人乳干細(xì)胞的獲取方法及人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法
【專利說(shuō)明】人乳干細(xì)胞的獲取方法及人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞獲取方法及其干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建的方法，尤其涉及一種人乳干細(xì)胞的獲取方法及人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞研宄是近年來(lái)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點(diǎn)之一。1999年，《Science》將人類胚胎干細(xì)胞研宄成果評(píng)為當(dāng)年世界十大科技進(jìn)展之首，2000年，《Time》周刊將其列為20世紀(jì)末世界十大科技成就之首，并認(rèn)為胚胎干細(xì)胞和人類基因組將同時(shí)成為新世紀(jì)最具發(fā)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。至此干細(xì)胞研宄成為近年來(lái)生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點(diǎn)之一。干細(xì)胞是在生物個(gè)體的生長(zhǎng)和發(fā)育中起“主干”作用的原始細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。近幾年研宄表明，成體干細(xì)胞的分化能力遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)觀點(diǎn)所局限的范圍。因此目前干細(xì)胞的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于利用胚胎干細(xì)胞的全能性去研宄組織細(xì)胞再生，也不再局限于只用組織本身的起始干細(xì)胞做細(xì)胞治療研宄，而是趨于尋找更多的干細(xì)胞來(lái)源，通過(guò)研宄他們的分化潛能，體外擴(kuò)增能力，分化后的細(xì)胞功能以及取材是否安全方便等問(wèn)題，選擇最合適的干細(xì)胞來(lái)源來(lái)進(jìn)行未來(lái)的細(xì)胞治療應(yīng)用。
[0003]最新研宄發(fā)現(xiàn)，在人類母乳中包含有豐富的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞可以分化為身體的其他細(xì)胞，比如骨骼細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和腦細(xì)胞等。許多研宄表明，從人類乳汁中成功提取出來(lái)的人乳干細(xì)胞與其他間充質(zhì)干細(xì)胞基本類似，表達(dá)相同的表面抗原，并且能夠在體外擴(kuò)增，同時(shí)具有較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能。此外，人乳干細(xì)胞來(lái)源廣泛，獲得方式也比較容易，安全無(wú)痛苦，且在體外培養(yǎng)穩(wěn)定，擴(kuò)增速度快，不易衰老。因此，人乳干細(xì)胞在未來(lái)細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重大的應(yīng)用潛力。
[0004]為了便于人們有效儲(chǔ)存和應(yīng)用干細(xì)胞資源，目前在世界不同國(guó)家范圍內(nèi)，已經(jīng)建立了多個(gè)干細(xì)胞庫(kù)。所謂干細(xì)胞庫(kù)是將干細(xì)胞儲(chǔ)存于約為_(kāi)196°C液氮中及搜集存放干細(xì)胞資源相關(guān)資料的場(chǎng)所。按所儲(chǔ)存的干細(xì)胞來(lái)源和采集方式，干細(xì)胞庫(kù)主要可分為胚胎干細(xì)胞庫(kù)、成體干細(xì)胞庫(kù)以及病理細(xì)胞庫(kù)，成體干細(xì)胞庫(kù)中包括臍血干細(xì)胞庫(kù)、脂肪干細(xì)胞庫(kù)、以及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)。一個(gè)完善的干細(xì)胞庫(kù)應(yīng)具備隨時(shí)隨地將儲(chǔ)存的健康干細(xì)胞提供臨床使用的能力。目前尚無(wú)人乳干細(xì)胞庫(kù)，因此，構(gòu)建人乳干細(xì)胞庫(kù)，將人健康的人乳干細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明建立的系統(tǒng)工程技術(shù)儲(chǔ)存建庫(kù)，是將現(xiàn)有的資源充分利用的有效方法，為儲(chǔ)存本人、家屬和他人在需要采用人乳干細(xì)胞移植及相關(guān)技術(shù)治療的各種疾病時(shí)，提供臨床適用型人乳干細(xì)胞，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種人乳干細(xì)胞的獲取方法以及人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，其具有成本低、應(yīng)用前景廣闊，可為臨床和研宄提供大量干細(xì)胞資源的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明提供的一種人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
I)人乳汁的采集:采集乳汁之前，采集供者的可確認(rèn)身份的信息，優(yōu)選需經(jīng)供者簽訂知情同意書(shū)后，方能采集，知情同意書(shū)中通常包括供者姓名、年齡、身份證號(hào)、通訊地址、聯(lián)系方式等信息。簽訂同意書(shū)后，對(duì)供者進(jìn)行至少ABO/Rh血型檢測(cè)、HLA分型的檢測(cè)以及HIV、HBV, HCV的檢測(cè)，然后在無(wú)菌條件下采集供者的乳汁；
2)獲取和分離人乳干細(xì)胞:取出采集的乳汁，在無(wú)菌條件下加入營(yíng)養(yǎng)液稀釋2-3倍，在250-800 g下離心10-20min，去除上層的油脂和奶狀液體。底層的細(xì)胞用無(wú)菌的平衡磷酸鹽緩沖溶液清洗2-3次，最后用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并接種至細(xì)胞培養(yǎng)裝置如細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37°C，5%0)2的條件下培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮的干細(xì)胞培養(yǎng)液，待長(zhǎng)至80-90%時(shí)即得到原代的人乳干細(xì)胞；
3)人乳干細(xì)胞的培養(yǎng):將獲得的原代人乳干細(xì)胞以0.1 X 15-L O X 15個(gè)細(xì)胞/cm 2的密度接種在細(xì)胞培養(yǎng)裝置如細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿如鋪滿整個(gè)平皿(10mm)后，去除如吸棄舊培養(yǎng)液，使用磷酸緩沖鹽溶液如1mL清洗如一遍，之后用0.25%消化液(通常預(yù)熱20分鐘左右)如2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見(jiàn)單層細(xì)胞呈塊狀脫落或在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分離，立刻加細(xì)胞培養(yǎng)液如5ml終止消化，輕柔吹打如8-10次成單細(xì)胞；800-1000rpm離心5_6分鐘，棄上清，加干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行輕柔吹打；之后將細(xì)胞懸液1:4傳到細(xì)胞培養(yǎng)裝置如10mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加干細(xì)胞培養(yǎng)液，如每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿加1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長(zhǎng)滿，期間不用換液，獲得更多的人乳干細(xì)胞；
4)人乳干細(xì)胞的檢測(cè)與凍存:
人乳干細(xì)胞的檢測(cè):待人乳細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，去除舊的培養(yǎng)液，加入無(wú)菌的平衡磷酸鹽緩沖溶液清洗，之后去除平衡磷酸鹽緩沖溶液，接著加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C條件下消化3-5分鐘，優(yōu)選在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，并用手輕輕的拍打培養(yǎng)皿，以幫助細(xì)胞脫落，待細(xì)胞全部脫落后，加入等體積的干細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻，以終止消化。將終止消化后的人乳干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-6分鐘，結(jié)束后去除上清，收獲得到人乳干細(xì)胞。將收獲的一部分人乳干細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，包括無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、細(xì)胞活性檢測(cè)、分化能力檢測(cè)以及流式細(xì)胞檢測(cè)等，以確定細(xì)胞是否達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，其余同批次得到的人乳干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凍存；
人乳干細(xì)胞的凍存:將上述獲得的同批次的人乳干細(xì)胞利用人乳干細(xì)胞凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 16-1 X 17個(gè)/mL,分裝入凍存容器中，封蓋，并做好編號(hào)，立即進(jìn)行程序式降溫，之后放入到_196°C的液氮中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞凍存時(shí)做好所有的凍存記錄，符合干細(xì)胞冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)，儲(chǔ)存環(huán)境定期檢測(cè)。
[0007]其中，人乳干細(xì)胞的檢測(cè)與凍存同時(shí)進(jìn)行，即當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出來(lái)之后，細(xì)胞已經(jīng)凍存，這時(shí)將檢測(cè)不合格的細(xì)胞按照其編號(hào)將相應(yīng)的凍存細(xì)胞連同凍存管一同廢棄，做好記錄，之后由專門人員進(jìn)行處理；
5)建庫(kù):在儲(chǔ)存入庫(kù)的容器載體上建立人乳干細(xì)胞的相關(guān)信息，將前述所采集的供者的基本信息和相應(yīng)人乳干細(xì)胞制備及其細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建過(guò)程的相關(guān)信息錄入計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)，并按檢索編碼調(diào)出相關(guān)記錄與供者資料進(jìn)行核實(shí)，納入人乳干細(xì)胞庫(kù)管理，即完成人乳干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建。
[0008]其中，步驟2)所述的營(yíng)養(yǎng)液是含有支持干細(xì)胞生長(zhǎng)的糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM等；
所述的平衡磷酸鹽緩沖溶液主要是含有無(wú)機(jī)鹽的水溶液，可以是PBS鹽緩沖溶液，D-Hanks鹽緩沖溶液，SPB鹽緩沖溶液等，能夠維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定；
所述的干細(xì)胞培養(yǎng)液是含有支持干細(xì)胞生長(zhǎng)的糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM以及自制的含10_20%的血清或無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0009]步驟4)所述的干細(xì)胞凍存液是含有細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，一般常用DMSO —類滲透性保護(hù)劑，可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷，同時(shí)也含有血清以及干細(xì)胞基本培養(yǎng)基，包括DMEM、a -MEM等，其中，冷凍保護(hù)劑(如DMS0)，血清和干細(xì)胞基本培養(yǎng)基的配比為1:2:7。
[0010]步驟4)所述的程序式降溫方法，包括4°C保存40-60min，-20°C保存l_2h，-80°C過(guò)夜，最后存入到_196°C液氮，或者，也可以直接置于程序性降溫盒中，放入_80°C冰箱過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)到_196°C的液氮中。
[0011]本發(fā)明提供的一種人乳干細(xì)胞的獲取方法，包括如下步驟:
1)人乳汁的采集:采集乳汁之前，采集供者的可確認(rèn)身份的信息，優(yōu)選需經(jīng)供者簽訂知情同意書(shū)后，方能采集，知情同意書(shū)中通常包括供者姓名、年齡、身份證號(hào)、通訊地址、聯(lián)系方式等信息。簽訂同意書(shū)后，對(duì)供者進(jìn)行至少ABO/Rh血型檢測(cè)、HLA分型的檢測(cè)以及HIV、HBV, HCV的檢測(cè)，然后在無(wú)菌條件下采集供者的乳汁；
2)獲取和分離人乳干細(xì)胞:取出采集的乳汁，在無(wú)菌條件下加入營(yíng)養(yǎng)液稀釋如2-3倍，在250-800 g下離心10-20min，去除上層的油脂和奶狀液體。底層的細(xì)胞用無(wú)菌的平衡磷酸鹽緩沖溶