一種利用復合菌種協(xié)同作用處理六價鉻污染的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種處理重金屬鉻污染的方法，具體涉及一種利用復合菌種協(xié)同作用處理六價鉻污染的方法，屬于環(huán)境生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]鉻被廣泛應用于電鍍、印染、制革、冶金等行業(yè)，含鉻廢水和鉻渣的處理不當造成的污染越來越嚴重，鉻在自然界主要以三價鉻和六價鉻的形態(tài)存在，三價鉻不易溶于水，與土壤等介質的結合力強，流動性差，毒性較小，而六價鉻迀移性強，具有較高的生物毒性，能引起畸變和癌癥，損傷內臟器官，是對人體有較大危害的工業(yè)污染物。
[0003]目前治理含鉻廢水的方法主要有化學還原法、化學沉淀法、電化學沉淀法、萃取、反滲透、電滲析、液膜法等物理化學方法以及生物絮凝法、生物還原法、生物吸附法等生物學方法。物理化學方法存在有投資較大、運行維護成本較高、處理后的水質很難達到回用標準并且存在二次污染的可能；而生物法處理鉻污染廢水主要是通過生物還原和生物吸附作用，所具有的投資少，運行費用低，原料廉價，除鉻效果好，無二次污染等優(yōu)點，使該法具有廣闊的發(fā)展前景。生物還原類型可分為:1.微生物以Cr6+作為呼吸鏈的最終電子受體被還原；2.微生物體內代謝過程中產生的可溶性酶將六價鉻還原成三價鉻；3.微生物代謝過程中產生的還原性次級代謝產物還原六價鉻。生物吸附是利用微生物的細胞壁、細胞膜等結構的構成組分所含有的羧基、羥基、巰基等官能團的活性化學作用吸附六價鉻，目前已經有大量的微生物被證實能夠在好氧或者厭氧環(huán)境下能夠還原六價絡，如Arthrobacter sp.，Bacillus sp., Providencia sp., Microbacterium sp., Serratia sp.等。但目前該方法的研宄主要局限于單一菌株或菌群，由于純培養(yǎng)自身的條件較為苛刻，菌種培養(yǎng)周期長、費用高，限制了其應用。
[0004]中國發(fā)明“一種用于鉛鉻污染修復的芽孢桿菌CP-1及其應用”，申請?zhí)?01410807594.7 ;中國發(fā)明“鉻污染土壤復合微生物修復劑及其制備方法和應用”，申請?zhí)?01410681388.6 ;中國發(fā)明“一種堿性鉻污染土壤的微生物修復方法”，申請?zhí)?01210355258.4 ;中國發(fā)明“一株能生物修復重金屬污染土壤的菌株及生物修復方法”，申請?zhí)?01110050792.X，公開的都是采用單一菌株生物修復鉻污染的方法。
[0005]因此通過篩選除鉻菌株的馴化、分離、純化、復合培養(yǎng)等技術手段，培養(yǎng)制備協(xié)同作用的復合菌劑，提高微生物對處理廢水進水水質的耐受能力、降低處理成本，對生物處理法的實際應用有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術物理化學方法以及單一微生物治理六價鉻污染的不足，提供一種利用復合菌種協(xié)同作用處理六價鉻污染的方法。復合菌種從同一土壤環(huán)境中篩選得到，菌種之間無拮抗作用，利用地霉菌生長代謝的適宜PH偏酸，芽孢桿菌的適宜PH偏堿的特性，將兩株菌種單獨培養(yǎng)分別得到單一菌液，再將菌液(體積比1:1)接種于同一污染水體中混合培養(yǎng)用于處理六價鉻污染，使混合菌能夠處理酸性和堿性廢水，擴大菌劑對進水酸堿度的適應范圍，酸性進水時，芽孢桿菌優(yōu)先大量繁殖，代謝產物積累，溶液pH降低，為地霉菌生長創(chuàng)造條件，地霉菌開始大量繁殖，生物量的增加使六價鉻含量及有機物含量快速降低，水質得到凈化，而堿性進水時適宜地霉菌生長，地霉菌短時間內大量增殖還原、吸附六價鉻，消耗有機質，水質得到凈化。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
一種利用復合菌種協(xié)同作用處理六價鉻污染的方法，馴化篩選步驟:
(1)取鉻污染土壤樣品10g加入到100 ml牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h，搖床轉速為120 rpm ；
(2)取步驟(I)培養(yǎng)液Iml轉移進100 ml無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含六價鉻20mg/L，六價鉻以重鉻酸鉀配制，30°C培養(yǎng)24 h，搖床轉速為120 rpm ；
(3)取步驟(2)培養(yǎng)液Iml轉移至100 ml無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含六價鉻30mg/L，六價鉻以重鉻酸鉀配制，30 °C培養(yǎng)24 h，搖床轉速為120 rpm，以此類推其余條件不變以10 mg/L的增量，逐步增加六價鉻的含量，直至六價鉻濃度達到50 mg/L，培養(yǎng)24 h后得到馴化菌液；
(4)取馴化菌液Iml轉移至9 ml無菌生理鹽水中，稀釋10倍，菌液依次梯度稀釋至菌液濃度為10_7;
(5)從10_6、10_7g兩個稀釋組中分別取0.1 ml涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)24 h ；
(6)從上述步驟中分別挑取單菌落，平板劃線純化，得到一株芽孢桿菌Bacillus和一株地霉菌Geotrichum，斜面保存?zhèn)溆茫?br> (7)將芽孢桿菌Bacillus(簡稱BI )和地霉菌Geotrichum (簡稱Gl)單獨培養(yǎng)，得到單一菌液，再將菌液按體積比1:1接種于同一污染水體中混合培養(yǎng)，用于處理六價鉻污染，使混合菌能夠處理酸性和堿性廢水，擴大菌劑對進水酸堿度適應范圍，酸性進水時，芽孢桿菌優(yōu)先大量繁殖，代謝產物積累，溶液PH降低，為地霉菌生長創(chuàng)造條件，地霉菌開始大量繁殖，生物量的增加使六價鉻含量及有機物含量快速降低，水質得到凈化，而堿性進水時適宜地霉菌生長，地霉菌短時間內大量增殖還原、吸附六價鉻，消耗有機質，水質得到凈化。
[0008]所述牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基的成分為:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5g/L、水 I L0
[0009]所述牛肉膏蛋白胨固態(tài)培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基中加入15~25 g瓊脂。
[0010]所述無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基成分為0.5g/L K2HPO4,1 g/L KH2PO4, 0.5g/L MgSO4,
0.01g/L CaCl2, lg/L NH4C1,0.01 g/L FeSO4, 1.0g/L NaCl,0.003g/L MnSO4, 5g/L 葡萄糖。
[0011]所述依次梯度即每次取前一步驟的稀釋液加入到9 ml無菌生理鹽水中。
[0012]兩株菌適宜生長pH:
挑取兩株菌分別在100 ml無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后各取I ml菌液分別加入pH為
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的150ml無機鹽培養(yǎng)基中，搖床轉速為120 rpm, 30°C培養(yǎng)24 h后，取I ml芽孢桿菌菌液稀釋10倍，在600 nm測定吸光度值，計算菌液濃度，同時將地霉菌菌液濾膜過濾后，105°C烘干至恒重稱重，結果如圖1:可以看出地霉菌Gl能夠生長繁殖的pH范圍為2~7，最適生長pH為4，堿性(pH>7)環(huán)境中無法生長繁殖；芽孢桿菌B2的適宜生長pH范圍為5~10，最適生長pH為8。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的復合菌劑處理方法能在較寬pH范圍內100%去除廢水中的六價鉻污染，并能利用廢水中的有機質作為碳源，去除六價鉻的同時消耗有機質，凈化水質；并且兩株菌篩選自同一土壤環(huán)境中，經拮抗性實驗證明無拮抗作用，亦可應用于六價鉻污染土壤修復；本方法降低了菌劑對進水pH的要求，提高接種微生物對廢水的初始PH耐受范圍，提高了處理效率，降低了預處理成本，同時提高六價鉻污染廢水的治理效果，且復合菌劑簡單易得。
[0014]單一菌種和復合菌種處理效果對比:
單一菌種處理六價鉻污染:
挑取兩株菌分別在含有40mg/L六價鉻的100 ml無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各取I ml菌液分別加入pH為2、4、6、7、8、10的150 ml無機鹽培養(yǎng)基(六價鉻含量為40mg/L)中，搖床轉速為120 rpm，30°C培養(yǎng)，按一定時間間隔，分別取樣5 ml，在9280Xg離心力作用下離心15 min，取上清液，稀釋10倍后按標準法(HJ687-2014)測定并計算六價鉻殘留量，結果如圖2 (G1、B2):從圖中可以看出當pH大于、等于3或者小于、等于5時，地霉菌Gl能夠處理含六價鉻的廢水，并且在6天內100%去除六價鉻；而當pH小于3或者pH大于5時Gl菌對含六價鉻的廢水沒有凈化作用，微生物生長繁殖完全被抑制；而芽孢桿菌B2在pH6~10范圍內能處理一定量的六價鉻，但均不能100%處理，處理效率也較低；當pH低于6或者大于10時則生長繁殖完全被抑制，對六價鉻含量沒有影響。
[0015]復合菌種協(xié)同作用處理六價鉻污染:
挑取兩株菌分別在含40 mg/L六價鉻的100 ml無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，各取Iml菌液同時加入pH為2、4、6、7、8、10的150 ml無機鹽培養(yǎng)基(六價鉻含量為40mg/L)中，搖床轉速為120 rpm, 30°C培養(yǎng)，每隔一定的時間取樣5 ml，在9280X g離心力作用下離心15 min，取上清液，稀釋10倍后按標準法(HJ687-2014)測定并計算六價鉻殘留量，結果如圖3:由圖可知進水pH在2~10的范圍內均能處理六價鉻，而且除pH=2外，其余酸堿度均能完全去除廢水中的六價鉻，pH小于5時，主要是地霉菌Gl的生長繁殖使六價鉻被去除，而當大于5時初期由芽孢桿菌生長代謝去除部分六價鉻，同時代謝產物的積累使廢水pH降低，為Gl的生長繁殖創(chuàng)