC。
[0189] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，當(dāng)應(yīng)用決策規(guī)則鑒定待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物是臨床級(jí)別 hES-MSC時(shí)，可用作治療。如果鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)是非臨床級(jí)別，那么不能用作治療。
[0190] 5.5MSC 的修飾
[0191] 本文提供一種修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)一群免疫抑制功能獲得提升的MSC群的 方法。所述MSC具有以下特征：⑴含有>95%的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)含有>80%的細(xì) 胞表達(dá)組-2標(biāo)記；（iii)含有〈5 %的細(xì)胞表達(dá)組-3標(biāo)記；（iv)表達(dá)IL-10和TGF β ; (V) 含有〈2 %的細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-12和TNF a ; (Vi)含有〈〇. 001 %的細(xì)胞共表達(dá)所有組-4 標(biāo)記。所述組-1標(biāo)記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44 ;組-2標(biāo)記是：⑶13、 CD29、CD54 和 CD49E ;組-3 標(biāo)記是 CD45、CD34、CD31 和 SSEA4 ;組-4 標(biāo)記是：0CT4、NANOG、 TRA-1-60 和 SSEA4。
[0192] 本文提供一種通過提高AIF表達(dá)而提升hES-MSC的免疫抑制功能的方法。在一個(gè) 實(shí)施中，所述方法包括下調(diào)PIF的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括下調(diào)IL6、IL12、 TNF a、RAGE和其他PIF在hES-MSC的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括上調(diào)TGF β 和IL-10在T-MS的表達(dá)。
[0193] 在某些實(shí)施方式中，所述方法包括hES-MSC的遺傳和表觀遺傳修飾，所述修飾是 本領(lǐng)域已知的。在某些實(shí)施方式中，遺傳修飾和表觀遺傳修飾包括但不限于敲除、小發(fā)夾 RNA( "shRNA"）、微小非編碼RNA( "miRNA"）、非編碼RNA( "ncRNA"）、嗎啉寡聚核苷酸、誘 餌RNA、DNA甲基化調(diào)控、組蛋白甲基化調(diào)控、翻譯抑制和/或抗體封閉。在某些實(shí)施方式 中，通過轉(zhuǎn)座子、toll樣受體配體或小分子修飾MSC。
[0194] 在某些實(shí)施方式中，使用小分子靶向作用IL-6信號(hào)通路的任何元件。在某些實(shí)施 方式中，所述靶標(biāo)包括但不限于gpl30、STAT3、組織蛋白酶S、NFkappaB和IRF5。在某些實(shí) 施方式中，通過以下方式使hES-MSC的IL-12表達(dá)減少：前列腺素 E2信號(hào)通路激活；胞內(nèi)環(huán) 腺苷酸（cAMP)以及cAMP激動(dòng)劑包括但不限于毛喉素、霍亂毒素 、β 1和β 2腎上腺素受體 的水平上升；NF-κ B Rel-B信號(hào)通路被抑制；使用凋亡細(xì)胞處理hES-MSC;使用磷脂酰絲氨 酸處理hES-MSC ;使用丁酸鹽處理hES-MSC ;使用雷公藤甲素或雷公藤提取物或合成的雷公 藤甲素（即 Minnelide)處理 hES-MSC。
[0195] 在某些實(shí)施方式中，可利用重組基因領(lǐng)域所熟知的技術(shù)修飾MSC使其表達(dá)某一標(biāo) 記。在某些實(shí)施方式中，可通過轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的核酸序列修飾MSC。所述標(biāo)記可插入適當(dāng) 的表達(dá)載體，即含有對(duì)插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體。必要的轉(zhuǎn)錄和 翻譯元件也可以存在。調(diào)節(jié)區(qū)和增強(qiáng)子元件可以是各種來源的，天然的和合成的。多種宿 主-載體系統(tǒng)可用于表達(dá)所述標(biāo)記。這些載體系統(tǒng)包括但不限于感染病毒（如病毒、牛痘 病毒、腺病毒等）的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；感染病毒（如桿狀病毒）的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物 如包含酵母載體的酵母和轉(zhuǎn)化噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA、粘粒DNA的細(xì)菌；通過使用可選擇標(biāo) 記轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的穩(wěn)定細(xì)胞系。載體表達(dá)元件的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)各不相同。根據(jù)使用的宿主-載 體系統(tǒng)，可以使用許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個(gè)。
[0196] -旦合成編碼合適標(biāo)記的載體，可將目的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述MSC。
[0197] 可使用標(biāo)準(zhǔn)方法將目的核酸序列引入所述MSC。可以通過任何已知的將多核苷酸 引入宿主細(xì)胞的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，包括如將多核苷酸包裝入病毒并將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞， 或直接攝入多核苷酸。哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化（即轉(zhuǎn)染），可通過磷酸鈣沉淀法（參見Graham和Van der Eb，1978, Virol. 52:546,）或已知修飾的病毒直接攝入。將重組多核苷酸引入細(xì)胞， 尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裝于脂質(zhì)體、將多核苷酸在顯微鏡下直接注射至 細(xì)胞核。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0198] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施中，含有目的載體的穩(wěn)定細(xì)胞系用于高通量篩選。這種穩(wěn)定細(xì) 胞系的制備可通過引入包含可選擇的標(biāo)記載體，允許細(xì)胞在完全培養(yǎng)基生長1 一 2天，然后 使細(xì)胞生長在選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)記賦予選擇選擇抗性，并且允許在染 色體中穩(wěn)定整合該重組質(zhì)粒的細(xì)胞永生，進(jìn)而形成克隆和擴(kuò)增為細(xì)胞系。
[0199] 可以使用的選擇系統(tǒng)有多種，包括但不限于單純皰瘆病毒胸苷激酶（參見 Wigle等.，1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（參見Szybalska和 Szybalski，1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)和腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（參見 Lowy，et al.，1980, Cell 22:817)，這些基因可分別在tk敲除、hgprt敲除或aprt敲除的 細(xì)胞中使用。另外，可以將抗代謝物抗性用作選擇，例如，dhfr能產(chǎn)生氨甲蝶呤的抗性（參 見 Wigler 等.，1980，Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 ;0' Hare，等，1981，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:1527) ;gpt 能產(chǎn)生對(duì)霉酚酸的抗性（參見Mulligan*Berg，1981，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78:2072) ;neo 能產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷 G418 的抗性（Colberre-Garapin 等， 1981，J. Mol. Biol. 150:1) ;hygro 能產(chǎn)生對(duì)潮霉素的抗性（參見 Santerre 等·，1984, Gene 30:147)〇
[0200] 5. 6干細(xì)胞采集組合物
[0201] 干細(xì)胞采集組合物可包括任何生理上可接受的適合于收集和/培養(yǎng)干細(xì)胞的溶 液，例如鹽溶液（如磷酸鹽緩沖液、Kreb溶液、改良的Kreb溶液、Eagle溶液、0. 9% NaCl溶 液等）和培養(yǎng)基（如DMEM、H. DMME等），等等。
[0202] 干細(xì)胞采集組合物可包含保護(hù)干細(xì)胞的一種或多種組分，即從收集到培養(yǎng)之間， 防止干細(xì)胞免于死亡，或延遲干細(xì)胞的死亡，或減少死亡細(xì)胞群的干細(xì)胞的數(shù)量，等等。這 樣的組分可以是，例如凋亡抑制劑（例如半胱天冬酶抑制劑或JNK抑制劑）；血管擴(kuò)張劑 (例如硫酸鎂、抗高血壓藥物、心房利鈉肽（ANP)、促腎上腺皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋 放激素、硝普鈉、肼苯噠嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯酶抑制劑等）； 壞死抑制劑（例如，2-(1Η-吲哚-3-基）-3-戊氨基-馬來酰亞胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸 酯或氯硝西泮）；TNF_a抑制劑；攜氧全氟化碳（如全氟辛基溴、全氟癸基溴等）。
[0203] 干細(xì)胞采集組合物可包含一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白 酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶，等等。這類酶包括但不限于膠原酶（例如 膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌的膠原酶等）、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、 胰蛋白酶、釋放酶、透明質(zhì)酸酶，等等。
[0204] 干細(xì)胞采集組合物可包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性的實(shí)施方 式中，所述抗生素是大環(huán)內(nèi)酯（例如妥布霉素）、頭孢菌素（例如頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢 呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐）、克拉霉素、紅霉素，青霉素（例如青霉 素 V)或喹諾酮類（例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星）、四環(huán)素、鏈霉素等。
[0205] 干細(xì)胞采集組合物還可以包含以下的一種或多種化合物：腺苷（約ImM至約 50mM) ;D-葡萄糖（約20mM至約IOOmM);鎂離子（約ImM至約50mM);分子量大于20000道 爾頓的大分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，以下物質(zhì)的含量足以維持內(nèi)皮完整性和細(xì)胞活性，例 如，合成的或天然的膠體，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，約25g/L至約100g/L，或約40g/L 至約60克/L ;抗氧化劑，例如丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素 C或維生 素 E，約25 μ M至約100 μ M ;還原劑，例如約0. ImM至約5mM的N-乙酰半胱氨酸；阻止鈣離 子進(jìn)入細(xì)胞的藥劑，例如維拉帕米，約2微米至約25微米；抗凝血?jiǎng)Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方式中， 以下物質(zhì)的含量足以幫助防止殘留的血液凝固，例如肝素或水蛭素，約1000單位/1至約 100000單位/1 ;或含阿米洛利化合物，例如阿米洛利、乙基異丙基氨氯吡咪、六亞甲基氨氯 P比脒、二甲基氨氯啦咪或異丁基氨氯啦咪，約1. 〇 μΜ至約5 μΜ。
[0206] 5. 7 使用 hES-MSC 或 iPS-MSC 免疫調(diào)節(jié)
[0207] 本文提供一種或多種免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)（例如，下調(diào)細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞存活、 阻礙細(xì)胞迀移至炎癥位點(diǎn)、下調(diào)細(xì)胞促進(jìn)或延長炎癥的能力、提高細(xì)胞促進(jìn)健康組織或器 官的恢復(fù)體內(nèi)平衡的功能），這是通過免疫細(xì)胞（或細(xì)胞群）與多種hES-MSC或iPS-MSC接 觸實(shí)現(xiàn)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括多種免疫細(xì)胞和多種hES-MSC或 iPS-MSC接觸足夠長的時(shí)間以使hES-MSC或iPS-MSC可檢測(cè)地抑制免疫反應(yīng)。其中，在混合 淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)中，hES-MSC或iPS-MSC可檢測(cè)地抑制T細(xì)胞增殖。
[0208] 因?yàn)锽M-MSC或其它成體組織來源的MSC已經(jīng)被用來治療許多自身免疫性疾病， BM-MSC還通過限制炎癥、分泌生長因子、分泌保護(hù)因子和替換受損組織而應(yīng)用于組織修復(fù)。 在我們的實(shí)施方式中，顯示hES-MSC比BM-MSC具有更優(yōu)良的免疫抑制功能。因此，hES-MSC 可以應(yīng)用于當(dāng)前BM-MSC應(yīng)用的所有領(lǐng)域和疾病。
[0209] 用于免疫調(diào)節(jié)的hES-MSC或iPS-MSC可以分別從胚胎干細(xì)胞系或誘導(dǎo)的多能干細(xì) 胞系衍生或獲得。用于免疫調(diào)節(jié)的hES-MSC或iPS-MSC還可以來自與活性要被調(diào)節(jié)的免疫 細(xì)胞相同的物種；或者來自與活性要被調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞不同的物種。
[0210] 本方法的上下文中，"免疫細(xì)胞"是指免疫系統(tǒng)的任何細(xì)胞，特別是T細(xì)胞和NK(自 然殺傷）細(xì)胞。因此，在本方法各種實(shí)施方式中，hES-MSC和多種細(xì)胞接觸。其中所述的多 種細(xì)胞，是或者包括多種T細(xì)胞（例如，多種CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞） 和/或自然殺傷細(xì)胞。在方法的上下文中，"免疫應(yīng)答"可以是免疫細(xì)胞對(duì)由免疫細(xì)胞發(fā)出 的通常可感知刺激的任何反應(yīng)，例如對(duì)抗原出現(xiàn)的反應(yīng)。在各種實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答可以 是T細(xì)胞（CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞）增殖以應(yīng)答外來抗原，其中，外來抗 原是例如在自身免疫性疾病中、輸血或移植物的抗原。免疫應(yīng)答也可以是包含在移植物內(nèi) 的T細(xì)胞的增殖。免疫應(yīng)答也可以是自然殺傷細(xì)胞的任何活性、樹突細(xì)胞的成熟，等等。免 疫應(yīng)答也可以是活躍的一種或多種免疫細(xì)胞在局部、組織或器官中特異性的或系統(tǒng)性的作 用。免疫應(yīng)答可以是移植物抗宿主病、炎癥、形成炎癥相關(guān)瘢痕組織、自身免疫癥狀（例如 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等），等等。
[0211] 在此上下文中的"接觸"包括：把hES-MSC細(xì)胞和免疫細(xì)胞一起放在單個(gè)容器（例 如培養(yǎng)皿、燒瓶、小瓶等）或在體內(nèi)，例如同一個(gè)體（例如哺乳動(dòng)物，例如人）。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方式中，接觸的時(shí)間是足夠長的，并且hES-MSC細(xì)胞和免疫細(xì)胞數(shù)量足夠多，以致免疫 細(xì)胞的免疫功能的改變是可檢測(cè)的。更優(yōu)選地，在各種實(shí)施方式中，所述接觸足以抑制免疫 功能（如T細(xì)胞增殖響應(yīng)抗原），與不存在hES-MSC相比較，hES-MSC抑制至少50 %、60 %、 70%、80%、90%或95%的免疫功能。這種在體內(nèi)的抑制可在體外測(cè)定，也就是說，可以在體 外的試驗(yàn)中推測(cè)特定數(shù)量的hES-MSC在接受者體內(nèi)對(duì)若干免疫細(xì)胞的抑制程度。
[0212] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供使用hES-MSC在體外調(diào)節(jié)一種或多種類型免疫細(xì) 胞的多個(gè)免疫反應(yīng)或活性的方法。hES-MSC和多個(gè)免疫細(xì)胞接觸可以包括T細(xì)胞和免疫細(xì) 胞在同樣的實(shí)體空間集合，這樣，至少多個(gè)hES-MSC的其中一部分和多個(gè)免疫細(xì)胞的其中 一部分相互作用；或可以包括，來自hES-MSC或免疫細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和其它類型細(xì)胞 接觸（例如，從hES-MSC的培養(yǎng)物得到的培養(yǎng)基和在這個(gè)培養(yǎng)基中重新懸浮的分離的免疫 細(xì)胞）。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】，接觸是一個(gè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)。
[0213] 例如，這樣的接觸可以發(fā)生在一個(gè)檢測(cè)hES-MSC免疫調(diào)節(jié)（如免疫抑制）程度的 試驗(yàn)裝置中。這樣的試驗(yàn)裝置可以是，例如混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)或回歸分析。混合淋 巴細(xì)胞反應(yīng)和回歸分析是本領(lǐng)域所熟知的，可參見如：Schwarz, "The Mixed Lymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance,^J. Exp. Med. 127(5):879-890(1968)； Lacerda 等，''Human Epstein-Barr Virus (EBV) -Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C. B_17Scid/Scid Mice, 〃J. Exp. Med. 183:1215-1228 (1996)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)在多個(gè)hES-MSC 和多個(gè)免疫細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞，例如⑶3+⑶4+和/或⑶8+的T淋巴細(xì)胞）接觸中進(jìn)行。
[0214] 該MLR可用來測(cè)定多個(gè)hES-MSC的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中檢測(cè)多個(gè) hES-MSC，該MLR包括按，例如約10:1:2的比率結(jié)合CD4+或CD8+T細(xì)胞、樹突細(xì)胞（DC)以 及hES-MSC，其中利用染料，例如分配進(jìn)入子細(xì)胞的CFSE (作為舉例），對(duì)該T細(xì)胞染色，以 及允許該T細(xì)胞增殖約6天。與存在DC以及不存在hES-MSC時(shí)相比較，如果T細(xì)胞増殖在 存在hES-MSC 6天時(shí)是可檢測(cè)到是降低的，則該多個(gè)hES-MSC是具有免疫抑制能力的。在 這樣的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，hES-MSC可以是解凍的，也可以是從培養(yǎng)物中收集的。將約 10000個(gè)hES-MSC重懸在100 μ 1培養(yǎng)基中（RPMI 1640, ImM HEPES緩沖液、抗生素和5%混 合人血清），并使其附著到皿底2小時(shí)。利用免疫磁珠從全外周血單核細(xì)胞分離CD4+和/ 或⑶8+Τ細(xì)胞。這些細(xì)胞是CFSE染色的，并且總共100000個(gè)T細(xì)胞（僅添加⑶4+，僅添加 ⑶8+，或等量的⑶4+和⑶8+Τ細(xì)胞）添加至每個(gè)孔。將每個(gè)孔液體的體積補(bǔ)至200 μ 1，并 允許進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
[0215] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種抑制免疫細(xì)胞反應(yīng)的方法，其中，在混 合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，多個(gè)免疫細(xì)胞和多個(gè)hES-MSC接觸足夠長的時(shí)間以使hES-MSC可檢測(cè) 地抑制T細(xì)胞增殖。
[0216] 從不同胚胎干細(xì)胞系獲得的hES-MSC群可以在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的能力方面有 所不同，例如可以在抑制T細(xì)胞活性或増殖或NK細(xì)胞活性的能力方面不同。因此，需要在 使用前測(cè)定特定的hES-MSC群的免疫抑制能力。這類能力可以在，例如MLR或回歸分析中 通過檢測(cè)該羊膜來源貼壁細(xì)胞群的樣本來測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方式中，用所述樣本執(zhí)行MLR 以及在所述分析中測(cè)定該hES-MSC群引起的免疫抑制程度。然后，可以將該免疫抑制程度 歸因于所取樣的hES-MSC群。因此，該MLR可以用作一種測(cè)定特定hES-MSC群免疫抑制 功能的絕對(duì)和相對(duì)能力的方法。MLR參數(shù)可以是多樣化的，以提供更多數(shù)據(jù)或更好地測(cè)定 hES-MSC樣本的免疫抑制能力。例如，因?yàn)閔ES-MSC產(chǎn)生的免疫抑制看起來以與該分析中存 在的hES-MSC的數(shù)量成比例的方式粗略增長，因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以用兩個(gè)或更多 數(shù)量的hES-MSC群（例如每個(gè)反應(yīng)I X 103、3 X 103、I X IO4和/或3 X 10 4個(gè)hES-MSC)執(zhí)行 該MLR。該分析中，hES-MSC與T細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量還可以是多變的。例如，雖然可以使用相 對(duì)大量的hES-MSC或T細(xì)胞，但是，該分析中，hES-MSC和T細(xì)胞可以按任何比率（例如約 100:1至約1:100,優(yōu)選地約1:5)存在。
[0217] 本發(fā)明也提供在體內(nèi)使用hES-MSC調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)或調(diào)節(jié)一種或多種免疫細(xì)胞的 多個(gè)活性的方法。hES-MSC和免疫細(xì)胞可以，例如在作為多個(gè)hES-MSC的接受者的個(gè)體 中接觸。當(dāng)該接觸在個(gè)體中進(jìn)行時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方式中，該接觸發(fā)生在hES-MSC(也就是， hES-MSC并非來源于該個(gè)體）和對(duì)該個(gè)體來說是內(nèi)源性的多個(gè)免疫細(xì)胞之間。在具體的實(shí) 施方式中，該個(gè)體的免疫細(xì)胞是CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞。
[0218] 使用hES-MSC帶來的免疫抑制對(duì)于任何情況引起的或惡化的、或相關(guān)的、或不期 望的免疫反應(yīng)是有好處的。hES-MSC介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)，如免疫抑制，將，例如有利于抑制不適 當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，該免疫反應(yīng)是由個(gè)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗一個(gè)或多個(gè)它自己的組織所引起。因此， 本發(fā)明提供了一種抑制免疫反應(yīng)的方法，其中，所述免疫反應(yīng)是自身免疫性疾病，如全身性 紅斑狼瘡、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥。
[0219] 多種hES-MSC和一種或多種類型的多種免疫細(xì)胞的接觸可發(fā)生在接受者個(gè)體內(nèi)， 該接受者被嫁接或移植一種或多種組織，或者這些細(xì)胞作為附加物一并嫁接或移植。這些 組織可以是，例如骨髓或血液、器官、特異的組織（如皮膚移植）、復(fù)合組織（如移植物包含 兩種或多種組織）等等。就這一點(diǎn)而言，hES-MSC可以用于抑制一種或多種免疫細(xì)胞的一 種或多種免疫反應(yīng)，所述免疫細(xì)胞包含在接受者個(gè)體、或移植組織、或嫁接組織或兩個(gè)組織 中。這種接觸可發(fā)生在嫁接或移植之前、期間和/或之后。例如，可以在移植或嫁接的時(shí)候 給予hES-MSC處理?；蚩蛇x擇性地，也可在移植或嫁接前給予hES-MSC處理，例如約移植或 嫁接前1、2、3、4、5、6、7天?；蚩蛇x擇性地，也可在移植或嫁接后給予1^5-1^(：處理，例如移 植或嫁接后約1、2、3、4、5、6、7天。優(yōu)選地，在免疫反應(yīng)的任何可檢測(cè)的信號(hào)或癥狀出現(xiàn)前， 就要使多個(gè)T細(xì)胞和多個(gè)hES-MSC相接觸。這種可檢測(cè)信號(hào)或癥狀可以是接受者個(gè)體或移 植組織或嫁接物的，如移植物抗宿主病或可檢測(cè)的炎癥的可檢測(cè)的信號(hào)或癥狀。
[0220] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，在個(gè)體內(nèi)的接觸主要是外源的HES-MSC和內(nèi)源的祖細(xì)胞或 干細(xì)胞，如分化成免疫細(xì)胞的內(nèi)源祖細(xì)胞或干細(xì)胞。例如，處于部分或全部的免疫凈化療法 或骨髓細(xì)胞清除的個(gè)體，可接受HES-MSC結(jié)合一種或多種類型的干細(xì)胞或祖細(xì)胞作為癌癥 治療的附屬物。例如，hES-MSC可結(jié)合多個(gè)⑶34+細(xì)胞，如⑶34+造血干細(xì)胞。這些⑶34+ 細(xì)胞可以是例如來自組織，比如周邊血液、臍帶血、胎盤血或骨髓。這些⑶34+細(xì)胞可從以 上所述組織分離，或來源整個(gè)組織（例如，整個(gè)臍帶血或骨髓）或組織的部分純化的樣品 (例如來自臍帶的白細(xì)胞），這些細(xì)胞可與HES-MSC結(jié)合。
[0221] 該hES-MSC可以施用至個(gè)體，其中該hES-MSC與該個(gè)體中已知或期望的免疫細(xì)胞 (例如T細(xì)胞）數(shù)量的比率從約10:1至約1:10,優(yōu)選地約1:5。然而，在非限制性實(shí)施方 式中，多種 hES-MSC 可以按，約 10000:1、約 1,000:1、約 100:1、約 10:1、約 1:1、約 1:10、約 1:100、約1:1，000或約1:10000的比率施用至個(gè)體。一般地，可以施用約IX IO5至約IXlO8 個(gè)hES-MSC/kg (接受者體重），優(yōu)選地約I X IO6至約I X 10 7個(gè)hES-MSC/kg (接受者體重）， 以產(chǎn)生免疫抑制。在各種實(shí)施方式中，施用至個(gè)體或?qū)ο蟮膆ES-MSC包括至少、約或不多 于，IX 105、3 X 105、IX Io6Jxio6Uxio7Jxio7Uxio 8Jxio8Uxio9JXioi^hES-MSC 或更多。
[0222] 該hES-MSC也可和一種或多種第二類型的干細(xì)胞一起施用，如骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞。這種第二類型的干細(xì)胞可施用給個(gè)體，它們和hES-MSC的比例如約1:10至約10:1。
[0223] 為了便于hES-MSC和免疫細(xì)胞接觸，該hES-MSC可以按任何足以使該hES-MSC和 免疫細(xì)胞彼此接觸的途徑施用給個(gè)體。例如，該hES-MSC可以通過，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜 內(nèi)、眼內(nèi)、腸胃外、鞘內(nèi)或直接進(jìn)入器官（例如胰臟）的途徑施用至個(gè)體。對(duì)于體外施用， hES-MSC可配制成藥物制劑。
[0224] 所述免疫抑制方法還可以包括加入一種或多種免疫抑制劑，特別是在體內(nèi)環(huán)境。 在一個(gè)實(shí)施方式中，多種hES-MSC在個(gè)體體內(nèi)接觸多種免疫細(xì)胞，并且組合物包括免疫抑 制藥物被施用給個(gè)體。免疫抑制藥物是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于抗T細(xì)胞受體抗體 (如單克隆或多克隆抗體，或抗體片段或其衍生物）、抗IL-2受體抗體（例如，巴利昔單抗 CSIMULECT?)或賽尼哌(ZENAPAX?)、抗T細(xì)胞受體抗體（例如莫羅單抗CD3)、硫唑嘌 呤、皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西羅莫司、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等。在一個(gè)具 體實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是針對(duì)巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP)-Ia和MIP-I β的中和抗 體。
[0225] 5. 8hES_MSC 的保存
[0226] hES-MSC可以被保存，也就是將它們長期存儲(chǔ)，或者在抑制由例如凋亡或壞死引起 的細(xì)胞死亡的條件下保存。可以使用化合物保存hES-MSC，該化合物包含凋亡抑制劑和壞死 抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種保存干細(xì)胞群的方法，其中，所述干細(xì)胞群接 觸含有凋亡抑制劑的干細(xì)胞采集組合物，其中所述凋亡抑制劑存在的量存在和存在的時(shí)間 足以減少或阻止所述干細(xì)胞群凋亡（與沒有接觸該凋亡抑制劑的細(xì)胞群相比）。在一個(gè)具 體的實(shí)施方式中，凋亡抑制劑是半胱天冬酶-3抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，凋亡抑制劑 是JNK抑制劑。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述JNK抑制劑不調(diào)控所述干細(xì)胞的增殖和分 化。在另一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞采集組合物包含所述凋亡抑制劑以及分離相的所述攜氧 全氟化碳。在另一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞收集組合物包含所述凋亡抑制劑以及含于乳劑的 所述攜氧全氟化碳。在另一實(shí)施方式中，該細(xì)胞收集組合物還包含乳化劑，例如卵磷脂。在 另一實(shí)施方式中，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳在接觸該細(xì)胞時(shí)，處于約〇°C到約25°C 之間。在另一更具體的實(shí)施方式中，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳在接觸該細(xì)胞時(shí)，處于 約2°C到10°C之間或約2°C到約5°C之間。在另一更具體的實(shí)施方式中，所述接觸發(fā)生在運(yùn) 輸所述細(xì)胞群期間。在另一更具體的實(shí)施方式中，所述接觸發(fā)生在冷凍和融解所述干細(xì)胞 群期間。
[0227] 在某些實(shí)施方式中，可添加 rock抑制劑Y27632以有助于輔助。在某些實(shí)施方式 中，該rock抑制劑以IOuM的濃度添加。
[0228] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種保存hES-MSC群的方法，其中，該干細(xì)胞群 接觸凋亡抑制劑和保存器官的組合物，其中，凋亡抑制劑存在的量和時(shí)間足以減少和阻止 干細(xì)胞群的凋亡（相比于干細(xì)胞群未接觸凋亡抑制劑）。
[0229] 通常，在hES-MSC收集、富集和分離期間，優(yōu)選最小化或消除由于缺氧和機(jī)械應(yīng) 力引起的細(xì)胞應(yīng)激。因此，在本方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述干細(xì)胞或干細(xì)胞群保存 期間，干細(xì)胞或干細(xì)胞群暴露于低氧環(huán)境中，對(duì)它們的收集、富集和分離的時(shí)間不超過6小 時(shí)。其中，低氧環(huán)境指氧氣的濃度低于正常血氧的濃度。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述 干細(xì)胞群在保存期間暴露于低氧環(huán)境少于2小時(shí)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述干 細(xì)胞群在保存期間暴露于低氧環(huán)境少于1小時(shí)或少于30分鐘，或在收集期間、富集期間或 分離期間不暴露于低氧環(huán)境。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述干細(xì)胞群在收集、富集或 分離期間不暴露于剪應(yīng)力。
[0230] 所述hES-MSC可冷凍保存在含如冷凍保存培養(yǎng)基的小容器（例如安瓶）。合適的冷 凍保存培養(yǎng)基包括但不限于，包括如下的培養(yǎng)基：例如，生長培養(yǎng)基或細(xì)胞凍存培養(yǎng)基，例 如，商購的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基，如C2695、C2639或C6039 (Sigma)。冷凍保存培養(yǎng)基優(yōu)選包含濃 度例如約10% (V/V)的二甲基亞砜（DMSO)。冷凍保存培養(yǎng)基可以包含其它試劑，例如甲基 纖維素和/或甘油。hES-MSC在冷凍保存過程中，優(yōu)選的冷卻速度是約1°C /分鐘。優(yōu)選的 冷凍保存溫度為約_80°C至約_180°C，更優(yōu)選地，約_125°C至約_140°C。在融化使用之前， 凍存的細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到液氮中。在一些實(shí)施方式中，例如，一旦安瓶的溫度達(dá)至約_90°C，將 它們轉(zhuǎn)移至含液氮儲(chǔ)存區(qū)域。冷凍保存的細(xì)胞解凍時(shí)優(yōu)選約在25°C至約40°C的溫度下，優(yōu) 選的溫度約37 °C。
[0231] 5. 9 冷凍保存的 hES-MSC
[0232] 本文公開的hES-MSC可以被保存，例如冷凍保存以備后用。冷凍保存細(xì)胞，例如干 細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域所熟知的。hES-MSC能以一種方便施用給個(gè)體的方法保存。例如，本文 提供裝在容器里的hES-MSC，該容器適用于醫(yī)療用途。這種容器可以是，例如無菌的塑料袋、 燒瓶、罐，或其它可容易處置hES-MSC的容器。例如，所述容器可以是血袋或其它塑料的、適 合用于給受體靜脈內(nèi)輸送液體的醫(yī)學(xué)上可接受的袋。該容器優(yōu)選允許冷凍保存該干細(xì)胞 群。冷凍保存的hES-MSC可包括來源于一個(gè)捐贈(zèng)者或來自多個(gè)捐贈(zèng)者的hES-MSC。hES-MSC 可以是和預(yù)期接受者完全HLA匹配的，或部分或完全HLA不匹配的。
[0233] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述容器是袋、瓶或罐。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式 中，所述袋是無菌塑料袋。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述袋適合、允許或有助于hES-MSC 靜脈內(nèi)給藥。該袋子可以包括多個(gè)腔或室，給藥之前或期間，所述腔或室相互連接，以允許 該細(xì)胞和一種或多種其他溶液（例如藥物）相混合。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，這種組 合物包含一種或多種化合物，促進(jìn)組合的干細(xì)胞群冷凍促存。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中， hES-MSC被包含在生理學(xué)可接受的水性溶液中。在一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，這種生理學(xué)可 接受的水性溶液是0. 9% NaCl溶液。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，hES-MSC和接受者的干 細(xì)胞群是HLA匹配的。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述組合的干細(xì)胞群包含hES-MSC，該 hES-MSC至少部分和接受者的干細(xì)胞群HLA匹配。
[0234] 5. 10藥物制劑
[0235] 正如上文所討論的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種藥物組合物，其中，該藥物組合 物包含治療有效量的hES-MSC和藥學(xué)上都接受的載體。短語"藥學(xué)上可以接受的"是指分子 實(shí)體和組合物具有生理相容性而且在施用于人后通常不會(huì)產(chǎn)生過敏或者相類似的反應(yīng)，如 胃部不適，頭暈等。并且由聯(lián)邦或州政府管理部門批準(zhǔn)的，或在美國藥典或其它公認(rèn)的用于 動(dòng)物，更特別地用于人的藥典中列出的。"載體"是指藥劑批準(zhǔn)的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載 體。此類藥物載體可以是無菌液體，例如水的鹽水溶液和油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合 成油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物靜脈給藥時(shí)，鹽水溶液是優(yōu)選的 載體。鹽水溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液體載體，特別是注射用液體。合適 的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、 單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所 述組合物還包含極小量的濕潤劑、乳化劑和/或PH緩沖劑。
[0236] 這些組合物可以采用以下形式：溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續(xù) 釋放制劑、扁囊劑、錠劑、錠劑、分散劑、栓劑、軟膏劑、巴布劑（泥敷劑）、糊劑、敷料、霜?jiǎng)?硬膏劑、貼劑、氣霧劑、凝膠劑。液體劑型適于胃腸外施用至患者，以及滅菌固體制劑（如晶 體或無定形固體）被重構(gòu)成液體劑型以適于非腸道給藥患者。這樣的組合物應(yīng)該包含治療 有效量的所述化合物（優(yōu)選純化的形式）以及適量的載體，以便向患者提供適當(dāng)?shù)慕o藥形 式。
[0237] 適于口服給藥的藥物組合物可以是膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、溶液劑、糖漿劑、懸 浮液（在非水或水性液體）或乳劑。片劑或硬明膠膠囊可以包括乳糖、淀粉或其衍生物、硬 脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊可以包括植物油、蠟、脂肪、半 固體、或液體多元醇。溶液和糖漿可以包含水、多元醇和糖。設(shè)計(jì)用于口服給藥的活性藥劑 可用延遲該活性藥劑在胃腸道的崩解和/或吸收的材料包衣或者與其混合。因此，可實(shí)現(xiàn) 活性劑持續(xù)釋放多個(gè)小時(shí)，并且如果需要，可保護(hù)活性劑以防止在胃中降解。用于口服給藥 的藥物組合物可以進(jìn)行配制后用于幫助將活性藥劑根據(jù)特定PH或酶條件釋放在特定胃腸 部位。
[0238] 適合透皮給藥的制劑可以為不連續(xù)的貼劑，以長時(shí)間與受治者表皮保持緊密接 觸。
[0239] 適合對(duì)鼻腔和肺用藥的藥物組合物可包含固態(tài)載體如可以快速通過鼻子給藥的 粉劑。用于鼻腔黏膜給藥的藥物組合物可以包括液體載體，例如鼻噴霧劑或滴鼻劑。另外， 可通過深吸一口氣或安裝吹管以實(shí)現(xiàn)直接吸入肺部。這些組合物可以包含活性成分的水或 油溶液。用于通過吸入給藥的組合物可以裝在專門配套的設(shè)備中，包括但不限于加壓氣溶 膠、噴霧器或吹入器，可以制造這樣的裝置，以便提供預(yù)定劑量的活性成分。
[0240] 適于腸胃外給藥的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射溶液或懸浮液，所述溶 液或混懸劑可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使所述組合物變得與預(yù)定接受者的血液 大體上等滲的溶質(zhì)。這類組合物中可以存在的其他成分包括，例如水、醇、多元醇、甘油和植 物油。適于腸胃外給藥的組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和 小瓶，并且可以儲(chǔ)存在冷凍干燥（凍干）條件下。對(duì)于這種情況，在臨用前僅需迅速加入無 菌液體載體。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和片劑制備?？捎糜谔峁┍景l(fā)明 腸胃外劑型的合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。實(shí)例包括：USP注射用水；水性載體， 例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液和乳酸林格注射 液；水溶性的媒介物諸如乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性載體，如玉米油、棉籽油、花 生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和苯甲酸芐酯。
[0241] 有效劑量的選擇將由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的幾個(gè)因 素的考慮來確定。這些因素包括抑制劑的特定形式及其藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)如生物利用度、代 謝、半衰期等，這些因素將在常規(guī)的開發(fā)程序中被確立，通常運(yùn)用這些程序才能獲得對(duì)藥物 化合物的按規(guī)定的批準(zhǔn)。與劑量有關(guān)的另一些因素包括，將要治療的病癥或疾病，或者對(duì)正 常人將要獲得的益處，病人的體重，用藥的途徑，用藥是急性或是慢性，伴隨給藥，以及影響 所給藥劑效率的其它周知因素。因此精確的劑量應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每位患者的具體情 況來定。
[0242] 在某些實(shí)施方式中，給患者施用解熱和/或抗組胺劑（對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸苯海 拉明），以減少與hES-MSC治療時(shí)所含的冷凍組分有關(guān)的任何可能的DMSO輸注毒性。
[0243] 在某些實(shí)施方式中，給患者施用解熱和/或抗組胺劑（對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸苯海 拉明），以減少與hES-MSC治療時(shí)所含的冷凍組分有關(guān)的任何可能的DMSO輸注毒性。
[0244] 5. IlhES-MSC條件培養(yǎng)基和衍生物
[0245] 本文公開的hES-MSC可用于生產(chǎn)具有免疫抑制能力的條件培養(yǎng)基、濃縮的條件培 養(yǎng)基、細(xì)胞裂解物或其它衍生物，也就是他們包含一種或多種由干細(xì)胞分泌或排泄的生物 分子。所述干細(xì)胞對(duì)多個(gè)一種或多種類型的免疫細(xì)胞有可檢測(cè)的免疫抑制能力。在各種實(shí) 施方式中，所述條件培養(yǎng)基包括hES-MSC已經(jīng)生長了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或更多天數(shù)的培養(yǎng)基。在其它的實(shí)施方式中，所述條件培養(yǎng)基包括hES-MSC已經(jīng)生長 到融合度至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或達(dá)到100%的培養(yǎng)基。這種條件培 養(yǎng)基可用于支持分離的hES-MSC群的培養(yǎng)，或其它類型的干細(xì)胞的培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，所述條件培養(yǎng)基包括hES-MSC已經(jīng)分化成熟細(xì)胞的培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本 發(fā)明的條件培養(yǎng)基包括已經(jīng)培養(yǎng)過hES-MSC和非hES-MSC的培養(yǎng)基。在各種實(shí)施方式中，可 能過反復(fù)凍融的方法或用低滲或高滲溶液處理的方法裂解細(xì)胞，包括裂解hES-MSC細(xì)胞。
[0246] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種包含培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解物和/或其 它hES-MSC衍生物的組合物，其中所述hES-MSC(a)粘附在基質(zhì)上；(b)表達(dá)CD73、CD105、 CD90、CD29、CD44、CD146、IL-10、TGFb2、HGF，但是不表達(dá) IL-6、TNF a、IL-12 和 / 或 RAGE。 在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，該組合物包括抗增殖試劑，如抗MIP-I α或抗MIP-I β抗體。
[0247] 本文提供一種使用本文所述hES-MSC作為飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增骨髓造血干細(xì)胞、外周血 造血干細(xì)胞和臍帶造血干細(xì)胞的方法。在某些實(shí)施方式中，適于本公開方法的hES-MSC表 達(dá)Stro-3、Stro-1、DLl和/或巢蛋白。所述hES-MSC與骨髓造血干細(xì)胞、外周血造血干細(xì) 胞和/或臍帶造血干細(xì)胞共培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述hES-MSC是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。本 文提供如本文所述hES-MSC和骨髓造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)物。本文提供如本文所述hES-MSC 和臍帶造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
[0248] 5· 12 包含 hES-MSC 的基質(zhì)
[0249] 本發(fā)明還包括包含hES-MSC的基質(zhì)、水凝膠、支架等。hES-MSC可鋪在天然基質(zhì)，如 生物材料上。在某些實(shí)施方式中，通過3維打印獲得所述支架。hES-MSC可懸浮在適合如注 射的水凝膠溶液。對(duì)于這樣的組合物的合適的水凝膠包括自組裝肽，例如RAD16。在一個(gè) 實(shí)施方式中，包含細(xì)胞的水凝膠溶液可允許變硬，例如在模具中，以形成具有細(xì)胞分散在其 中的用于移植的基質(zhì)。hES-MSC可培養(yǎng)在這樣的基質(zhì)，使細(xì)胞在移植前進(jìn)行有絲分裂擴(kuò)增。 所述水凝膠是，例如有機(jī)聚合物（天然的或合成的），通過共價(jià)、離子或氫鍵交聯(lián)以創(chuàng)建三 維開放的晶格結(jié)構(gòu)，其俘獲的水分子，以形成凝膠。水凝膠形成材料包括多糖，例如褐藻膠 及其鹽、多肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，它們是通過離子鍵、或嵌段聚合物交聯(lián)，嵌段聚合物包 括例如聚環(huán)氧乙烷一聚丙二醇嵌段共聚物，它們是分別通過溫度或PH值交聯(lián)。在一些實(shí)施 方式中，本發(fā)明的水凝膠或基質(zhì)是可生物降解的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述制劑包 含原位聚合的凝膠（參見，例如，美國專利申請(qǐng)公開2002/0022676 ;Anseth等，J. Control Release, 78 (1-3) : 199-209 (2002) ;Wang 等，Biomaterials，24 (22) : 3969-80 (2003) 〇
[0250] 在一些實(shí)施方式中，所述聚合物至少可部分溶解于具有帶電荷側(cè)基或其單價(jià)離子 鹽的水溶液例如水，或含水醇溶液中。具有酸性側(cè)基的聚合物的實(shí)例，可以與陽離子反應(yīng)聚 合物的是聚（磷腈）、聚（丙烯酸）、聚（甲基丙烯酸）、丙烯酸和甲基丙烯酸、聚（乙酸乙烯 酯）的共聚物、以及磺化的聚合物，例如作為磺化聚苯乙烯。也可以使用具有由丙烯酸或甲 基丙烯酸與乙烯醚單體或聚合物反應(yīng)形成的酸性側(cè)基的共聚物。酸性基團(tuán)的實(shí)例是羧酸基 團(tuán)、磺酸基團(tuán)、鹵代（優(yōu)選氟代）醇基團(tuán)、酚OH基團(tuán)和酸性O(shè)H基團(tuán)。
[0251] 所述hES-MSC或其共培養(yǎng)物可以接種至三維框架或支架，并移植入體內(nèi)。這種框 架可以和任何一種或多種生長因子、細(xì)胞、藥物或其它組分一起移植，以刺激組織形成或以 其它方式增強(qiáng)或改善本發(fā)明的實(shí)施。
[0252] 可在本發(fā)明中使用的支架的實(shí)例包括非織造墊、多孔泡沫、或自組裝多肽?？梢杂?纖維形成無紡布襯墊，該纖維由乙醇和乳酸合成的可吸收的共聚物構(gòu)成（如PGA/PLA) (VIC RYL, Ethicon, Inc.，Somerville, N. J.)。泡沫也可以用作支架，該泡沫由如通過聚（ε -己 內(nèi)酯）/聚（乙醇酸）（PCL/PGA)共聚物構(gòu)成。該共聚物通過例如冷凍干燥或凍干工藝形成 (參見，例如，美國專利號(hào)6355699)。
[0253] 所述hES-MSC也可以接種在或接觸生理上可接受的陶瓷材料，包括但不限于單_、 二-、三-、α-三-、β-三和四磷酸鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、硫酸鈣、鈣氟化物、氧化 鈣、碳酸鈣、鎂鈣磷酸鹽、生物活性玻璃如BIOGL.ASS?以及它們的混合物。目前市售的 多孔生物相容的陶瓷材料包括SURGIBONE? (CanMedica公司，加拿大），ENDOBON? (Merck Biomaterial France，法國）、CEROS? (Mathys，AG，貝特拉赫，瑞士）和礦化膠原 骨移植產(chǎn)品，例如HEAL0S?(DePuy，Inc.，雷納姆，馬薩諸塞州）和VITC)SS3L RHAK0SS?和 CORTOSS? (Orthovita，Malvern，Pa.)。該框架可以是一個(gè)混合物、共混物或天然和/或 合成材料的復(fù)合物。
[0254] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，hES-MSC可以接種在或接觸毛氈，該毛氈可以由，如復(fù)絲構(gòu) 成。該復(fù)絲可由生物吸收的材料如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明質(zhì)酸制成。
[0255] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述hES-MSC可以接種在泡沫支架，該支持可以是復(fù)合結(jié) 構(gòu)。此類泡沫支架可以模制成有用的形狀，例如，待修復(fù)、替換或補(bǔ)充的身體特定結(jié)構(gòu)的一 部分。在一些實(shí)施方式中，所述框架在接種本發(fā)明的細(xì)胞之前，使用例如0. IM乙酸處理， 然后在聚賴氨酸、PBS和/或膠原蛋白中溫育，以增強(qiáng)細(xì)胞粘附?；|(zhì)的外部表面可以被修 飾以改善細(xì)胞和組織的分化，例如離子體包被基質(zhì)，或添加一種或多種蛋白質(zhì)（例如膠原、 彈性纖維、網(wǎng)狀纖維）、糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖（例如硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨 素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等）、細(xì)胞外基質(zhì)和/或其它基質(zhì)，如但不限于明膠、 藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等。
[0256] 在一些實(shí)施方式中，所述支架包括不會(huì)形成血栓的材料，或這種材料支架處理后 不會(huì)形成血栓。這些處理和材料也可以促進(jìn)和維持內(nèi)皮生長、迀移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。這些 材料和治療的實(shí)施方式包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白，如層粘連蛋白和IV型膠 原，合成材料，例如EPTFE和分段的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN?(The Polymer Technology Group，Inc.，伯克利分校，加州）。所述支架還可以包含抗血栓形成劑，例如肝素。在接種 干細(xì)胞前，該支架也可以被處理，以改變表面電荷（例如，包被等離子體）。
[0257] 5. 13 永生化的 hES-MSC
[0258] 哺乳動(dòng)物hES-MSC可通過轉(zhuǎn)染含有生長促進(jìn)基因的任何合適載體以實(shí)現(xiàn)有條件 的永生化，該基因編碼的蛋白質(zhì)在適當(dāng)條件下促進(jìn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長，使得所述生長促進(jìn)蛋 白質(zhì)的產(chǎn)量和/或活性聽上去像是外界因素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，生長促進(jìn)基因是 癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、Ela的 腺病毒或E7蛋白人乳頭狀瘤病毒。
[0259] 促生長蛋白調(diào)節(jié)的實(shí)例可以通過下以實(shí)現(xiàn)，將促生長基因置于外界可調(diào)控的啟 動(dòng)子上，例如，啟動(dòng)子的活性受控于，例如被轉(zhuǎn)染細(xì)胞溫度或與細(xì)胞接觸培養(yǎng)基的成分改 變。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用四環(huán)素（tet)控制的基因表達(dá)系統(tǒng)（參照Gossen等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547_5551，1992 ;Hoshimaru 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1518-1523, 1996)。當(dāng)不存在tet時(shí)，載體中tet控制的反式作用因子（tTA)強(qiáng)激 活phCMV*-l的轉(zhuǎn)錄，其中phCMV*-l是融合至tet操縱子序列的最小人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。 tTA的是大腸桿菌的轉(zhuǎn)座子-10來源的tet抗性操縱子和單純皰瘆病毒的VP16的酸性結(jié)構(gòu) 域的阻遏（四面體）的融合蛋白。低、無毒濃度的tet (例如，0.01?1.0 μ g/mL)幾乎完全 消除tTA的反式激活。
[0260] 在一個(gè)實(shí)施方式中，載體還包含編碼選擇標(biāo)記（例如賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)）的 基因。細(xì)菌新霉素抗性基因（neoR)就是這樣一種標(biāo)記，該標(biāo)記也可以用于本發(fā)明。可通 過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法選擇攜帶neoR的細(xì)胞，例如，在生長培養(yǎng)基中添加 100-200 μg/mL G418〇
[0261] 可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法中任何一種方法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染，包括但不 限于反轉(zhuǎn)錄病毒感染。通常，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染可通過與條件培養(yǎng)基和包含N2補(bǔ)充物的 DMEM/F12形成的混合物溫育。其中，條件培養(yǎng)基來自針對(duì)所述載體的生產(chǎn)細(xì)胞系。例如，通 過在1倍體積條件培養(yǎng)基和2倍體積含有N2補(bǔ)充物的DMEM/F12的混合物中溫育約20小 時(shí)，如上所述制備的干細(xì)胞培養(yǎng)物可在體外被感染，例如5天。接著可按如上所述的方法選 擇攜帶可選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0262] 轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)物傳代到允許增殖的表面，例如，允許至少30%的細(xì)胞在24小時(shí)周 期內(nèi)倍增。優(yōu)選地，所述基質(zhì)是聚鳥氨酸/層粘連蛋白基質(zhì)，包括組織培養(yǎng)塑料涂有聚鳥氨 酸（10 μ g/mL)和/或?qū)诱尺B蛋白（10 μ g/mL)、聚賴氨酸/層粘連蛋白基質(zhì)、或用纖粘連蛋 白處理的表面。然后，每3-4天用生長培養(yǎng)基飼養(yǎng)培養(yǎng)物，生長培養(yǎng)基中可以或可以不補(bǔ)充 1個(gè)或多個(gè)增殖增強(qiáng)因子。當(dāng)培養(yǎng)物的融合度少于50%時(shí)，可在生長培養(yǎng)基中添加增殖增 強(qiáng)因子。
[0263] 可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)傳代所述條件永生化的hES-MSC細(xì)胞系，如當(dāng)80-95%融合度時(shí)， 使用胰蛋白酶消化細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，高達(dá)約20代有利于維持選擇（例如，在含有 新霉素抗性基因的細(xì)胞中添加 G418)。細(xì)胞還可以在液氮中冷凍以進(jìn)行長期儲(chǔ)存。
[0264] 可從如上所述的條件永生化的hES-MSC細(xì)胞系中分離克隆細(xì)胞系。通常，可使用 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離這種克隆細(xì)胞系，如通過有限稀釋法或使用克隆環(huán)和擴(kuò)增。通?？砂慈缟纤?述飼養(yǎng)和傳代克隆細(xì)胞系。
[0265] 條件永生化的hES-MSC細(xì)胞系可以是，但不需要是純系的。通常可通過在促進(jìn)分 化的培養(yǎng)條件下抑制生長促進(jìn)蛋白的生產(chǎn)或活性而誘導(dǎo)條件永生化的hES-MSC細(xì)胞系分 化。例如，如果編碼生長促進(jìn)蛋白的基因被外部調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的控制，可以改變條件，例如 溫度或培養(yǎng)基的組合物，從而抑制生長促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于上面討論的四環(huán)素控制的基 因表達(dá)系統(tǒng)，可以通過加入四環(huán)素抑制生長促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)分化。通常I yg/mL四 環(huán)素處理4-5天足以引發(fā)分化。為了促進(jìn)進(jìn)一步分化，可在生長培養(yǎng)基中加入額外的藥劑。
[0266] 5. 14 試驗(yàn)
[0267] 所述hES-MSC可應(yīng)用于試驗(yàn)以確定培養(yǎng)條件、環(huán)境因素、分子（例如，生物分子、小 無機(jī)分子等）等對(duì)干細(xì)胞增殖、擴(kuò)增和/或分化的影響，基于與hES-MSC不暴露于這樣的條 件相比較。
[0268] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述hES-MSC可用于分析一旦細(xì)胞接觸一種分子，增 殖、擴(kuò)增或分化的變化。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)節(jié)多個(gè)hES-MSC 增殖的化合物，其中，在允許增殖的條件下，hES-MSC接觸該化合物，其中與hES-MSC未與該 化合物接觸相比較，如果該化合物引起對(duì)hES-MSC的增殖可檢測(cè)的變化，那么該化合物被 鑒定為調(diào)節(jié)hES-MSC增殖的化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述化合物被鑒定是增殖 抑制劑。在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述化合物被鑒定是增殖增強(qiáng)劑。
[0269] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)節(jié)多個(gè)hES-MSC擴(kuò)增的化合物， 其中，在允許擴(kuò)增的條件下，hES-MSC接觸該化合物，其中與hES-MSC未與該化合物接觸 相比較，如果該化合物引起對(duì)hES-MSC擴(kuò)增可檢測(cè)的變化，那么該化合物被鑒定為調(diào)節(jié) hES-MSC擴(kuò)增的化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述化合物被鑒定是擴(kuò)增抑制劑。在另 一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述化合物被鑒定是擴(kuò)增增強(qiáng)劑。
[0270] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)節(jié)多個(gè)hES-MSC分化的化合物， 其中，在允許分化的條件下，hES-MSC接觸該化合物，其中與hES-MSC未與該化合物接觸 相比較，如果該化合物引起對(duì)hES-MSC分化可檢測(cè)的變化，那么該化合物被鑒定為調(diào)節(jié) hES-MSC分化的化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述化合物被鑒定是分化抑制劑。在另 一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述化合物被鑒定為分化增強(qiáng)劑。
[0271] 5. 15人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的治療應(yīng)用
[0272] 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs)已經(jīng)被用于基于T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾 病的治療，包括多發(fā)性硬化癥（MS)，但由于來源有限、質(zhì)量不穩(wěn)定和對(duì)使用來自成體組織細(xì) 胞生物安全的擔(dān)憂，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為輔助治療劑受到了限制。
[0273] 本文所述的從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的新方法，和使用這種方法產(chǎn)生的新 hES-MSCs，提供了針對(duì)T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥的新療法。
[0274] 在某些實(shí)施方式中，向EAE發(fā)病前的小鼠施用hES-MSC，顯著地降低這些動(dòng)物的疾 病評(píng)分。所述評(píng)分降低伴隨著降低脫髓鞘、T細(xì)胞的浸潤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞反 應(yīng)，以及在體外抑制免疫細(xì)胞增殖和分化。
[0275] 在某些實(shí)施方式中，向疾病發(fā)作后的EAE小鼠施用hES-MSC，也可觀察到疾病評(píng)分 逐漸下降。在某些實(shí)施方式中，hES-MSC同時(shí)具有對(duì)該疾病預(yù)防性和治療性效果。
[0276] 在某些實(shí)施方式中，hES-MSC的免疫抑制活性導(dǎo)致被輻射過的hES-MSC對(duì)這些疾 病預(yù)防性效果，這些被輻射過的hES-MSC不大可能替換受損的髓磷脂，但是有效地下降疾 病評(píng)分。在一個(gè)實(shí)施方式中，福射并未縮短hES-MSC的壽命。
[0277] 在某些實(shí)施方式中，hES-MSC的治療效果涉及免疫抑制、神經(jīng)修復(fù)和再生。
[0278] 在某些實(shí)施方式中，被hES-MSC處理的EAE小鼠在它們的中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在更少 炎癥性T細(xì)胞以及更少T細(xì)胞滲透至脊髓。所述hES-MSC可以減少由炎癥性T細(xì)胞引起的 損傷和癥狀，使得它們有用于所有與T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的治療和預(yù)防。hES-MSC 也減少脫髓鞘。
[0279] 在某一個(gè)實(shí)施方式中，所述治療方法包括hES-MSC和其它藥物聯(lián)合使用。在某一 個(gè)實(shí)施方式中，hES-MSC與抗IL-6抗體、抗IL-12抗體和/或其它免疫抑制藥物聯(lián)合給藥。
[0280] 如本文結(jié)果所示，把來源于三個(gè)不同hES細(xì)胞系的hES-MSCs施用于疾病發(fā)作前的 EAE小鼠，顯著地減少這些小鼠的疾病評(píng)分。所述評(píng)分降低伴隨著降低脫髓鞘、T細(xì)胞的浸 潤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，以及在體外抑制免疫細(xì)胞增殖和分化。
[0281] 另外，EAE小鼠在疾病發(fā)作后給予hES-MSCs處理，還觀察到疾病評(píng)分逐漸下降。這 些數(shù)據(jù)表明hES-MSC同時(shí)具有對(duì)該疾病預(yù)防性和治療性效果。
[0282] 在某些實(shí)施方式中，hES-MSC的免疫抑制活性導(dǎo)致被輻射過的hES-MSC對(duì)這些疾 病預(yù)防性效果，這些被輻射過的hES-MSC不大可能替換受損的髓磷脂，但是有效地下降疾 病評(píng)分。在一個(gè)實(shí)施方式中，福射并未縮短hES-MSC的壽命。
[0283] 在某些實(shí)施方式中，hES-MSC的治療效果涉及免疫抑制、神經(jīng)修復(fù)和再生。
[0284] 在某些實(shí)施方式中，被hES-MSC處理的EAE小鼠在它們的中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在更少 炎癥性T細(xì)胞以及更少T細(xì)胞滲透至脊髓。所述hES-MSC可以減少由炎癥性T細(xì)胞引起的 損傷和癥狀，使得它們有用于所有與T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的治療和預(yù)防。hES-MSC 也減少脫髓鞘。
[0285] 這些有利的結(jié)果全都和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的結(jié)果形成鮮明對(duì)比。 BM-MSCs僅抑制T細(xì)胞響應(yīng)于體外低劑量抗CD3抗體刺激的增殖，并且甚至增強(qiáng)Thl和Thl7 細(xì)胞滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自體反應(yīng)的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞與一些自身免疫疾病的發(fā) 病機(jī)理有關(guān)，包括多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這些⑶4+T細(xì)胞包括Thl 和Thl7細(xì)胞。
[0286] 此外，BM-MSCs對(duì)EAE小鼠的疾病評(píng)分根本沒有作用。這些發(fā)現(xiàn)是驚人的，但和 以前的報(bào)道相一致，所述所道顯示人BM-MSCs對(duì)EAE小鼠僅具有可忽略的作用（Gordon等 2008a ;Zhang等2005 ;Payne等2012)。本文的結(jié)果和來自這些研宄的結(jié)果突出了本發(fā)明的 新穎性和實(shí)用性。
[0287] 另外，BM-MSC和hES-MSC具有非常相似的整體轉(zhuǎn)錄譜，但差異表達(dá)一些促炎和抗 炎因子。在這些因子中，BM-MSCs的IL-6的表達(dá)水平高于hES-MSC。此夕卜，在體外經(jīng)IFNy 刺激后，BM-MSCs的IL-6的表達(dá)升高1倍，然而hES-MSC的IL-6表達(dá)仍保持低水平。
[0288] IL-6是一種多效性細(xì)胞因子，涉及造血/免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_，包括 炎癥的開始和終止。IL-6可提升Thl7細(xì)胞的分化和功能（Dong，2008)。多發(fā)性硬化癥病 人血液和腦組織的單核細(xì)胞的IL-6水平升高（Patanella等，2010)，IL-6水平在老年人 的血清中也升高（Sethe et al，2006)。缺少IL-6受體α的小鼠在T細(xì)胞致敏時(shí)是抵抗 EAE的（Leech等，2012)。CNS產(chǎn)生的位點(diǎn)特異性IL-6可重新定位和增強(qiáng)EAE的免疫反應(yīng) (Quintana等，2009)，然而，IL-6中和抗體可減少EAE小鼠的炎癥反應(yīng)（Gi jbels等，1995)。 因此，IL-6已成為治療多發(fā)性硬化癥有前途的治療靶標(biāo)。
[0289] 在MSC治療MS和EAE時(shí)，外周T細(xì)胞活性的免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)細(xì)胞再生和神經(jīng)細(xì)胞 修復(fù)是被廣泛認(rèn)可的治療作用（Al Jumah and八13111]^代6,2012;411161:丨3等，2012;]\1〇四11(1〇 等，2012)。然而，MS病人的長期功能神經(jīng)恢復(fù)和持續(xù)緩解病情需要修復(fù)受損的血-腦屏障 和血脊髓屏障（Correale and Villa，2007 ;Minagar等，2012)。換句話說，MS是一種炎癥 性、神經(jīng)變性和血管性疾病，而且有效的治療需要針對(duì)所有三個(gè)部分。
[0290] hES-MSCs的特征使它們特別適用于治療T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫疾病，尤其是多發(fā) 性硬化癥。特別地，hES-MSCs可降低EAE小鼠的疾病評(píng)分，而且還減少脫髓鞘和降低Thl 和Thl7細(xì)胞的增殖，并且IL-6低表達(dá)。后兩個(gè)特性使它們適合于治療其它的T細(xì)胞相關(guān) 的自身免疫性疾病。此外，hES-MSCs穿過血腦屏障和血脊髓屏障的能力，使得它們?cè)谥委?和預(yù)防多發(fā)性硬化癥和其它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的自身免疫性疾病具有更大的優(yōu)勢(shì)。
[0291] 因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種治療和預(yù)防與T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病 的方法，其中，包括給有需要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包含MSC的治療有效量的 溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑。T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫疾病包括但不限于多發(fā)性硬化癥、 炎性腸病、克羅恩病、移植物抗宿主病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。受試者是哺 乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人。所述溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑可以包括被輻射或未經(jīng)輻射的 hES-MSCs。所述溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑優(yōu)選通過注射給藥。
[0292] 多發(fā)性硬化癥已被劃分成四個(gè)亞型：復(fù)發(fā)性/持久性；繼發(fā)進(jìn)行性；原發(fā)進(jìn)行性； 和進(jìn)行性復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)性/持久性亞型的特征是不可預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)繼之以長時(shí)間保持。繼發(fā)進(jìn)行 性MS個(gè)體往往以復(fù)發(fā)性/持久性MS開始，然后是沒有持久期的進(jìn)行性衰退。原發(fā)進(jìn)行性 MS描述了少數(shù)出現(xiàn)癥狀后從未有緩解的個(gè)體。進(jìn)行性復(fù)發(fā)是最常見的亞型，具有穩(wěn)定神經(jīng) 衰退，并且遭受急性發(fā)作的特征。
[0293] 因此，本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式是一種治療或預(yù)防有此需要受試者的多發(fā)性硬化 癥的方法。其中，該方法包括向有需要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包括MSC的治療 有效量的溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑。所述多發(fā)性硬化癥可以是復(fù)發(fā)性/持久性多發(fā)性 硬化癥、進(jìn)行性/復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性多發(fā)性硬化癥、或繼發(fā)性多發(fā)性硬化癥。所 述溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑可以包括被輻射或未經(jīng)輻射的hES-MSCs。所述溶液、細(xì)胞培 養(yǎng)物或藥物制劑優(yōu)選通過注射給藥。
[0294] 多發(fā)性硬化癥出現(xiàn)的一系列癥狀，包括四肢感覺障礙、視神經(jīng)功能障礙、錐體束功 能障礙、膀胱功能障礙、腸功能障礙、性功能障礙、共濟(jì)失調(diào)和復(fù)視攻擊。
[0295] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種治療多發(fā)性硬化癥的方法，其中，包括向有需要 其的受試者施用藥物的步驟，所述藥物是包含上文段落所述hES-MSCs的治療有效量的溶 液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑。其中可檢測(cè)的改善有至少一種癥狀、至少兩種癥狀、至少三種 癥狀、至少四種癥狀、至少五種癥狀或所有這些癥狀的改善。
[0296] 擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS)是最常用的評(píng)價(jià)患有多發(fā)性硬化臨床狀態(tài)的評(píng)價(jià)標(biāo) 準(zhǔn)。它根據(jù)多個(gè)單獨(dú)的參數(shù)測(cè)量殘疾：強(qiáng)度、感覺、腦干功能（語言和吞咽）、協(xié)調(diào)、視覺、認(rèn) 知、和腸/膀胱失禁。它是一個(gè)公認(rèn)的MS殘疾測(cè)量表。并且執(zhí)行起來不是特別困難或耗時(shí)。 該EDSS量化殘疾的八個(gè)功能系統(tǒng)（FS)并且允許神經(jīng)專家分配這些中的每一個(gè)功能系統(tǒng)評(píng) 分（Kurtzke 1983)。
[0297] Kurtzke如下定義功能系統(tǒng)：
[0298] ?錐體狀
[0299] ?小腦
[0300] ?腦干
[0301] ?感覺
[0302] ?腸和膀胱
[0303] ?視覺
[0304] ?大腦
[0305] ?其它
[0306] EDSS評(píng)分I. 0至4. 5指完全不臥床的多發(fā)性硬化癥患者。EDSS通過損傷到行走 定義5. 0至9. 5。每個(gè)可能結(jié)果的臨床意義如下：
[0307] 0· 0 :神經(jīng)檢查正常；
[0308] I. 0 :無殘疾，一個(gè)功能系統(tǒng)中最小異常體征；
[0309] 1. 5 :無殘疾，2/7功能系統(tǒng)中最小異常體征；
[0310] 2. 0 :1/7功能系統(tǒng)中有最低能力喪失；
[0311] 2. 5 :兩個(gè)功能系統(tǒng)中有最低能力喪失；
[0312] 3. 0 :-個(gè)功能系統(tǒng)中有中度能力喪失；或三個(gè)或四個(gè)功能系統(tǒng)中有輕度能力喪 失，盡管完全能走動(dòng)；
[0313] 3. 5 :完全能走動(dòng)，但是一個(gè)功能系統(tǒng)中有中度能力喪失和1或2個(gè)功能系統(tǒng)輕微 能力喪失，或2個(gè)功能系統(tǒng)中度能力喪失，或5個(gè)功能系統(tǒng)輕微能力喪失；
[0314] 4.0 :盡管有相對(duì)重度的能力喪失，在沒有幫助的情況下，完全能走動(dòng)、自立，長達(dá) 約12h/天；沒有幫助或不休息的情況下，能夠行走約500m ;
[0315] 4. 5 :在沒有幫助的情況下，一天中約大部分的時(shí)間完全能走動(dòng)，能工作一整天，另 外可能在充分活動(dòng)方面受一些限制或需要基本的幫助；以相對(duì)重度的能力喪失為特點(diǎn)；沒 有幫助或不休息的情況下，能行走約300m ;
[0316] 5. 0 :不需要幫助能行走約200米。殘疾妨礙所有日?；顒?dòng)；
[0317] 5. 5 :能走動(dòng)100米，殘疾妨礙所有日?；顒?dòng)；
[0318] 6. 0 :不管是否休息，需要間歇性或單側(cè)持續(xù)援助（手杖、拐杖或支架）行走100 米；
[0319] 6· 5 :需要持續(xù)的雙邊支持（手杖、拐杖或支架）以不休息地行走20米；
[0320] 7.0 :即使在有幫助時(shí)也不能行走超過5米，基本上限制在輪椅，自己操作標(biāo)準(zhǔn)輪 椅走動(dòng)；一天在輪椅中待的時(shí)間長達(dá)約12h ;
[0321] 7. 5 :不能多走幾步，限制在床，轉(zhuǎn)移時(shí)可能需要幫助?？勺砸焉陷喴?，但可能需要 電動(dòng)椅以完成所有日?；顒?dòng)；
[0322] 8. 0 :基本上限制在床、椅子或輪椅，但可以不臥床；
[0323] 8. 5:-天大部分時(shí)間基本上限制在床，能有效地使用手臂，保留了一些自理能 力；
[0324] 9. 0 :在床無助的病人，可以交流和飲食；
[0325] 9. 5 :不能有效交流或飲食/吞咽；
[0326] 10;因 MS而死亡。
[0327] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種在有此需要的受試者中治療多發(fā)性硬發(fā)癥 的方法，該方法包括向有需要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包含hES-MSCs的、治療 有效量的溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物或藥物制劑。其中，所述受試者擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS)的評(píng) 分至少改善一分，而且優(yōu)選至少改善2分。
[0328] 還有其它已經(jīng)用于治療和預(yù)防多化性硬化癥的治療藥劑，包括但不限于芬戈莫 德、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH)、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松、IFN β -la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、 環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺吡啶。
[0329] 因此，本發(fā)明的方法還可進(jìn)一步包括向受試者給予一種或多種其它治療藥劑， 所述藥劑包括但不限于芬戈莫德、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH)、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松、 IFNf3-la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米 托蒽醌和柳氮磺吡啶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述其它治療藥劑可在hES-MSCS施用后再施 用，或和hES-MSC同時(shí)施用，或可共軛或連接至hES-MSCS，如下文所述。
[0330] 這里公開的hES-MSC可以治療的T細(xì)胞和B細(xì)胞相關(guān)的其它自身免疫性疾病包 括但不限于斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血 性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴增生綜合征（ALPS)、自身免 疫性血小板減少性紫癜（ATP)、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎、慢性疲 勞綜合征性免疫缺陷綜合癥（CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、慢性阻塞性肺 疾病（COPD)、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、CREST綜合征、克羅恩病、波德戈里察病、皮肌 炎、青少年型皮肌炎、盤狀紅斑狼瘡、特發(fā)性混合冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷 夫斯病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜 (ITP)、免疫球蛋白A腎病、胰島素依賴性糖尿?。↖型）、11型糖尿病、幼年型關(guān)節(jié)炎、狼瘡、 美尼爾氏病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié) 性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性丙種球 蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾氏現(xiàn)象、瑞特氏綜合癥、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、僵人綜合癥、多發(fā)性大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、 潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜風(fēng)、韋格納氏肉芽腫或任何急性或慢性炎癥有關(guān)的 燃燒、手術(shù)損傷和過敏。
[0331] 5. 16使用人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞作為遞送系統(tǒng)
[0332] 由于本發(fā)明的hES-MSCs已經(jīng)展示穿過血-腦屏障和血-脊髓屏障獨(dú)特的能力，因 此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種使用hES-MSCs穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以 遞送藥劑的方法，該藥劑和hES-MSCs連接或綴合以形成復(fù)合物，并將hES-MSCs -藥劑復(fù)合 物施用給受試者，其中hES-MSCs穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑至中樞神 經(jīng)系統(tǒng)。hES-MSCs可以是單細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形式。藥劑將包括但不限 于化學(xué)品、藥物、蛋白質(zhì)、DNA，RNA、抗體和小分子。
[0333] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑 的遞送系統(tǒng)，其中，該藥劑和hES-MSCs綴合或連接。
[0334] 所述透過血-腦屏障和血-脊髓屏障的能力可用于治療和預(yù)防疾病，包括但不限 于多發(fā)性硬化、癌癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、腦膜炎、腦炎、狂犬病、癲 癇、癡呆、萊姆病、中風(fēng)、肌萎縮性側(cè)索硬化、腦和脊髓損傷。因此，有需要的受試者將患有或 有風(fēng)險(xiǎn)患上涉及血-腦屏障和血-脊髓屏障的疾病。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一 種治療疾病或損傷的方法，所述方法的藥劑綴合或連接至hES-MSC以形成復(fù)合物，并且給 有需要其的受試者施用hES-MSC-藥劑復(fù)合物，其中，hES-MSC穿過血-腦屏障和/或血-脊 髓屏障并將藥劑遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所述藥劑用于治療或預(yù)防受試者的疾病或損傷。由 于hES-MSC具有強(qiáng)大的迀移能力和滲透能力，它也可用作載體以運(yùn)送抗腫瘤藥物和蛋白以 治療腫瘤/癌癥。所述hES-MSC可以是單細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形式。藥物 包括但不限于化學(xué)品、藥物、蛋白、DNA、RNA、micro-RNA、非編碼RNA、抗體、小分子和/納米 分子。
[0335] 可用于治療和預(yù)防疾病的藥劑包括但不限于抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、類固 醇、化學(xué)治療劑、抗炎劑、細(xì)胞因子和/或合成肽。
[0336] 蛋白質(zhì)和多肽也可以綴合hES-MSCs，包括促紅細(xì)胞生成素（EPO)、抗β淀粉樣蛋 白肽、組織纖溶酶原激活劑（TPA)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、干擾素（IFN)、生長因子 /激素、抗血管內(nèi)皮生長因子肽、抗腫瘤壞死因子肽、神經(jīng)生長因子、肝細(xì)胞生長因子、IL-2、 CX3CL1、GCV、CPT-11、胞嘧啶脫氨酶、HSV-TK、羧酸酯酶、溶瘤病毒、TSP-1、TRAIL、FASL、 IL-10以及TGFb。結(jié)合于特異的受體并封閉這些受體的蛋白質(zhì)和多肽也可用的，并且是本 發(fā)明計(jì)劃與連接hES-MSCs的。
[0337] 編碼治療蛋白和多肽的DNA和RNA也可以綴合hES-MSCs形成綴合物，以穿過 血-腦屏障和/或血-脊髓屏障遞送。
[0338] 術(shù)語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體、單鏈Fv抗體片段、 Fab片段和F (ab'）2片段。多克隆抗體指對(duì)特定抗原表位特異的抗體分子異質(zhì)群，而單克隆 抗體指對(duì)特定抗原表位特異的抗體分子同質(zhì)群。單克隆抗體在本發(fā)明中是特別有用的。
[0339] 有效地阻止疾病信號(hào)通路中的分子或受體分子活化、表達(dá)和/或作用的任何藥劑 可用于連接或綴合hES-MSCs，所述疾病指涉及血-腦屏障和/或血-脊髓屏障的任何疾病。 這種藥劑包括但不限于化學(xué)品、植物化學(xué)品、藥物、生物制劑、有機(jī)小分子、抗體、核酸、肽類 和蛋白質(zhì)。
[0340] 也可以使用"誘餌"分子抑制信號(hào)通路，該"誘餌"分子模擬靶分子在通路中的結(jié) 合和激活區(qū)域?；罨姆肿訒?huì)結(jié)合誘餌，而不是靶標(biāo)，并且不可能發(fā)生活化。
[0341] 還可以使用"顯性干擾"分子或活化分子（所述活化分子缺少激活域）保留的結(jié) 合域?qū)崿F(xiàn)抑制。這些分子在信號(hào)通路中結(jié)合受體，但是不能生產(chǎn)的，并且阻止受體結(jié)合至所 述活化分子。這種誘餌分子和顯性干擾分子可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行制造，并且通 過連接或綴合至hES-MSCs以穿過血-腦屏障或血-脊髓屏障遞送。
[0342] 穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑的方法也用于診斷劑，包括但不 限于化學(xué)品、抗體、多肽、蛋白、DNA、RNA。這種為了應(yīng)用于診斷的藥劑必須有被可視化和/ 或定量的方法。這種方法包括但不限于熒光、生物標(biāo)記、染料、放射性同位素標(biāo)記和/或納 米顆粒。
[0343] 這樣的遞送方法和遞送系統(tǒng)將有利于診斷神經(jīng)障礙、多發(fā)性硬化、癌癥、帕金森 氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、腦膜炎、腦炎、狂犬病、癲癇、癡呆、萊姆病、中風(fēng)、肌 萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、以及腦和脊髓損傷。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種診 斷疾病或損傷的方法，該方法通過將藥劑連接或綴合至hES-MSCs以形成復(fù)合物；并且把 hES-MSCs-藥劑復(fù)合物施用于疑患病的受試者，其中，所述hES-MSCs穿過血-腦屏障和/或 血-脊髓屏障并將所述藥劑遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。所述hES-MSCs可以是單細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng) 物、溶液或藥物制劑的形式。藥劑包括但不限于化學(xué)品、藥物、蛋白、DNA、RNA、抗體和小分 子。
[0344] 不論什么類型和是否用于治療、預(yù)防、診斷的藥劑，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法 綴合或連接到hES-MSCs，包括但不限于合成的細(xì)胞外基質(zhì)、藻酸-聚-L-賴氨酸膠囊和/或 容器。
[0345] 在某些實(shí)施方式中，工業(yè)制造水平的大規(guī)模生產(chǎn)被包括在本發(fā)明內(nèi)，這樣的方法 是本領(lǐng)域熟知的。在某些實(shí)施方式中，大規(guī)模生產(chǎn)包括使用Hyper-STACK2D培養(yǎng)系統(tǒng)和/ 或微載體3D生物反應(yīng)器。
[0346] 6.實(shí)施例
[0347] 參考以下實(shí)施例能更好地理解本發(fā)明，給出以下實(shí)施例是為了更全面地說明本發(fā) 明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是它們決不可被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明寬廣的保護(hù)范圍的限制
[0348] 6. 1 實(shí)施例 Ι-hES-HB-MSCs 的衍生
[0349] 使用一種方法使hESC經(jīng)由EB而衍生HB，然后富集中胚層細(xì)胞并且根據(jù)后續(xù)的培 養(yǎng)條件進(jìn)一步分化為HB或MSC。
[0350] 材料和方法
[0351] 共使用了 4 種 hESC 細(xì)胞系，分別是 H9 (來自 WiCell Research Institute) (Thomson等（1998))、CT2(來自康涅狄格大學(xué)干細(xì)胞中心（Lin等（2010))、MA09(美國 食品和藥物管理局批準(zhǔn)的、臨床級(jí)別的細(xì)胞系，來自先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司）（Klimanskaya等 (2006) )和 ES03_Envy (Envy，帶 GFP 標(biāo)簽的細(xì)胞系，來自 ES International) (Costa 等 (2005))。這些細(xì)胞培養(yǎng)在基質(zhì)膠上（BD Biosciences，何塞，，加利福尼亞）并培養(yǎng)在 TeSRl培養(yǎng)基中（Stem Cell Technologies，溫哥華，加拿大），該培養(yǎng)基中添加或不添加 0· 05-0. 2 μ M BIO (6-溴靛玉紅-3'-肟（CAS 667463-62-9))。
[0352] 然后hESC細(xì)胞分化為EB細(xì)胞，接著富集如前所述的HB (Lu等（2008) ;Lu等 (2007) )?；|(zhì)膠培養(yǎng)板上融合度達(dá)50-80%的hES細(xì)胞被分散酶（lmg/ml，5至10分鐘） 消化，然后用以下培養(yǎng)基清洗：形成EB的基礎(chǔ)培養(yǎng)基HPGM(Lonza，Walksville，Maryland)， 或STEMLINE I/II造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基（Sigma, St. Louis,密蘇里），或StemSpan H3000 (Stem Cell Technologies，溫哥華，加拿大），或含 10% FBS 的頂DM，或含 10% FBS 的DMEDM/F12。接著細(xì)胞以約2-3百萬細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng)在超低皿，并在EB形成培養(yǎng)基 中培養(yǎng)48小時(shí)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了終濃度為50ng/ml的VEGF(P印rotech)和終濃度為50ng/ ml的BMP4 (Stemgent)。48小時(shí)后，一半的培養(yǎng)基被替換成新鮮的EB培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加 了終濃度為 25-50ng/ml 的 bFGF。
[0353] 4天后，收集在培養(yǎng)基中形成的EB細(xì)胞并且在37 °C使用TrypLE消化2-3分鐘，把 EB細(xì)胞分散成單細(xì)胞。細(xì)胞被清洗并以1-5百萬細(xì)胞/ml的密度重懸在EB形成基礎(chǔ)培養(yǎng) 基。所述單細(xì)胞懸液以1:10的比例和成血管細(xì)胞生長培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies， 溫哥華，加拿大）混合。
[0354] 母細(xì)胞生長培養(yǎng)基的配制如下：在總量為IOOml的無血清的甲基纖維素 CFU培 養(yǎng)基中添加如下：VEGF、TPO、FLT3-配體至濃度50ng/ml、bFGF至濃度20-50ng/ml、lml EX-CYTE生長增強(qiáng)培養(yǎng)基補(bǔ)充物和Iml Pen/Strap，混合均勻。
[0355] 混合物經(jīng)渦旋后穿過16G針接種在超低培養(yǎng)皿并在37°C、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)5-9 天。
[0356] 在MSC培養(yǎng)基中重懸單細(xì)胞，該培養(yǎng)基包括：1)含10-20 % FBS的 alpha-MEM(Invitrogen)，或 2)含 10-20 % KOSR 的 alpha-MEM，3)含 10-20 % FBS 的高糖 DMEM，或4)含10-20% KOSR的高糖DMEM。細(xì)胞以100-5000細(xì)胞/cm2的密度培養(yǎng)在包被 基質(zhì)膠、明膠、玻連蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白或膠原I的培養(yǎng)皿。在24小時(shí)后更換該培 養(yǎng)基并且每2-4天更新。在6-12天后，所述細(xì)胞逐漸分化成紡綞狀細(xì)胞，形態(tài)類似典型的 MSC0
[0357] 使用流式細(xì)胞術(shù)染色確定所述hES-MSCs的特征。使用含2% BSA的PBS清洗細(xì)胞 經(jīng)將其封閉，然后根據(jù)廠商說明書進(jìn)行抗體染色檢測(cè)以下細(xì)胞表面標(biāo)記：CD31、CD34、CD29、 CD73、CD90、CD105、CD44、CD45、CD146、CD166、HLA-ABC、HLA-DR、HLA-G (BD Bioscience 或 eBioscience)。在 FACS LSR II 流式細(xì)胞儀上使用 FACSDiva 軟件（BD Bioscience)收集 數(shù)據(jù)，然后使用FlowJo軟件（Treestar)分析獲得的數(shù)據(jù)。
[0358]
[0359] 對(duì)第9天的培養(yǎng)物（HB_d9)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示68. 1 %⑶45+細(xì)胞、 22. 1% CD31+細(xì)胞（上皮祖細(xì)胞）和9. 7%的CD73+細(xì)胞（MSC)(圖2)。
[0360] 這些細(xì)胞接種在基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)皿上，并培養(yǎng)在MSC生長培養(yǎng)基 (Invitrogen)。24小時(shí)后，5-10%的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)皿并且9-14天后，貼壁的細(xì)胞全部分化 為MSC樣細(xì)胞。
[0361] 我們還發(fā)現(xiàn)，在無飼養(yǎng)細(xì)胞、無血清的hESC培養(yǎng)物中添加 GSK3抑制劑BIO可明顯 提高EB和HB的形成率。如圖28所示，在mTesrl培養(yǎng)基中添加 BIO可提升EB培養(yǎng)物的大 小和產(chǎn)量。如圖29所示，在mTesrl培養(yǎng)基中添加 BIO后，EB總數(shù)提高了 3倍。如圖30所 示，與傳統(tǒng)的mTesrl相比，在添加 BIO后CD45細(xì)胞分化的百分率也提高了 3倍，其中CD45 細(xì)胞的分化率代表成血管細(xì)胞分化效率。
[0362] 我們還發(fā)現(xiàn)在分化后，不同hESC細(xì)胞系衍生的細(xì)胞的⑶10的表達(dá)水平有差異。如 圖31所示，來源于MA09的hES-MSC表達(dá)高水平的CD10,但是來源于H9和CT2的hES-MSC 表達(dá)低水平的⑶10,這與BM-MSC相類似。微陣列和流式細(xì)胞術(shù)染色證實(shí)了以上結(jié)果。
[0363] 6· 2實(shí)施例2-hES-HB-MSC另外的特征
[0364] 使用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、多譜系分化和核型分析進(jìn)一步分析從實(shí)施例I 獲得的MSC細(xì)胞。
[0365] 材料和方法
[0366] 流式細(xì)胞術(shù)的方法如實(shí)施例1所述。
[0367] 免疫熒光：細(xì)胞在4%多聚甲醛固定15分鐘，然后溫育在含0.2% Triton X-100 的PBS中，接著在5%山羊血清中封閉。使用含5%山羊血清的PBS稀釋一抗。使用一抗溫 育該細(xì)胞并在4°C過夜，接著用PBS洗3次。偶聯(lián)熒光染料的二抗和該細(xì)胞在室溫溫育30 分鐘，隨后PBS洗3次。最后，在熒光顯微鏡下檢測(cè)該細(xì)胞，并拍攝可見光和熒光圖片。
[0368] hES-MSC的G顯帶核型分析通過康涅狄格大學(xué)斯托斯實(shí)驗(yàn)室的外包服務(wù)完成。
[0369] 微陣列分析：HumanHT_12V3expression BeadChip (illumina)用于微陣列分析， genomic studio V2011. 1 用于數(shù)據(jù)分析。
[0370] MM.
[0371] 在第9-14天獲得的貼壁細(xì)胞后來全部分化為MSC樣細(xì)胞，該細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記 與BM-MSCs的相類似。所述hES-MSCs表達(dá)高水平的CD73(大于99% )、CD90(大于90% )、 CD105(大于 90% )、CD13(大于 85% )、CD29(大于 90% )、CD54(大于 80% )、CD44(大于 99% )和⑶166(大于90% )，但不表達(dá)非MSC標(biāo)記，如⑶31、⑶34和⑶45(圖2和3)。
[0372] 所述hES-MSCs可在體外培養(yǎng)達(dá)10代，此時(shí)還具有正常的核型（圖4)并且它們的 細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)譜和分化能力維持不變。
[0373] 6. 3實(shí)施例3-hES-MSCs在EAE小鼠的預(yù)防模型和治療模型中都減少疾病評(píng)分
[0374] 因?yàn)橐扬@示BM-MSCs可以減緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)的疾病進(jìn)展，這 是一種公認(rèn)的多發(fā)性硬化癥小鼠模型，因此，把從實(shí)施例1中獲得的hES-MSCs注射入EAE 小鼠以確定它們是否具有相同的功效。
[0375] 材料和方法
[0376] 通過如前所述方法誘導(dǎo)EAE小鼠模型（Stromnes和Goverman (2006))。向C57BL/6 小鼠皮下注射EAE誘導(dǎo)試劑盒的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55 (M0G35-55)、弗氏佐劑和 百日咳毒素的混合物（Hooke Laboratories, Inc, MA. (Cat. #EK_0114))，根據(jù)廠商說明書和 Ge等（2012)所述進(jìn)行操作。
[0377] 小鼠在免疫后6天（發(fā)病前）或18天（發(fā)病后）被腹腔注射BM-MSC或hES-MSC 或PBS (空白對(duì)照），注射量為I X IO6個(gè)細(xì)胞/鼠。每天監(jiān)測(cè)小鼠的疾病評(píng)分，共31天。
[0378] 疾病評(píng)分系統(tǒng)如下：
[0379] 0 :沒有疾病的跡象
[0380] 1 :完全尾巴癱瘓
[0381] 2:部分后肢癱瘓
[0382] 3 :完全后肢癱瘓
[0383] 4 :前肢體癱瘓；
[0384] 5 :垂死
[0385] MM.
[0386] 如圖5所示，從三個(gè)hESC細(xì)胞系CT2、MA09和H9衍生的hES-MSCs明顯減少每 曰的疾病評(píng)分，當(dāng)在第6天或發(fā)病前注射，也減少累積的和最高的疾病評(píng)分（圖6)，表明 hES-MSCs具有預(yù)防的功效。被注射CT2hEScs的小鼠呈現(xiàn)最高的疾病評(píng)分，類似于被注射 PBS的對(duì)照小鼠，進(jìn)而排除了在異種移植的可能性。
[0387] 如圖7所示，hES-MSCs處理還對(duì)已經(jīng)發(fā)病的EAE小鼠有治療的效果。當(dāng)在免疫后 第18天（在之后疾病評(píng)分最高）注射hES-MSCs，hES-MSCs處理的小鼠的疾病評(píng)分逐漸下 降，在第30天平均評(píng)分為1. 67,然而，PBS處理的EAE小鼠在同一天的平均評(píng)分為2. 8。
[0388] 6. 4實(shí)施例4-hES-MSCs處理的EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特點(diǎn)
[0389] 進(jìn)一步分析hES-MSCs處理的EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0390] 材料和方法
[0391] 流式細(xì)胞術(shù)的方法如實(shí)施例1所述。在免疫15天后，按實(shí)施例3所述方法使用 PBS或hES-MSC(CT2)處理EAE小鼠，流式細(xì)胞術(shù)分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的Foxp3和 CD25〇
[0392] 在免疫15天后，按實(shí)施例3所述方法使用PBS或hES-MSC(CT2)處理EAE小鼠，通 過往EAE小鼠的左心室灌注20ml冷PBS的方法分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Thl和Thl7細(xì)胞。收 集灌注小鼠的腦和脊髓，并研磨成小塊。經(jīng)膠原酶和胰酶在37°C消化20分鐘后，進(jìn)一步研 磨該組織并經(jīng)40 μ m的濾器過濾。清洗細(xì)胞，并用4ml 40% Percoll重懸細(xì)胞，然后覆蓋 到51111的70%?61'(3〇11。接著在存在6〇]^丨31：(^(130 13;[08(^61106,04)的條件下，使用終濃 度為 50ng/ml 的佛波醋（12-0tetradecanoylphorbol-13_acetate，TPA) (Sigma，M0)和終濃 度為500ng/ml的離子霉素（Sigma，MO)刺激該細(xì)胞6小時(shí)，然后使用抗⑶4-FITC抗體和抗 Q)8-Pacific Blue抗體（BD Bioscience, CA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。根據(jù)廠商說明書，使用 胞內(nèi)染色試劑盒（BD Bioscience，CA)對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行固定和透化，然后對(duì)IFNy和IL-17A 進(jìn)行胞內(nèi)染色。
[0393] 脊髓的病理學(xué)
[0394] 對(duì)石蠟包埋的脊髓橫截面進(jìn)行免疫染色檢測(cè)⑶3 (Biocare Medical)或 Ibal (Waco)，并用抗MBP抗體（Millipore)或f luoromyelin進(jìn)行復(fù)染，免疫染色的方法參 照（Crocker等，2006 ;Moore等，2011)。在脊髓樣本的胸椎和腰椎水平的側(cè)柱截面上，使 用ImageJ(NIH)量化抗MBP抗體的染色強(qiáng)度（Crocker et al.，2006)。對(duì)每個(gè)處理組的每 個(gè)受試者至少分析三個(gè)感興趣的區(qū)域。
[0395] 結(jié)果
[0396] 因?yàn)檎{(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg細(xì)胞，F(xiàn)oxp3+和⑶25+)在抑制炎癥中具有重要的免疫抑制 作用（Hansen等，（2008))，在hES-MSCs和PBS處理的EAE小鼠中，觀察到T細(xì)胞中的Treg 細(xì)胞滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且T細(xì)胞中滲入的Treg細(xì)胞比例并沒有提高（圖8)，表明Treg 細(xì)胞并不參與hES-MSCs的免疫抑制作用。該結(jié)果類似于其他人報(bào)道的BM-MSC對(duì)EAE小鼠 的作用（Zappia 等（2005))。
[0397] 與PBS (對(duì)照）處理的或hESC處理的小鼠相比，從hES-MSC處理的小鼠中樞神經(jīng) 系統(tǒng)分離得到更少⑶4+、⑶8+、Thl和Thl7T細(xì)胞（圖9)，表明減少炎癥性T細(xì)胞可能對(duì) hES-MSC處理小鼠的癥狀改善有貢獻(xiàn)。
[0398] 病理上，通過媽離子結(jié)合適配器分子I (ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA1)免疫染色分析脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的一 種信號(hào)。與PBS處理組相比，hES-MSC處理組的EAE小鼠脊髓IBAl染色減少（圖10)。相 應(yīng)地，與對(duì)照組相比，在hES-MSC處理組的EAE小鼠中，滲入脊髓的T細(xì)胞（⑶3+細(xì)胞）減 少。
[0399] 脊髓的髓鞘結(jié)合蛋白（MBP)免疫染色結(jié)果顯示，與PBS處理組相比，hES-MSC處理 組小鼠的脫髓鞘減少（圖10和11)，表明hES-MSC可阻止和/或修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥 損傷并且保護(hù)髓鞘完整。
[0400] 6. 5實(shí)施例5-CNS的證據(jù)表明hES-MSCs比BM-MSC在體外具有更強(qiáng)的抗EAE作用長 期以來，BM-MSC用于治療自身免疫性疾病，包括各種動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)的MS，然而治療 效果不一，有提高反應(yīng)的，也有無變化的（Tyndall，2011)，因此在本研宄中比較hES-MSCs 和人BM-MSC的治療作用。
[0401] 材料和方法
[0402] 在免疫6天后，將如實(shí)施3所述的EAE小鼠腹膜腔內(nèi)注射PBS、BM-MSC和 hES-MSCs (MA09)，注射量都為IO6個(gè)細(xì)胞。疾病評(píng)分如實(shí)施例3所述。
[0403] 對(duì)滲入BM-MSC處理組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的T細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，方法如實(shí) 施例4所述。
[0404] MM.
[0405] 從6個(gè)來源獲得的5個(gè)人BM-MSC細(xì)胞系都不能減少EAE小鼠的疾病評(píng)分，只有一 個(gè)BM-MSC細(xì)胞系適度地減少1個(gè)疾病評(píng)分，這與hES-MSC呈現(xiàn)的強(qiáng)大抗EAE作用形成鮮明 的對(duì)比（圖12)。
[0406] 與PBS和hES-MSC處理的EAE小鼠相比，在BM-MSC處理的EAE小鼠中，滲入中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的Thl7細(xì)胞在⑶4T細(xì)胞中的化例更高，表明BM-MSC可促進(jìn)Thl7細(xì)胞分化。在 計(jì)算滲入的總Thl和Thl7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，所有3個(gè)BM-MSC細(xì)胞系顯著地提高了 Thl7細(xì)胞 數(shù)量（圖13)，并且只有一個(gè)細(xì)胞系提高Thl細(xì)胞總數(shù)，而hES-MSCs減少Thl和Thl7細(xì)胞 (實(shí)施例4)?？偠灾?，該結(jié)果表明BM-MSC在體內(nèi)不僅不能抑制Thl反應(yīng)，還增強(qiáng)了 Thl7 反應(yīng)。在PBS處理組和BM-MSC處理組小鼠的脊髓中，MBP的熒光髓鞘染色減少表明該小鼠 受到嚴(yán)重?fù)p傷，而hES-MSC處理組小鼠的MBP水平保持不變（圖14)。在BM-MSC處理組小 鼠的損傷區(qū)域還呈現(xiàn)很多DAPI陽性細(xì)胞，表明有更多的炎癥細(xì)胞滲入。
[0407] 6. 6實(shí)施例6-hES-MSCs可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)
[0408] 眾所周知，BBB和BSCB在阻止T細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面起到重要的作用，因 此我們想知道他們是否也阻止MSC進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0409] 材料和方法
[0410] 如實(shí)施例1所述的、穩(wěn)定表達(dá)GFP的hESC細(xì)胞系Envy (Costa等，2005)分化的 MSC和帶GFP標(biāo)簽的人BM-MSCOtofstetter等，2002)被注射入免疫6天后的EAE小鼠，并 且在免疫14天后分離脊髓。
[0411] GFP+細(xì)胞迀移穿過脊髓。
[0412] MM.
[0413] 如圖18所示，只有GFP+hES-MSC迀移出血管并進(jìn)入脊髓血管周圍的薄壁組織，然 而，GFP+BM-MSC僅存在血管內(nèi)。薄壁組織發(fā)炎的小靜脈顯示GFP+hES-MSC的薄壁組織定位， 表明該細(xì)胞溢出了。相反，GFP+BM-MSC處理的小鼠出現(xiàn)更多"管腔限制的"GFP免疫反應(yīng)性 (圖15A)，發(fā)炎的腦膜小靜脈也呈現(xiàn)少量的GFP+BM-MSCs溢出，而在接受GFP+hES-MSCs的 處理小鼠中溢出更多（圖15B)。
[0414] 這些結(jié)果表明只有hES-MSCs而非BM-MSCs，能溢出血管而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0415] 6. 7實(shí)施例6-hES-MSCs比BM-MSCs對(duì)T細(xì)胞功能的體外抑制作用更強(qiáng)
[0416] T細(xì)胞在體外受到抗原刺激后，比較hEs-MSCs和BM-MSCs抑制T細(xì)胞增殖的能力。
[0417] 材料和方法
[0418] 使用從小鼠外周淋巴結(jié)分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。這些淋巴細(xì)胞 在37°C用5 μΜ的酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE)標(biāo)記10分鐘，通過觀測(cè)CFSE的稀釋追蹤細(xì)胞 增殖。10000個(gè)hES-MSCs或BM-MSCs與100000個(gè)淋巴細(xì)胞混合在96孔板中，并且連接在 培養(yǎng)板上的抗⑶3抗體（0. 2、0. 6、2和6 μ g/ml)和可溶的抗⑶28抗體（eBioscience，CA) 刺激細(xì)胞增殖。在刺激3天后收集細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+和CD8+細(xì)胞。
[0419] 結(jié)果
[0420] 通過小鼠淋巴細(xì)胞的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以濃度為0. 2和0. 6 μ g/ml，或0. 1和 0. 3 μ g/ml的抗⑶3抗體刺激時(shí)，hES-MSCs抑制小鼠⑶4+和⑶8+T細(xì)胞增殖，而BM-MSC僅 在低濃度抗⑶3抗體刺激時(shí)才具有抑制作用，如0. 2或0. 1 μ g/ml (圖16和17).
[0421] 6. 8實(shí)施例7-進(jìn)一步證明hES-MSCs比BM-MSCs對(duì)T細(xì)胞功能的體外抑制作用更 強(qiáng)
[0422] 材料和方法
[0423] 從小鼠脾臟分離⑶4+T細(xì)胞，并使用幼稚⑶4T細(xì)胞富集試劑盒（Stem Ce 11 Technologies,加拿大）進(jìn)一步純化，然后進(jìn)行ThO、Thl和Thl7細(xì)胞的體外試驗(yàn)。該 細(xì)胞以1:10的比例與hES-MSCs或BM-MSCs溫育，或與PBS溫育，隨后Thl或Thl7分化 5天。在以下條件下使用抗CD3抗體和抗CD28抗體刺激細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)在包含終濃度 為5ng/ml的rhIL-2的培養(yǎng)基中以保持ThO狀態(tài)，使用終濃度為5 μ g/ml的抗-mIL-4抗 體（eBioscience，CA)、終濃度為 5ng/ml 的 rhIL_2(eBioscience，CA)和終濃度為 IOng/ ml的mIL-12 (PeproTech, CA)誘導(dǎo)Thl分化，并且使用終濃度為5ug/ml的抗-mIL4 抗體、終濃度為5ug/ml的抗-mIFN γ抗體（eBioscience, CA)、終濃度為20ng/ml的 rmIL_6(Peprotech，CA)和終濃度為 lng/ml 的 rhTGF-β I (Peprotech, CA)誘導(dǎo) Thl7 分化。 在某些組中，在培養(yǎng)物中添加終濃度為10 μ g/ml的抗-hIL-6抗體（eBioscience, CA)。在 24孔板中以0. 3 X IO6個(gè)細(xì)胞/孔接種幼稚CD4T細(xì)胞。通過80Gy輻射1小時(shí)，使hES-MSC 或BM-MSC的有絲分裂停止。通過流式細(xì)胞術(shù)分析IFN γ +和IL-17+細(xì)胞。
[0424] MM.
[0425] 如實(shí)施例5和圖18所示，由于與hES-MSC處理組小鼠相比，在BM-MSC處理組小鼠 中，發(fā)現(xiàn)更多的Thl7和Thl細(xì)胞滲入中中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此，在hES-MS和BM-MSC存在或不 存時(shí)，在體外檢測(cè)這些T細(xì)胞亞型。
[0426] 如圖18所示，在Thl條件下，hES-MSC減少分化得到的Thl (IFNy +/IL-17-)細(xì) 胞（從29. 7 %降至18. 0 % )。相反，所有BM-MSC細(xì)胞系或不能改變或提高Thl分化（從 26. 9%升至 43. 6% )。
[0427] 在Thl7分化條件下，hES-MS和BM-MSC都下降Thl7細(xì)胞的比例，但出人意料地， 所有BM-MSC細(xì)胞系提高了產(chǎn)生IFN γ細(xì)胞的比例，但hES-MSCs沒有。
[0428] 這些結(jié)果表明在Thl條件下，BM-MSC不能抑制Thl細(xì)胞分化，并且在Thl7條件下 促進(jìn)了 Thl細(xì)胞分化。BM-MSC在體外的復(fù)雜作用反應(yīng)其在EAE小鼠的復(fù)雜作用。
[0429] 6. 9實(shí)施例8-hES-MSCs和BM-MSCs的基因表達(dá)譜
[0430] 進(jìn)行微陣列分析以比較hES-MSCs和BM-MSCs的基因表達(dá)譜。
[0431] 材料和方法
[0432] 根據(jù)廠商說明書，利用Trizol (Invitrogen，CA)提取第2-4代hES-MSC或第3代 BM-MSC的RNA，并進(jìn)行微陣列分析。使用人HT-12v4表達(dá)微珠芯片（Illumina，圣地亞哥， 加拿大）分析所述細(xì)胞的基因表達(dá)譜。使用Genome Studio V2011.1分析數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)檢 測(cè)兩個(gè)不同來源的BM-MSC細(xì)胞系和兩個(gè)hES-MSC細(xì)胞系，分別由H9和MA09衍生。
[0433] 流式細(xì)胞述分析如實(shí)施例1所述。
[0434]
[0435] 如表1所示，hES-MSCs和BM-MSCs樣本的總基因表達(dá)譜非常相似，在這些樣本中， 抗炎基因如HLA-G、HGF、C0X2、IDOl和iNOS的表達(dá)水平相似。
[0436] 表 1
[0437]
【權(quán)利要求】
1. 一種選擇臨床級(jí)別hES-MSC用于治療自身免疫性疾病的方法，所述MSC具有W下特 征；（i)包含〉95 %的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)包含〉80 %的細(xì)胞表達(dá)組-2標(biāo)記；（iii)包 含巧％的細(xì)胞表達(dá)組-3標(biāo)記；（iv)表達(dá)比-10和TGF0 ; (V)包含<2%的細(xì)胞表達(dá)IL-6、 比-12和TNF a ; (Vi)包含<0. 001 %的細(xì)胞共表達(dá)所有組-4標(biāo)記，其中，組-1標(biāo)記是； CD73、CD90、CD105、CD146、CD166 和 CD44,組-2 標(biāo)記是；CD13、CD29、CD54 和 CD4犯，組-3 標(biāo) 記是；CD45、CD：M、CD31 和 SSEA4,組-4 標(biāo)記是；0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞不表達(dá)比-6、比-12和TNF a。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞表達(dá)TGF-0 UTGF-0 2和IL10。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞不表達(dá)CCL2、MMP2和RA(iE。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞與BM-MSC相比較，表達(dá)低水平的IFN丫 R1和 IFN丫R2。
6. -種修飾間充質(zhì)干細(xì)胞W產(chǎn)生一群修飾的MSC的方法，，所述修飾的MSC具有W下特 征；（i)包含〉95%的細(xì)胞表達(dá)組-1標(biāo)記；（ii)包含〉80%的細(xì)胞表達(dá)組-2標(biāo)記；（iii)包 含巧％的細(xì)胞表達(dá)組-3標(biāo)記；（iv)表達(dá)比-10和TGF0 ; (V)包含<2%的細(xì)胞表達(dá)IL-6、 比-12和TNF a ; (vi)包含<0. 001 %的細(xì)胞共表達(dá)所有組-4標(biāo)記，其中，組-1標(biāo)記是； CD73、CD90、CD105、CD146、CD166 和 CD44,組-2 標(biāo)記是；CD13、CD29、CD54 和 CD4犯，組-3 標(biāo) 記是；CD45、CD：M、CD31 和 SSEA4,組-4 標(biāo)記是；0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包含降低IL-6、IL-6受體、IL12、TNF a或其組合的 表達(dá)的步驟。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包含降低MMP2、CCL2、RAGE或其組合的表達(dá)的步驟。
9. 權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包含通過shRNA、miRNA增加TGF- M、TGF- 0 2和/ 或IL10的表達(dá)的步驟。
10. 權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包含降低IFN丫 R1、IFN丫 R2、IFN丫或其組合的表 達(dá)水平的步驟。
11. 一種生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括： a. 使用含或不含GSK3抑制劑的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞； b. 將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在包含血管內(nèi)皮生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4炬MP4)的無血 清培養(yǎng)基中，其中，血管內(nèi)皮生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的量足W誘導(dǎo)所述人胚胎干細(xì) 胞分化為胚狀體； C.向所述培養(yǎng)物中添加至少一種生長因子，其中，所述生長因子的量足W擴(kuò)增人血管 瘤集落形成細(xì)胞； d. 把所述血管瘤集落形成細(xì)胞分散成單細(xì)胞；和 e. 將所述單細(xì)胞培養(yǎng)在包含血清、KOSR的培養(yǎng)基或其它無血清培養(yǎng)基中，其中，培養(yǎng) 基的量足W誘導(dǎo)所述單細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中，至少約95%的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD73。
13. 權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包含福射所述間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟。
14. 權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述方法獲得10000至IX 10 W個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞。
15. 通過權(quán)利要求1所述方法選擇的hES-MSC，進(jìn)一步具有W下特征： a.表達(dá)CD73 ;并且 b.低水平表達(dá)或不表達(dá)IL-6。
16. 通過權(quán)利要求1所述方法選擇的hES-MSC，其特征還在于：
3.表達(dá)至少一個(gè)^下細(xì)胞標(biāo)記；〔090、〔0105、〔013、〔029、〔054、〔0146、〔0166和〔044; b.不表達(dá)或低水平表達(dá)至少一個(gè)下述細(xì)胞標(biāo)記；CD34、CD31和CD45 ;并且 C.不表達(dá)或低水平表達(dá)至少一個(gè)下述標(biāo)記；MMP、RAGE、IFN丫 R1、IFN丫 R2、IL-12、 TNF 口和 VCAM1。
17. 權(quán)利要求15所述的hES-MSC，進(jìn)一步受到福射。
18. 權(quán)利要求16所述的hES-MSC，進(jìn)一步受到福射。
19. 一種包含權(quán)利要求15所述hES-MSC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
20. -種包含權(quán)利要求16所述hES-MSC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
21. -種包含權(quán)利要求17所述hES-MSC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
22. -種包含權(quán)利要求18所述hES-MSC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
23. -種藥物制劑，其包含權(quán)利要求15所述的hES-MSC W及藥學(xué)上可接受的載體。
24. -種藥物制劑，其包含權(quán)利要求16所述的hES-MSC W及藥學(xué)上可接受的載體。
25. -種藥物制劑，其包含權(quán)利要求17所述的hES-MSC W及藥學(xué)上可接受的載體。
26. -種藥物制劑，其包含權(quán)利要求18所述的hES-MSC W及藥學(xué)上可接受的載體。
27. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求15所述的hES-MSC,施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞相關(guān)自身 免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病。
28. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求15所述的hES-MSC,施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
29. -種治療T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其的受試者施 用權(quán)利要求16所述的hES-MSC,施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)自 身免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
30. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求16所述的hES-MSC,施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
31. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求17所述的hES-MSC,施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞相關(guān)自身 免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
32. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求17所述的hES-MSC,施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
33. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求18所述的hES-MSC,施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞相關(guān)自身 免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
34. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求18所述的hES-MSC,施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
35. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求23的藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫 性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
36. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求23的藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
37. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求24的藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞 相關(guān)自身免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
38. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求24的藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
39. -種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求25的藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫 性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
40. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求25的藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
41. 一種治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求26的藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞 相關(guān)自身免疫性疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)自身免疫性疾病。
42. -種預(yù)防T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，該方法包括向需要其 的受試者施用權(quán)利要求26的藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所 述疾病的程度或減緩它的發(fā)展。
43. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求15所 述的hES-MSC，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
44. 一種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求15所 述的hES-MSC，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
45. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求16所 述的hES-MSC，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
46. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求16所 述的hES-MSC，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
47. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求17所 述的hES-MSC，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
48. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求17所 述的hES-MSC，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
49. 一種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求18所 述的hES-MSC，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
50. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求18所 述的hES-MSC，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
51. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求23的 藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
52. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求23的 藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
53. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求24的 藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
54. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求24的 藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
55. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求25的 藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
56. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求25的 藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
57. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求26的 藥物制劑，施用的量足W改善或減輕所述疾病至少一種癥狀或逆轉(zhuǎn)所述疾病。
58. -種預(yù)防多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括向需要其的受試者施用權(quán)利要求26的 藥物組合物，施用的量足W防止所述疾病的發(fā)展或最小化所述疾病的程度或減緩它的發(fā) 展。
59. -種穿過血腦屏障和/血脊髓屏障遞送藥劑的方法，所述方法包括W下步驟：把藥 劑連接到MSC W形成MSC-藥劑復(fù)合物，并向需要其的受試者施用該MSC-藥劑復(fù)合物，其 中，所述人胚胎-間充質(zhì)干細(xì)胞能夠穿過血腦屏障和/血脊髓屏障，所述藥劑用于治療、預(yù) 防或診斷有此需要受試者的疾病或損傷。
60. 試劑盒，其包含權(quán)利要求15所述hES-MSC和載體。
61. 權(quán)利要求60所述的試劑盒，進(jìn)一步包含融解劑、免疫抑制增強(qiáng)劑、抗組胺。
62. 權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞用丫射線福射。
63. 權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞用飽137 丫射線福射或X-射線 光子福射。
64. -種治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的 權(quán)利要求26所述藥物組合物。
65. 權(quán)利要求64所述的方法，進(jìn)一步包含施用第二治療劑。
66. 權(quán)利要求64所述的方法，其中，所述受試者W前用治療劑治療過。
67. 權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述MSC被W下方式修飾；基因修飾、表觀遺傳調(diào) 控、小分子處理、營養(yǎng)物處理、天然化合物處理或抗體處理。
68. 修飾的MSC，其通過權(quán)利要求6所述方法生產(chǎn)。
69. 包含權(quán)利要求68所述修飾的MSC的細(xì)胞培養(yǎng)物。
70. 藥物制劑，其包含權(quán)利要求68所述修飾的MSC和藥學(xué)上可接受的載體。
71. -種預(yù)防或治療T細(xì)胞和/或B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括 向需要其的受試者施用治療有效量的修飾的MSC，其中，所述修飾的MSC通過權(quán)利要求6所 述方法生產(chǎn)。
72. -種預(yù)防或治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療 有效量的修飾的MSC，其中，所述修飾的MSC通過權(quán)利要求6所述方法生產(chǎn)。
73. 試劑盒，其包含權(quán)利要求68所述修飾的MSC和載體。
74. 權(quán)利要求73所述的試劑盒，進(jìn)一步包含融解劑、免疫抑制增強(qiáng)劑、抗組胺。
75. 權(quán)利要求68所述修飾的MSC，其用丫射線福射。
76. 權(quán)利要求75所述修飾的MSC，其中，所述福射是飽-137 丫福射或使用X射線的光 子福射。
77. 權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述MSC通過W下方式修飾；shRNA、miRNA、敲除、敲 入、嗎咐代、引誘RNA、DNA甲基化調(diào)控、組蛋白甲基化調(diào)控、翻譯抑制和/或抗體阻斷，或其 組合。
78. 通過權(quán)利要求6所述方法生產(chǎn)的修飾的MSC，并且還具有W下特征： a. 表達(dá)CD73 ;和 b. 低水平或不表達(dá)表達(dá)IL-6。
79. 通過權(quán)利要求6所述方法生產(chǎn)的修飾的MSC，其特征還在于：
3.表達(dá)至少一種^下細(xì)胞標(biāo)記；〔090、〔0105、〔013、〔029、〔054、〔0146、〔0166和〔044。 b.低水平表達(dá)或不表達(dá)至少一種選自下述的細(xì)胞標(biāo)記；CD34、CD31和CD45 ;并且 C.低水平表達(dá)或不表達(dá)至少一種選自下述的標(biāo)記；MMP、RAGE、IFN丫 R1、IFN丫 R2、 比-12、TNFa 和 VCAM1。
80. -種條件培養(yǎng)基、所述條件培養(yǎng)基的濃縮液、細(xì)胞裂解物或其衍生物，其通過權(quán)利 要求6所述方法生產(chǎn)。
81. -種條件培養(yǎng)基、所述條件培養(yǎng)基的濃縮液、細(xì)胞裂解物或其衍生物，其通過權(quán)利 要求11所述方法生產(chǎn)。
82. 權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述MSC是BM-MSC、hES-MSC或成體組織來源的MSC。
83. -種共培養(yǎng)權(quán)利要求15的hES-MSC與骨髓造血干細(xì)胞和/或廝帶造血干細(xì)胞的方 法。
84. 權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述hES-MSC表達(dá)Stro-3。
85. 權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述hES-MSC表達(dá)Stro-1。
86. 權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述hES-MSC表達(dá)巢蛋白。
87. 權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述hES-MSC是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。
88. -種權(quán)利要求15的hES-MSC和骨髓造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
89. -種權(quán)利要求15的hES-MSC和廝帶造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
90. -種權(quán)利要求15的hES-MSC和外周血造血干細(xì)胞的共培養(yǎng)物。
91. 權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過流式細(xì)胞術(shù)、多重微陣列、RT-PCR、RNA印跡或蛋 白質(zhì)印跡鑒定所述MSC的特征。
92. 權(quán)利要求6所述的方法，其中，通過流式細(xì)胞術(shù)、多重微陣列、RT-PCR、RNA印跡或蛋 白質(zhì)印跡鑒定所述MSC的特征。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104471059SQ201380037010
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】王小方, 徐仁和 申請(qǐng)人:愛姆斯坦生物技術(shù)公司