單臂單價抗體構(gòu)建體及其用途
【專利摘要】本文提供單價抗體構(gòu)建體。在具體實(shí)施方案中是一種包含以下的單價抗體構(gòu)建體：單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包含CH3結(jié)構(gòu)域的二聚Fc多肽構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含兩個單體Fc多肽，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的多肽融合。這些治療新型分子涵蓋與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比展示與展示所述抗原的靶細(xì)胞的結(jié)合密度和Bmax(在靶標(biāo)與抗體比為1:1時的最大結(jié)合)增加的單價構(gòu)建體。本文提供制造在等摩爾濃度下與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯示優(yōu)越效應(yīng)功效的單價抗體構(gòu)建體的方法。本文提供制造出乎意料地抑制腫瘤細(xì)胞生長并可以被內(nèi)化，而且在等摩爾飽和濃度下與二價抗體構(gòu)建體相比顯示較大功效的單價抗體構(gòu)建體的方法。提供用于治療HER2表達(dá)疾病的單價抗體構(gòu)建體。
【專利說明】單臂單價抗體構(gòu)建體及其用途
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35U.S.C. § 1 19(e)要求2012年5月10日提交的美國臨時專利申 請?zhí)?1/645547、2012年11月2日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/722070、2012年7月13 日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/671640和2013年2月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?61/762812的權(quán)益，所述臨時專利申請各自以引用的方式整體并入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的領(lǐng)域是用于定制開發(fā)生物治療藥物的支架的合理設(shè)計。
[0004] 相關(guān)領(lǐng)域描述
[0005] 在治療性蛋白質(zhì)的領(lǐng)域中，具有多價靶標(biāo)結(jié)合特征的抗體是用于設(shè)計藥物候選物 的優(yōu)良支架。目前市場上的抗體治療藥物是經(jīng)過優(yōu)化和選擇由兩個抗體FAB賦予的高親和 力結(jié)合和親合力的二價單特異性抗體。已采用通過誘變進(jìn)行去巖藻糖基化或增強(qiáng)FcgR結(jié) 合來通過抗體Fc依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)制使抗體更有效。無巖藻糖基化的抗體或 FcgR結(jié)合增強(qiáng)的抗體在臨床檢驗(yàn)中仍遭受不完全的治療功效，而且任何這些抗體仍有待實(shí) 現(xiàn)市場上的藥物狀態(tài)。
[0006] 治療性抗體將理想地具備某些最低限度的特征，包括在施用于目標(biāo)患者后的靶標(biāo) 特異性、生物穩(wěn)定性、生物利用度和生物分布，以及足夠的靶標(biāo)結(jié)合親和力和高的靶標(biāo)占有 率以及對靶細(xì)胞的抗體裝飾從而使抗體依賴性治療作用最大化。對于產(chǎn)生具備所有這些最 低限度特征的抗體治療藥物，尤其是在1:1的抗體與靶標(biāo)的比率下可完全占有靶標(biāo)的抗體 所做的努力僅獲得了有限的成功。舉例而言，即使在飽和濃度下，全長二價單特異性IgG抗 體在1:1比率下仍無法完全占有靶標(biāo)。就理論角度而言，在飽和濃度下，預(yù)期傳統(tǒng)的單特異 性二價抗體在1個抗體：2個靶標(biāo)的比率下最大限度地結(jié)合靶標(biāo)，這是因?yàn)榕c單價抗體片段 相比存在兩個一致的可以賦予親合力作用的抗原結(jié)合FAB。另外，所述全長抗體由于分子尺 寸更大而具有更有限的生物利用度和/或生物分布。此外，全長抗體在一些情況下可抑制 在與靶抗原結(jié)合時的激動性作用，這在拮抗性作用是需要的治療功能的情況下是不利的。 在一些情況下，這種現(xiàn)象是因?yàn)槎r抗體在與細(xì)胞表面受體結(jié)合時促使導(dǎo)致受體活化的受 體二聚化作用的"交聯(lián)"作用。另外，傳統(tǒng)的二價抗體具有有限的治療功效，這是因?yàn)樵谠?許抗體依賴性細(xì)胞毒性作用或其它治療活性機(jī)制的最大治療安全劑量下，在1:2的抗體與 靶抗原比率下有限的抗體結(jié)合和靶細(xì)胞的裝飾。 發(fā)明概要
[0007] 本文提供一種分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含：單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽 構(gòu)建體；和二聚Fc多肽構(gòu)建體，所述Fc多肽構(gòu)建體包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc 多肽，其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的多肽融合；其中所 述單價抗體構(gòu)建體以以下參數(shù)選擇性地和/或特異性地結(jié)合展示所述抗原的靶細(xì)胞：與具 有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比增加的結(jié)合密度和B max;與所述單 特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)?shù)慕怆x常數(shù)（Kd);與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)或較慢 的解離速率；且其中所述單價抗體構(gòu)建體展示與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)?shù)纳?物理學(xué)和體內(nèi)穩(wěn)定性；和與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)或較大的細(xì)胞毒性。
[0008] 在某些實(shí)施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價抗體構(gòu) 建體阻斷同源配體與靶抗原的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中是本文提供的分離的單價抗體構(gòu) 建體，其中所述單價抗體構(gòu)建體不阻斷同源配體與靶抗原的結(jié)合。在一個實(shí)施方案中是分 離的單價抗體構(gòu)建體，其中在抗體與靶標(biāo)比率為1:1時，在大于觀察到的抗體的平衡常數(shù) (Kd)直到飽和濃度的濃度下觀察到結(jié)合密度和Bmax相對于單特異性二價抗體的增力口。在 一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中在大于觀察到的抗體的平衡常 數(shù)（Kd)直到飽和濃度的濃度下，所述單價抗體構(gòu)建體與所述相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展 示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C功效中的至少一種。
[0009] 在一些實(shí)施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是包 含參與效應(yīng)物活性的Fc結(jié)構(gòu)域的單價裂解性抗體構(gòu)建體，其中所述裂解性抗體構(gòu)建體是 非激動性的、阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合、抑制細(xì)胞生長；且其中所述裂解性抗體構(gòu)建體以 與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比增加的、快速的結(jié)合速率 和相當(dāng)?shù)慕怆x速率結(jié)合所述靶細(xì)胞并使其飽和。
[0010] 在一個實(shí)施方案中是分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體未經(jīng)內(nèi)化。在一些 實(shí)施方案中是分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體經(jīng)內(nèi)化。
[0011] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是經(jīng)有效內(nèi)化 的單價內(nèi)化抗體構(gòu)建體；其中所述內(nèi)化抗體是非激動性的、阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合且 不引發(fā)細(xì)胞生長；且其中所述內(nèi)化抗體構(gòu)建體以與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二 價抗體構(gòu)建體相比增加的B max、快速的結(jié)合速率和較慢的解離速率結(jié)合所述靶細(xì)胞。
[0012] 在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的內(nèi)化 大于、等于或小于相應(yīng)單特異性二價抗體的內(nèi)化。在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的 單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和Bmax的增加與靶細(xì)胞上的抗原的密度無關(guān)。在一個 實(shí)施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和Bmax的增加與 靶抗原表位無關(guān)。
[0013] 在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體不展現(xiàn) 親合力。
[0014] 在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述二聚Fc多肽 構(gòu)建體是異源二聚體的。在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所 述單價抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體是能結(jié)合抗原的Fab片段、scFv、sdAb、抗原結(jié)合肽或蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中是分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述Fab片段包含重鏈多肽和輕 鏈多肽。
[0015] 在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中靶細(xì)胞是表達(dá)同源 抗原的細(xì)胞，所述細(xì)胞選自包括以下的清單：癌細(xì)胞和表達(dá)J1ER2的病變細(xì)胞。在一些實(shí)施 方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體結(jié)合J1ER2且 其中靶細(xì)胞是以下中的至少一種：低、中或高J1ER2表達(dá)細(xì)胞、孕酮受體陰性細(xì)胞或雌激素 受體陰性細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗原結(jié) 合多肽構(gòu)建體結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域是ECR 1、2、3和4中的至少一 種。
[0016] 本文提供一種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含：單價地結(jié)合HER2的抗 原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體， 其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合；其中在等摩爾濃度下，所述抗 體構(gòu)建體與結(jié)合HER2的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示與FcyR的結(jié)合密度增加。
[0017] 本文提供一種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含：單價地結(jié)合HER2的抗 原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體， 其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合；其中所述抗體構(gòu)建體由靶細(xì) 胞內(nèi)化，其中所述構(gòu)建體與結(jié)合HER2的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出與祀細(xì)胞上展示 的HER2的結(jié)合密度和Bmax增加，且其中在等摩爾濃度下，所述構(gòu)建體與所述相應(yīng)二價HER2 結(jié)合抗體構(gòu)建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中的至少一種。
[0018] 在一個實(shí)施方案中是一種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含：單價地結(jié) 合HER2的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc 多肽構(gòu)建體，其中所述單體Fc多肽中的一個與抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合；其中所述抗體構(gòu) 建體結(jié)合FcRn，但與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比展示較高的 Vss〇
[0019] 在一些實(shí)施方案中是一種本文所述的分離的單價HER2結(jié)合抗體構(gòu)建體，其中所 述單價HER2結(jié)合多肽構(gòu)建體是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一種。
[0020] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中二聚Fc構(gòu)建體是包含變 體CH3結(jié)構(gòu)域的異源二聚Fc構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu) 建體，所述變體CH3結(jié)構(gòu)域包含促使形成與天然同源二聚Fc區(qū)具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性的所述異 源二聚體的氨基酸突變。在一個實(shí)施方案中是分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述變體CH3 結(jié)構(gòu)域具有約70°C或更高的熔解溫度（Tm)。在另一個實(shí)施方案中是分離的單價抗體，其中 變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約75°C或更高的熔解溫度（Tm)。還提供一種本文所述的分離的單價 抗體構(gòu)建體，其中變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約80°C或更高的熔解溫度（Tm)。在另一個實(shí)施方案 中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中二聚Fc構(gòu)建體還包含含有促使選擇性結(jié)合 Fc Y受體的氨基酸修飾的變體CH2結(jié)構(gòu)域。在一個相關(guān)實(shí)施方案中是本文所述的分離的單 價抗體構(gòu)建體，其中異源二聚體Fc構(gòu)建體相對于野生型Fc區(qū)而言在CH3結(jié)構(gòu)域中不包含 另外的二硫鍵。在一個實(shí)施方案中是本文提供的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中異源二聚體 Fc構(gòu)建體相對于野生型Fc區(qū)而言在變體CH3結(jié)構(gòu)域中包含另外的二硫鍵，且其中變體CH3 結(jié)構(gòu)域具有至少約77. 5°C的熔解溫度（Tm)。在一個實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價 抗體構(gòu)建體，其中二聚Fc構(gòu)建體是以大于約75%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。在一 些實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體，其中二聚Fc構(gòu)建體是以大于約80%的純度 形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。還提供分離的單價抗體構(gòu)建體，其中二聚Fc構(gòu)建體是以大于 約90%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗 體構(gòu)建體，其中二聚Fc構(gòu)建體是以大于約95%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。
[0021] 本文提供一種本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單體Fc多肽與抗原 結(jié)合多肽構(gòu)建體通過連接子融合。在某些實(shí)施方案中，連接子是多肽連接子。
[0022] 在一個實(shí)施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備 的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種大于具有兩個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建 體的約105%。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體具備的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是具有兩 個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的至少約125%。在另一個實(shí)施方案中，構(gòu)建 體具備的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的至少約150 %。在一個實(shí) 施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備的ADCC、ADCP和CDC 中的至少一種是具有兩個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的至少約300%。
[0023] 在一個實(shí)施方案中提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 B max的增加是相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約125%。在一個實(shí)施方案中 是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和的增加是相應(yīng)二價抗體構(gòu) 建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約150%。還提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中 所述結(jié)合密度和B max的增加是相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約200%。
[0024] 在一個實(shí)施方案中是一種包含編碼本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體的核酸的 宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中是一種宿主細(xì)胞，其中編碼抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的核酸和編 碼Fc構(gòu)建體的核酸存在于單一載體中。還提供一種制備本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建 體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)培養(yǎng)包含編碼抗體片段的核酸的宿主細(xì)胞；和（b) 從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物回收抗體片段。
[0025] 在一個實(shí)施方案中是一種在穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生糖基化單價抗體構(gòu)建體 或糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其包括：用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染至少 一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞：編碼包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和第一 Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一重鏈多 肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所 述第二重鏈多肽無可變結(jié)構(gòu)域；和編碼包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA序列， 以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞中以 預(yù)定比率轉(zhuǎn)染；在至少一種哺乳動物細(xì)胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所 述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá) 成需要的糖基化單價不對稱抗體。
[0026] 在一個實(shí)施方案中提供產(chǎn)生本文所述的糖基化單價抗體構(gòu)建體或糖基化工程改 造的無巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其包括用不同預(yù)定比率的所述第一 DNA序列、 所述第二DNA序列和所述第三DNA序列轉(zhuǎn)染至少兩種不同細(xì)胞以便至少兩種細(xì)胞各自以 不同的比率表達(dá)重鏈多肽和輕鏈多肽。在一個實(shí)施方案中是產(chǎn)生糖基化單價抗體構(gòu)建體或 糖基化工程改造的無巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其包括用包含所述第一、第二和 第三DNA序列中至少兩種的多順反子載體轉(zhuǎn)染至少一種哺乳動物細(xì)胞。在一個實(shí)施方案 中，所述至少一種哺乳動物細(xì)胞選自呢1?0、他1^、冊1(、呢0、中國倉鼠卵巢（010)、1138、8冊、 COS-7、Caco-2和MDCK細(xì)胞及其子類和變體。
[0027] 在一個實(shí)施方案中提供產(chǎn)生糖基化單價抗體構(gòu)建體或糖基化工程改造的無巖藻 糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序列的 預(yù)定比率是約1:1:1。
[0028] 在另一個實(shí)施方案中是產(chǎn)生本文所述的糖基化單價抗體構(gòu)建體或糖基化工程無 巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序列：第三DNA序 列的預(yù)定比率使得所翻譯的第一重鏈多肽的量約等于第二重鏈多肽的量和輕鏈多肽的量。 在一個實(shí)施方案中是本文所述的方法，其中至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與單 體重鏈或輕鏈多肽或其它抗體相比包含更大百分比的需要的糖基化單價抗體。
[0029] 在一個實(shí)施方案中提供產(chǎn)生本文所述的糖基化單價抗體構(gòu)建體或糖基化工程改 造的無巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其包括鑒定和純化需要的糖基化單價抗體。在 某些實(shí)施方案中，所述鑒定是通過液相色譜法和質(zhì)譜分析法中的一者或兩者來進(jìn)行。
[0030] 本文提供一種產(chǎn)生具有改善的ADCC的抗體構(gòu)建體的方法，其包括：用以下物質(zhì)轉(zhuǎn) 染至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞：編碼包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和第一 Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一 重鏈多肽的第一 DNA序列；編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列， 其中所述第二重鏈多肽無可變結(jié)構(gòu)域；和編碼包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA 序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞 中以預(yù)定比率轉(zhuǎn)染；在至少一種哺乳動物細(xì)胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列 和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被 表達(dá)成糖基化單價抗體，其中所述糖基化單價不對稱抗體與相應(yīng)野生型抗體相比具有較高 的 ADCC。
[0031] 本文提供的一種產(chǎn)生具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種的HER2結(jié)合抗 體構(gòu)建體的方法，其包括：用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞：編碼包含重鏈 可變結(jié)構(gòu)域和第一Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一重鏈多肽的第一DNA序列；編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu) 域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽無可變結(jié)構(gòu)域；和編碼包 含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序 列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞中以預(yù)定比率轉(zhuǎn)染；在所述至少一種哺乳動物 細(xì)胞中翻譯所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重鏈和輕 鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)成不對稱的糖基化單價J1ER2結(jié)合抗 體，其中所述糖基化單價J1ER2結(jié)合抗體與相應(yīng)野生型HER2結(jié)合抗體相比具有改善的ADCC、 ADCP和⑶C中的至少一種。
[0032] 提供一種增加至少一種靶細(xì)胞上的抗體濃度的方法，其向靶細(xì)胞提供包含以下的 單價抗體構(gòu)建體：單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；二聚Fc區(qū)；其中所述單價抗體 構(gòu)建體與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出與展示所述抗原的靶細(xì) 胞的結(jié)合密度和Bmax的增加，且其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯 示改善的功效，且其中所述改善的功效并非通過抗原的交聯(lián)、抗原二聚化、防止抗原調(diào)節(jié)、 抗原內(nèi)化或抗原下調(diào)、或抗原活化而引發(fā)。
[0033] 本文提供一種包含本文所述的單價抗體構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組 合物。在某些實(shí)施方案中是一種還包含與單價抗體構(gòu)建體偶聯(lián)的藥物分子的本文所述的藥 物組合物。
[0034]本文提供一種治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的 藥物組合物。提供一種治療HER信號傳導(dǎo)紊亂的方法，其向有需要的患者提供有效量的本 文所述的藥物組合物。本文提供一種抑制腫瘤生長的方法，其包括使腫瘤與包含有效量的 本文所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。提供一種使腫瘤萎縮的方法，其包括使腫瘤與 包含有效量的本文所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
[0035] 提供一種治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的單 價抗體構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中是一種在對用曲妥珠單抗（Trastuzumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、TDM1和抗HER二價抗體中的一種或多種的治療具有部分反應(yīng)的患者中治療 乳癌的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的單價抗體構(gòu)建體。在 一個實(shí)施方案中是一種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDM1 (ADC)和抗HER二價抗體中的 一種或多種的治療無反應(yīng)的患者中治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的 本文所述的單價抗體構(gòu)建體。提供一種本文所述的治療乳癌的方法，其中所述方法包含除 了另一種治療劑以外還提供所述抗體構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中是一種本文所述的治療乳 癌的方法，其中所述抗體構(gòu)建體與所述治療劑同時提供。還提供一種本文提供的治療乳癌 的方法，其中所述抗體構(gòu)建體與所述治療劑偶聯(lián)。
[0036] 提供本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中單價抗體構(gòu)建體與一個或多個藥物 分子偶聯(lián)。
[0037] 提供一種抑制抗原分子多聚化的方法，其包括使抗原與包含有效量的本文所述的 單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。還提供一種抑制抗原與其同源結(jié)合配偶體的結(jié)合的方法， 其包括使抗原與包含足以與抗原結(jié)合的量的本文所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。 [0038] 還提供經(jīng)過修飾以含有本文所述的核酸分子以編碼和表達(dá)本文所述的單價抗體 構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因生物體。
[0039] 在結(jié)合附圖審閱本發(fā)明具體實(shí)施方案的以下描述后，本發(fā)明的其它方面和特征對 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將顯而易見。
[0040] 附圖簡述
[0041] 在說明本發(fā)明的實(shí)施方案的圖中，
[0042] 圖1描繪對抗體Fc依賴性細(xì)胞毒性即補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)、抗體依賴性細(xì) 胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP)的說明。
[0043] 圖2A至2B描繪與抗原結(jié)合的單價和二價抗體。圖2A描繪本文所述的以1:1的 化學(xué)計量結(jié)合抗原的單價抗體構(gòu)建體。圖2B描繪以1:2的化學(xué)計量結(jié)合抗原的二價抗體 構(gòu)建體。如本文所述，單價抗體構(gòu)建體在每個細(xì)胞的基礎(chǔ)上導(dǎo)致較高的抗體濃度/裝飾并 導(dǎo)致更多由ADCC、CDC、ADCP引起的Fc介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。
[0044] 圖3描繪示例性的單價抗HER2抗體與SK0V3細(xì)胞結(jié)合的能力：A.非線性擬合結(jié) 合曲線；B.對數(shù)變換曲線。
[0045] 圖4描繪示例性的單價抗HER2抗體在不同的密度下與表達(dá)HER2的細(xì)胞結(jié)合的能 力：A. MDA-MB-231 細(xì)胞；B. SK0V3 細(xì)胞；C. SKBR3 細(xì)胞。
[0046] 圖5描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導(dǎo)增強(qiáng)的 ADCC的能力。
[0047] 圖6描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導(dǎo)增強(qiáng)的⑶C 的能力。
[0048] 圖7描繪示例性的單價抗HER2抗體與二價全尺寸抗體（FSA)相比介導(dǎo)增強(qiáng)的⑶C 的能力：A.和B.各自代表其中使用兩種PBMC供體的實(shí)驗(yàn)。C.具有0A2-Fab-HER2和4PBMC 供體的兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的綜述，根據(jù)供體表示CD16+細(xì)胞的百分比。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化成WT FSA Hcptn的最大溶胞作用，并呈現(xiàn)出0A2-Fab-HER2相對于WT FSA Hcptn的最大溶胞作用的倍 數(shù)差異。
[0049] 圖8描繪對示例性的單價抗HER2抗體在蛋白A純化后的產(chǎn)量和純度的分析。 A.對純化單價抗HER2抗體的SDS-PAGE分析；B.對0A1-Fab-HER2的LCMS分析；C.對 0八24 &13-冊1?2的^1^分析；0.在約0.8%兩條輕鏈+1條短重鏈（72,8980&)、單獨(dú)的約 0.7%短重鏈（25,9070 &)下顯示較低質(zhì)量肽的(^24&13-冊1?2的^1^光譜的展開圖。
[0050] 圖9描繪單價抗HER2抗體被內(nèi)化的能力。A.結(jié)果以內(nèi)化％的形式繪圖；b.結(jié)果 以相對于對照的作用％的形式繪圖。
[0051] 圖10描繪單價抗HER2抗體抑制SKBR3細(xì)胞生長的能力。
[0052] 圖11描繪單價抗HER2抗體與FcRn受體結(jié)合的能力。
[0053] 圖12描繪另一種示例性的單價抗HER2抗體與SK0V3細(xì)胞結(jié)合的能力。
[0054] 圖13描繪FSA-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0055] 圖14描繪0A3-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0056] 圖15描繪0A1-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈 和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0057] 圖16描繪0A2-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈 和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0058] 圖17描繪wt FSA Hcptn的DNA和氨基酸序列。A?和C?重鏈A的DNA序列；B?和 D.輕鏈的氨基酸序列。
[0059] 圖18描繪FSA-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.、C.和E.分別是重鏈A、輕鏈 和重鏈B的DNA序列；B.、D.和F.分別是重鏈A、輕鏈和重鏈B的氨基酸序列。
[0060] 圖19描繪FSA-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.鏈A和鏈B的DNA序列；B.鏈 A和鏈B的氨基酸序列。
[0061] 圖20描繪0A4-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.和C.分別是鏈A和鏈B的 DNA序列；B.和D.分別是鏈A和鏈B的氨基酸序列。
[0062] 圖21A至21E描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體在不同細(xì)胞系中介導(dǎo)ADCC的能力。圖 21A、C、D和E描繪MCF7細(xì)胞中的結(jié)果，而圖21B描繪MDA-MB-231細(xì)胞中的結(jié)果。
[0063] 圖22描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體在小鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)概況。
[0064] 圖23A至23B描繪用示例性的單價抗Her2抗體（0A1-Fab-Her2)處理SKBr3細(xì)胞 對信號傳導(dǎo)分子的磷酸化作用的影響。圖A顯示對ErbB2的磷酸化作用的影響，而圖B顯 示對MAPK和AKT的磷酸化作用的影響。
[0065] 圖24A至25B顯示對在15分鐘（圖A)和30分鐘（圖B)時由ELISA測量的Akt 的磷酸化作用程度的定量評估。
[0066]圖25A至25B描繪根據(jù)本發(fā)明的示例性單價抗體構(gòu)建體結(jié)合JMT-1細(xì)胞（圖A)、 BT474細(xì)胞（圖B)和MCF-7細(xì)胞（圖C)的能力。
[0067] 圖26A至26B描繪示例性的單價抗Her2抗體抑制BT-474細(xì)胞（圖A， 0Al-Fab-Her20A2-Fab-HER2 ;圖 B，0A5-Fab-HER2, 0A6-Fab-Her2)生長的能力。
[0068] 圖27A至27B描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體0A1-Fab-Her2和0A5-Fab-Her2 (在 200nM下）在BT-474細(xì)胞（圖A)或JIMT-1細(xì)胞（圖B)中內(nèi)化的能力。
[0069]圖28描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體結(jié)合MALME-3M細(xì)胞的能力。
[0070]圖29描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體-抗體藥物偶聯(lián)物（ADC)殺傷BT474細(xì)胞的 能力。
[0071]圖30A至30B描繪構(gòu)建體的純度。圖30A描繪示例性的單價抗體構(gòu)建體 0A5-Fab-Her2和0A6-Fab-Her2在蛋白A純化后的純度。圖30B顯示通過LC/MS的異源二 聚體純度分析，其表明〇A5-Fab-Her2和0A6-Fab-Her2在蛋白A和尺寸排阻色譜法后都可 以被純化成大于99%的純度。
[0072] 圖31A至31F描繪0A5-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；圖31A和圖31B分別是 鏈A的DNA和氨基酸序列；圖31C和圖31D分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖31E和圖 31F分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0073] 圖32A至32F描繪0A6-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；圖32A和圖32B:分別是 鏈A的DNA和氨基酸序列；圖32C和圖32D:分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖32E和 圖32F:分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0074] 圖33A至33F描繪FSA-Fab-pert的DNA和氨基酸序列；圖33A和圖33B分別是 鏈A的DNA和氨基酸序列；圖33C和圖33D分別是鏈B的DNA和氨基酸序列；且圖33E和圖 33F分別是輕鏈的DNA和氨基酸序列。
[0075] 詳述
[0076] 本文提供單價抗體構(gòu)建體，其包含單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包 含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，其中一個所述單體Fc多 肽與至少一個來自抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的多肽融合；其中所述單價抗體構(gòu)建體與具有兩個 抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比展示出與展示所述抗原的靶細(xì)胞的結(jié)合 密度和B max的增加，且其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯示優(yōu)越的功 效和/或生物活性，且其中所述優(yōu)越的功效和/或生物活性是結(jié)合密度增加的結(jié)果且導(dǎo)致 靶細(xì)胞的裝飾增加。由本文提供的單價抗體構(gòu)建體導(dǎo)致8_或結(jié)合密度增加并導(dǎo)致靶標(biāo)裝 飾增加是特異性靶標(biāo)結(jié)合的作用而并非由于非特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，在1:1的 靶標(biāo)與抗體比率下發(fā)生最大結(jié)合。
[0077] 在某些實(shí)施方案中，本文提供的單價抗體構(gòu)建體具備以下屬性中的至少一種或多 種：與相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體（FSA)相比增加的B max;與相應(yīng)FSA相當(dāng)?shù)腒d;與相應(yīng) FSA相比相同或較慢的解離速率；激動性減少或部分激動性；祀標(biāo)無交聯(lián)和二聚；對所關(guān)注 靶細(xì)胞的特異性和/或選擇性；對靶細(xì)胞生長完全或部分抑制或無抑制；能引發(fā)效應(yīng)物活 性的完整Fc ;和被靶細(xì)胞內(nèi)化的能力。
[0078] 在某些實(shí)施方案中，本文提供的單價抗體構(gòu)建體具備以下最低限度的屬性：與相 應(yīng)FSA相比增加的B max;與相應(yīng)FSA相當(dāng)?shù)腒 d;與相應(yīng)FSA相比相同或較慢的解離速率；激 動性減少或部分激動性；靶標(biāo)無交聯(lián)和二聚；對所關(guān)注靶細(xì)胞的特異性和/或選擇性；對靶 細(xì)胞生長完全或部分抑制或無抑制；能引發(fā)效應(yīng)物活性的完整Fc ;和任選地被靶細(xì)胞內(nèi)化 的能力。
[0079] 本文提供一種單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是以下中的至少一種：單價裂解 性抗體、單價內(nèi)化抗體及其組合。在一些實(shí)施方案中，抗體構(gòu)建體視這些抗體在以下功效因 素之間展示的平衡而定是單價裂解性抗體和/或單價內(nèi)化抗體：a)單價抗體構(gòu)建體被內(nèi)化 的能力、b)單價抗體構(gòu)建體增加的8_和Kd/結(jié)合-解離速率、和c)單價抗體構(gòu)建體的激 動性/部分激動性的程度。
[0080] 本文提供一種增加至少一種靶細(xì)胞中的抗體濃度的方法，其包括向靶細(xì)胞提供包 含以下的單價抗體構(gòu)建體：單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；二聚Fc區(qū)；其中所述 單價抗體構(gòu)建體與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出與展示所述抗 原的靶細(xì)胞的結(jié)合密度和Bmax(最大結(jié)合）的增加，且其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二 價抗體構(gòu)建體相比顯示更佳的治療功效，且其中所述功效并非由抗原交聯(lián)、抗原二聚、防止 抗原調(diào)節(jié)或防止抗原活化引發(fā)。相反，另一個事實(shí)是功效可以由抗原調(diào)節(jié)或抗原活化引發(fā)， 只要這些不超過凈殺傷作用即可。
[0081] 在一些實(shí)施方案中是本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗體構(gòu)建體不 顯示親合力。
[0082] 單價裂解性（Mv-L)抗體
[0083] 提供本文所述的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體與FSA相比具備增加的8_和 相當(dāng)或較慢的解離速率（因此導(dǎo)致MV-L對靶細(xì)胞的裝飾較高和抗體依賴性的細(xì)胞毒性）。 在一些實(shí)施方案中，本文所述的MV-L抗體構(gòu)建體以與FSA相比增加的B max和快速的結(jié)合速 率與緩慢的解離速率結(jié)合靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所述的MV-L抗體構(gòu)建體阻斷同 源配體與靶抗原結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本文所述的MV-L抗體構(gòu)建體不顯示內(nèi)化，由此 導(dǎo)致抗體在細(xì)胞上的最大裝飾和對路徑的功能性阻塞。
[0084] 在某些實(shí)施方案中，MV-L抗體構(gòu)建體1)以與FSA相比增加的B max和快速的結(jié)合速 率與類似或較慢的解離速率結(jié)合靶細(xì)胞并使其飽和；2)是非激動性的；3)抑制細(xì)胞生長； 4)阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合；5)不顯示內(nèi)化和6)包含參與效應(yīng)物活性的Fc結(jié)構(gòu)域。在 某些實(shí)施方案中，MV-L抗體構(gòu)建體最大限度地裝飾靶細(xì)胞表面，且阻斷靶抗原對靶細(xì)胞的 活化，而不抵消可導(dǎo)致細(xì)胞存活和生長的活性。
[0085] 在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單價裂解性抗體構(gòu)建體1)以與單特異性二價 抗體構(gòu)建體相比增加的8_結(jié)合靶細(xì)胞且具有快速的結(jié)合速率和類似或緩慢的解離速率， 2)是非激動性的；3)抑制細(xì)胞生長，4)阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合，5)顯示最小限度的內(nèi) 化和6)包含與Fc受體相互作用的Fc結(jié)構(gòu)域和參與免疫系統(tǒng)的補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0086] 在某些實(shí)施方案中，MV-L抗體構(gòu)建體能結(jié)合FcyR受體和補(bǔ)體蛋白，且在高的細(xì) 胞表面濃度下對于引發(fā)抗體依賴性的細(xì)胞毒性更有效。在某些實(shí)施方案中是一種MV-L抗 體構(gòu)建體，其適用于通過諸如ADCC、ADCP或⑶C的Fc效應(yīng)功能來殺傷靶細(xì)胞。
[0087] 在一個實(shí)施方案中，MV-L抗體構(gòu)建體由于相對于由FSA實(shí)現(xiàn)的參與的空間差異 而能夠優(yōu)先地參與效應(yīng)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，MV-L基本上阻斷配體與靶抗原結(jié)合，同 時不顯示激動性，然而與FSA相比增加的Bmax和快速的結(jié)合速率加上類似或緩慢的解離 速率可以克服配體的部分阻塞、一定程度的激動性和細(xì)胞生長以及內(nèi)化，從而導(dǎo)致仍優(yōu)于 FSA的凈有效作用。在一些實(shí)施方案中，本文提供的MV-L抗體構(gòu)建體結(jié)合HER2。在一些實(shí) 施方案中，抗體構(gòu)建體結(jié)合至少一種J1ER2胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域是 E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。在某些實(shí)施方案中，HER2結(jié)合MV-L是本文提供 的 0A5-Fab-Her2(4182)或 0A1-Fab-Her2(1040)。
[0088] 在某些實(shí)施方案中，單價裂解性抗體構(gòu)建體（MV-L)對病變細(xì)胞的裝飾增加導(dǎo)致 通過ADCC、⑶C或ADCP去除靶細(xì)胞比單特異性二價抗體構(gòu)建體（FSA)更有效。
[0089] 單價內(nèi)化（MV-Int)抗體
[0090] 本文提供單價抗體構(gòu)建體，其包含單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和包 含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，且其中所述單價抗體構(gòu) 建體是單價內(nèi)化（MV-Int)抗體構(gòu)建體。在某些實(shí)施方案中，增加的B max和內(nèi)化程度是對 MV-Int種類中的單價抗體構(gòu)建體進(jìn)行分類的關(guān)鍵驅(qū)動因素。在某些實(shí)施方案中，MV-Int 抗體構(gòu)建體以與FSA相比增加的B max和快速的結(jié)合速率加上類似或緩慢的解離速率來結(jié) 合靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，Mv-Int致使以下中的至少一種：對靶細(xì)胞的較高裝飾、阻 斷同源配體與靶抗原結(jié)合和有效內(nèi)化，以及抑制或不引發(fā)任何細(xì)胞生長。在一些實(shí)施方案 中，本文提供的MV-L抗體結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中，HER2結(jié)合MV-Int是本文提供的 0A5-Fab-Her2(4182)或 0A1-Fab-Her2(1040)。
[0091] 在某些實(shí)施方案中，本文提供與MV-L和FSA相比具有高Bmax和高內(nèi)化的MV-Int 構(gòu)建體，由此導(dǎo)致MV-Int的胞內(nèi)濃度較高。在一些實(shí)施方案中，本文提供的MV-L抗體結(jié)合 HER2。在一些實(shí)施方案中，抗體構(gòu)建體結(jié)合至少一種HER2胞外結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案 中，胞外結(jié)構(gòu)域是E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。在一些實(shí)施方案中，MV-L抗體 抑制HER2胞外結(jié)構(gòu)域的二聚化。在一些實(shí)施方案中，抗體構(gòu)建體結(jié)合至少一種HER2胞外 結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域是E⑶1、E⑶2、E⑶3和E⑶4中的至少一種。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，MV-Int抗體可以部分地活化受體，使用它作為特洛伊 (Trojan)來運(yùn)送本文所述的抗體構(gòu)建體，任選地與有效負(fù)荷一起到細(xì)胞中。所述MV-Int 抗體適用于制備抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC)，而且可用于治療需要向靶細(xì)胞遞送毒性藥物的 適應(yīng)癥。在這種形態(tài)下，導(dǎo)致急性細(xì)胞死亡的高毒性的有效負(fù)荷的遞送將克服在MV-Int 中所賦予的一些激動性活性。在一些實(shí)施方案中，本文提供的MV-Int抗體結(jié)合HER2。 在某些實(shí)施方案中是HER2結(jié)合單價抗體構(gòu)建體，它們是MV-L和MV-Int。舉例而言， 0A1-Fab-Her2 (1040) - vl040 對于 MV-L 和 MV-Int 展示充分的特性。
[0093] 在一個實(shí)施方案中，由MV-Int實(shí)現(xiàn)的相對于FSA的較高裝飾和Bmax可補(bǔ)償內(nèi)化 水平的差異。
[0094] 在一個實(shí)施方案中，Mv-Int抗體構(gòu)建體1)以與FSA相比增加的和快速的結(jié)合 速率加上相當(dāng)或緩慢的解離速率來結(jié)合靶細(xì)胞（因此導(dǎo)致MV-Int對靶細(xì)胞的裝飾較高）， 2)阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合；3)是非激動性的；4)不引發(fā)細(xì)胞生長，和5)比單特異性二 價抗體構(gòu)建體在更大程度上有效內(nèi)化。在另一個實(shí)施方案中，單價內(nèi)化抗體構(gòu)建體1)以 與FSA相比增加的B max和快速的結(jié)合速率加上緩慢的解離速率來結(jié)合靶細(xì)胞（因此導(dǎo)致 MV-Int對靶細(xì)胞的裝飾較高），2)阻斷同源配體與靶抗原結(jié)合；3)只是部分激動性的；4) 不引發(fā)細(xì)胞生長，和5)比單特異性二價抗體構(gòu)建體在更大程度上有效內(nèi)化。
[0095] 在一些實(shí)施方案中，通過免疫T和B細(xì)胞以及病變細(xì)胞和耐藥病變細(xì)胞增加單價 內(nèi)化抗體構(gòu)建體（MV-Int)的裝飾和內(nèi)化導(dǎo)致通過ADC比FSA更有效地去除靶細(xì)胞。在一 個實(shí)施方案中，與藥物分子偶聯(lián)的單價內(nèi)化抗體構(gòu)建體（MV-Int)適用于治療藥物治療無 效和耐藥的患者以及無法對一線治療作出反應(yīng)的患者。在一些實(shí)施方案中，本文提供的 MV-Int抗體結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中是HER2結(jié)合單價抗體構(gòu)建體，它們是MV-L和 MV-Int。例如0A1-Fab-Her2(1040)
[0096]在一個實(shí)施方案中，本文所述的單價裂解性抗體構(gòu)建體（MV-L)使諸如病毒的病 原體的裝飾增加導(dǎo)致病原體去除比單特異性二價抗體構(gòu)建體（FSA)更有效。舉例而言，諸 如HIV的病毒已演變成通過具有低密度的包膜刺突來回避二價抗體和二價結(jié)合，這是在與 針對其一致地產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體反應(yīng)的病毒相比時的區(qū)分性特征。結(jié)果是親合力最小 化，通常被抗體用來實(shí)現(xiàn)高親和力結(jié)合和有效中和，由此使病毒可回避抗體。本文所述的單 價抗體構(gòu)建體不受影響，顯著地是因?yàn)榻Y(jié)合是針對單一的表位。在某些實(shí)施方案中，本文所 述的單價抗體構(gòu)建體可單獨(dú)或以組合形式用來涵蓋所有獨(dú)特的病毒表位。
[0097]在某些實(shí)施方案中，本文所述的MV_L抗體構(gòu)建體通過病原體的調(diào)理作用而用于 直接靶向和抗體介導(dǎo)的清除。在某些實(shí)施方案中，MV-L和MV-Int抗體兩者都適合受病原 體感染的細(xì)胞的抗體依賴性清除。在一些實(shí)施方案中，MV-L和MV-Int抗體構(gòu)建體高度裝 飾受HIV感染的T細(xì)胞并標(biāo)記用于通過ADCC、⑶C、ADCP或ADC殺傷而去除的這些細(xì)胞。在 某些實(shí)施方案中，本文所述的單價抗體構(gòu)建體可單獨(dú)或以與其它單價抗體構(gòu)建體的組合形 式使用。
[0098]本文提供一種分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu) 建體；和包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，其中一個所述 單體Fc多肽與至少一個來自抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的多肽融合；其中所述單價抗體構(gòu)建體 與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)FSA構(gòu)建體相比展示出與展示所述抗原的靶細(xì)胞的結(jié)合密 度和Bmax (最大結(jié)合）的增加，其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯示 優(yōu)越的功效和/或生物活性，且其中所述優(yōu)越的功效和/或生物活性是結(jié)合密度增加的結(jié) 果。
[0099]在某些實(shí)施方案中提供一種本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中在大于觀察 到的平衡常數(shù)（Kd)的濃度下和在抗體的飽和濃度下，觀察到相對于單特異性二價抗體而 言結(jié)合密度和Bmax增加。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)越的功效和/或生物活性是與所述相應(yīng)二 價抗體構(gòu)建體相比FcyR或補(bǔ)體（Clq)結(jié)合增加和較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中至少 一種的結(jié)果。在具體實(shí)施方案中，分離的單價抗體構(gòu)建體是抗增殖的并經(jīng)過內(nèi)化。在某些 實(shí)施方案中是一種本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述相對于FSA而言的結(jié)合密 度和Bmax的增加與靶細(xì)胞上的抗原密度無關(guān)。在一些實(shí)施方案中提供一種本文所述的分 離的單價抗體構(gòu)建體，其中靶細(xì)胞是癌細(xì)胞或表達(dá)J1ER2的病變細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中， 本文所述的分離的單價抗體構(gòu)建體不顯示親合力。
[0100] 定義
[0101] 應(yīng)了解，本發(fā)明不限于特定的實(shí)驗(yàn)方案；本文所述的細(xì)胞系、構(gòu)建體和試劑同樣可 以改變。還應(yīng)了解，本文所用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實(shí)施方案的目的，且不打算限制本 發(fā)明的范疇，本發(fā)明的范疇僅受附加的權(quán)利要求書限制。
[0102] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管在實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明中可以使用與本文所述類似或等 效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。
[0103]本文提到的所有公布和專利以引用的方式并入本文中，目的在于描述和公開例如 在公布中描述的可能結(jié)合目前描述的發(fā)明使用的構(gòu)建體和方法。本文論述的公布僅提供在 本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_內(nèi)容。本文中的內(nèi)容都不應(yīng)解釋為承認(rèn)發(fā)明人無權(quán)根據(jù)先前的發(fā) 明或出于任何其它原因提前所述公開內(nèi)容的日期。
[0104]"二聚體"或"異源二聚體"是包含至少第一單體多肽和第二單體多肽的分子。在異 源二聚體的情形下，所述單體之一的至少一個氨基酸殘基與另一單體不同。在某些實(shí)施方 案中，表面區(qū)域掩埋驅(qū)使二聚體聚集。在一些實(shí)施方案中，單體多肽借助于通過有利于需要 的二聚體形成和/或不利于其它不需要的樣品形成來驅(qū)使二聚體形成的靜電相互作用和/ 或鹽橋相互作用來彼此相互作用。在一些實(shí)施方案中，單體多肽借助于通過有利于需要的 二聚體形成和/或不利于其它聚集類型形成來驅(qū)使需要的二聚體形成的疏水相互作用來 彼此相互作用。在某些實(shí)施方案中，單體多肽借助于共價鍵形成來彼此相互作用。在某些 實(shí)施方案中，在天然存在的半胱氨酸或驅(qū)使需要的二聚體形成的引進(jìn)半胱氨酸之間形成共 價鍵。在本文所述的某些實(shí)施方案中，單體之間不形成共價鍵。在一些實(shí)施方案中，多肽借 助于通過有利于需要的二聚體形成和/或不利于其它不需要的實(shí)施方案形成來驅(qū)使二聚 體形成的裝填（packing)/尺寸互補(bǔ)（size-complementarity)/球入洞（knob-into-hole)/ 隆凸 -腔（protruberance-cavity)型相互作用來彼此相互作用。在一些實(shí)施方案中，多肽 借助于驅(qū)使二聚體形成的陽離子相互作用來彼此相互作用。在某些實(shí)施方案中，個別 的單體多肽在溶液中無法以分離的單體形式存在。
[0105] 如本文所用的術(shù)語"Fc區(qū)"一般是指包含免疫球蛋白重鏈的C端多肽序列的二聚 體復(fù)合物，其中C端多肽序列是可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的。Fc區(qū)可包含天 然或變體Fc序列。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc序列的邊界可變化，但人IgG重鏈Fc序列通 常定義為從大致Cys226位置或大致Pr 〇230位置的氨基酸殘基延伸到Fc序列的羧基端。免 疫球蛋白的Fc序列一般包含兩個恒定結(jié)構(gòu)域、一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域，且任選 地包含一個CH4結(jié)構(gòu)域。本文中"Fc多肽"意思是構(gòu)成Fc區(qū)的多肽之一。Fc多肽可以從 任何合適的免疫球蛋白獲得，諸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。在 一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列（一般在其N端）。在一些實(shí)施 方案中，F(xiàn)c多肽不包含功能型或野生型鉸鏈序列。
[0106]"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"是指其中表達(dá)Fc受體（FcR)的非特 異性細(xì)胞毒性細(xì)胞（例如，自然殺傷（NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）識別靶細(xì)胞上 的結(jié)合抗體并接著致使靶細(xì)胞溶解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。
[0107]"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"和"CDC"是指在補(bǔ)體存在下溶解靶標(biāo)。補(bǔ)體活化路徑通過 補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分（Clq)和與同源抗原復(fù)合的分子（例如，抗體）結(jié)合來引發(fā)。
[0108]"抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用"和"ADCP"是指通過單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬 作用破壞靶細(xì)胞。
[0109] 術(shù)語"Fc受體"和"FcR"用來描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。舉例而言，F(xiàn)cR可 以是天然序列人FcR。FcR-般是結(jié)合IgG抗體的受體受體）且包括FcyRI、FCyRII 和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者拼接形式。FcyRII受體包括 FcyRIIA( "活化受體"）和FcyRIIB( "抑制受體")，它們具有主要在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不 同的類似氨基酸序列。某些FcR也可以結(jié)合其它同種型的免疫球蛋白（參見例如，Janeway 等人，Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd.，NY)(第4版，1999))?；罨荏wFcyRIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體 酪氨酸的活化基序（ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體 酪氨酸的抑制基序（ITM)(在Dagron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)中綜述）。 FcR 在 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457_92 (1"1) ;Capel 等人，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas 等人，J.Lab.Clin.Med. 126:330-41(1995)中綜述。本文中 的術(shù)語"FcR"涵蓋其它FcR，包括將來識別的那些FcR。此術(shù)語還包括新生兒受體FcRn， 它負(fù)責(zé)向胚胎輸送母系IgG(Guyer等人，J. Immunol. 117:587 (1976);和Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994)) 〇
[0110] "病癥"是可由本發(fā)明的抗體或方法治療獲益的任何病況。此病癥包括慢性和急性 病癥或疾病，包括使哺乳動物具有論及病癥傾向的那些病理狀況。在本文中將要治療的病 癥的非限制性實(shí)例包括惡性和良性腫瘤；非白血病和惡性淋巴腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星 形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)和囊胚病癥；和炎癥性、免疫性 和其它血管生成相關(guān)的病癥。
[0111] 術(shù)語"癌癥"和"癌性"是指或描述通常特征在于細(xì)胞生長/增殖失調(diào)的哺乳動物 中的生理狀況。癌癥的實(shí)例包括（但不限于）癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。所述 癌癥的更具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹 膜癌、骨髓瘤（例如，多發(fā)性骨髓瘤）、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤/神經(jīng)膠質(zhì) 瘤（例如，間變型星形細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變型少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、間變型少突 星形細(xì)胞瘤）、宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié) 腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌 (hepatic carcinoma)和各種類型的頭頸癌。
[0112] 如本文所用的術(shù)語"炎癥性疾病"或"炎癥性病癥"涵蓋特征為結(jié)締組織發(fā)炎或這 些組織退化的病況。在某些實(shí)施方案中，炎癥性疾病或病癥包括（但不限于）阿爾茨海默癥 (Alzheimer's)、強(qiáng)直性脊柱炎、關(guān)節(jié)炎（包括（但不限于）骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA) 和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎）、哮喘、動脈粥樣硬化、克羅恩氏?。–rohn's disease)、結(jié)腸炎、皮炎、 憩室炎、纖維肌痛、肝炎、腸易激綜合癥（IBS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、腎炎、帕金森氏病和 潰瘍性結(jié)腸炎。
[0113] 如本文所用，"治療"是指臨床干預(yù)試圖改變受治療個體或細(xì)胞的自然過程，而且 可以進(jìn)行用以預(yù)防或在臨床病理學(xué)的過程期間進(jìn)行。有利的治療作用包括預(yù)防疾病發(fā)生或 復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減小疾病進(jìn)展速率、改 善或緩和疾病狀態(tài)和緩解或改進(jìn)預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體來延緩疾病 或病癥的發(fā)展。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和方法影響腫瘤消退。在一個實(shí)施方案 中，本發(fā)明的抗體和方法影響對腫瘤/癌癥生長的抑制。
[0114] 術(shù)語"基本上純化"是指可基本上或大體上不含通常伴有如在其天然產(chǎn)生的環(huán)境 中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或與蛋白質(zhì)相互作用的組分（即，天然細(xì)胞或在重組產(chǎn)生的異源多聚體的 情形下是宿主細(xì)胞）的本文所述的構(gòu)建體或其變體，即在某些實(shí)施方案中，基本上不含細(xì) 胞材料，包括具有小于約30 %、小于約25 %、小于約20 %、小于約15 %、小于約10 %、小于約 5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%或小于約1% (以干重量計）污染性蛋白質(zhì)的蛋白 質(zhì)制劑。當(dāng)異源多聚體或其變體由宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時，在某些實(shí)施方案中蛋白質(zhì)以細(xì)胞 干重量的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1% 或更少存在。當(dāng)異源多聚體或其變體由宿主細(xì)胞重組產(chǎn)生時，在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在 培養(yǎng)基中以細(xì)胞干重量的約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約lg/L、約750mg/L、約500mg/ L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約lmg/L或更少存在。在某些實(shí)施方案 中，如通過諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細(xì)管電泳的適當(dāng)方法測定，由本文所述的 方法產(chǎn)生的"基本上純化的"異源多聚體具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少 約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %的純度水平，特 定而言至少約75%、80%、85%的純度水平，和更特定而言至少約90%的純度水平、至少約 95%的純度水平、至少約99%的純度水平或更大的純度水平。
[0115] "重組宿主細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"是指包括外源多核苷酸的細(xì)胞，而與用來插入的方 法無關(guān)，所述用來插入的方法例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f_雜合或本領(lǐng)域中已知用于制造重組宿 主細(xì)胞的其它方法。外源多核苷酸可保持為非整合載體形式，例如質(zhì)粒，或者可以整合到宿 主基因組中。
[0116] 如本文所用的術(shù)語"培養(yǎng)基（medium/media) "包括可支撐或含有任何宿主細(xì)胞的 任何培養(yǎng)基、溶液、固體、半固體或硬性支撐物，所述宿主細(xì)胞包括細(xì)菌宿主細(xì)胞、酵母宿主 細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞、植物宿主細(xì)胞、真核宿主細(xì)胞、哺乳動物宿主細(xì)胞、CH0細(xì)胞、原核宿主 細(xì)胞、大腸桿菌（E.coli)或假單胞菌宿主細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)含物。因此，此術(shù)語可涵蓋其中 已生長宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如蛋白質(zhì)已分泌到其中的培養(yǎng)基，包括增殖步驟之前或之后 的培養(yǎng)基。此術(shù)語還可以涵蓋含有宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物的緩沖劑或試劑，諸如在胞內(nèi)產(chǎn)生本 文所述的異源多聚體和宿主細(xì)胞被溶解或破壞而釋放異源多聚體的情形下。
[0117] 如本文所用的"重折疊"描述將含有二硫鍵的多肽從不當(dāng)折疊或未折疊狀態(tài)轉(zhuǎn)變 為就二硫鍵而言天然或適當(dāng)折疊的構(gòu)型的任何過程、反應(yīng)或方法。
[0118] 如本文所用的"共折疊"具體是指采用至少兩種彼此相互作用的單體多肽并導(dǎo)致 未折疊或不當(dāng)折疊的多肽轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊?、適當(dāng)折疊的多肽的重折疊過程、反應(yīng)或方法。
[0119] 如本文所用，術(shù)語"已調(diào)節(jié)血清半衰期"意思是本文所述的抗體構(gòu)建體相對于其天 然形式而言所包含的抗原結(jié)合多肽的循環(huán)半衰期的正向或負(fù)向變化。通過在施用構(gòu)建體后 獲取各個時間點(diǎn)的血液樣本并測定每個樣本中的該分子的濃度來測量血清半衰期。血清濃 度與時間的相關(guān)性使得可計算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地是至少約兩倍，但較 小的增加也是適用的，例如在它能進(jìn)行令人滿意的給藥方案或避免毒性作用的情況中。在 一些實(shí)施方案中，增加是至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。
[0120] 如本文所用的術(shù)語"已調(diào)節(jié)治療半衰期"意思是本文所述的單價抗體構(gòu)建體相對 于其未修飾形式而言所包含的治療有效量的抗原結(jié)合多肽的半衰期的正向或負(fù)向變化。通 過測量分子在施用后各個時間點(diǎn)的藥物動力學(xué)和/或藥效學(xué)特性來測量治療半衰期。治 療半衰期增加理想地使得能進(jìn)行特別有益的給藥方案、特別有益的總劑量或避免不利的作 用。在一些實(shí)施方案中，治療半衰期增加是由于效能增加、經(jīng)修飾的分子與其靶標(biāo)的結(jié)合增 加或減少、諸如蛋白酶的酶對分子的分解增加或減少、或未經(jīng)修飾的分子的另一參數(shù)或作 用機(jī)制增加或減少、或受體介導(dǎo)的分子清除率增加或減少。
[0121] 術(shù)語"分離的"在用于核酸或蛋白質(zhì)時表示核酸或蛋白質(zhì)不含至少一些在自然狀 態(tài)下與其相關(guān)的細(xì)胞組分，或核酸或蛋白質(zhì)已被濃縮到大于其在體內(nèi)或體外產(chǎn)生的濃度的 水平。這可以是同質(zhì)狀態(tài)。分離的物質(zhì)可以處于干燥或半干燥狀態(tài)，或在溶液中（包括但 不限于水溶液）。其可以是藥物組合物的一種組分，其包括其它藥學(xué)上可接受的載劑和/或 賦形劑。純度和同質(zhì)性通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法的分析化學(xué)技 術(shù)來測定。作為制劑中存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)是基本上純化的。具體而言，分離的基因 從側(cè)接基因并編碼除所關(guān)注基因以外的蛋白質(zhì)的開放閱讀框分開。術(shù)語"純化"表示核酸或 蛋白質(zhì)在電泳凝膠中基本上產(chǎn)生一個條帶。具體來說，它的意思是核酸或蛋白質(zhì)至少85% 純、至少90 %純、至少95 %純、至少99 %或在更大程度上純。
[0122] 術(shù)語"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸、脫氧核苷、核苷或核苷酸及其聚 合物。除非具體限制，否則此術(shù)語涵蓋含有與參考核酸具有類似的結(jié)合特性并以與天然產(chǎn) 生的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另外具體限制，否 則此術(shù)語還指包括PNA(肽核酸）的寡核苷酸類似物、反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫 代磷酸酯、氨基磷酸鹽等）。除非另外指示，否則特定的核酸序列還暗示性地涵蓋其保守 性修飾的變體（包括但不限于簡并密碼子替換）和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。特 定而言，可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選定的（或所有）密碼子的第三個位置被混合堿 基和/或脫氧肌苷殘基替換的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子替換（Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ;0htsuka 等人，J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985) ;Rossolini 等 人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0123] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。 即，針對多肽的描述同樣適用于對肽的描述和對蛋白質(zhì)的描述，且反之亦然。所述術(shù)語適用 于天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是非天然編碼的氨基酸的氨 基酸聚合物。如本文所用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質(zhì)，其中氨基 酸殘基由共價肽鍵連接。
[0124] 術(shù)語"氨基酸"是指天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的氨基酸以及以與天然產(chǎn)生的氨基 酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼的氨基酸是20種常見的 氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、果仁糖、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸 和纈氨酸）以及吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸類似物是指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有 相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫結(jié)合的碳、羧基、氨基和R基，諸如高絲氨酸、正亮氨 酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。所述類似物具有經(jīng)修飾的R基（諸如正亮氨酸）或經(jīng)修飾 的肽骨架，但保持與天然產(chǎn)生的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。提到的氨基酸包括例如天然 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)源性L-氨基酸；D-氨基酸，經(jīng)過化學(xué)修飾的氨基酸，諸如氨基酸變體和衍生 物；天然產(chǎn)生的非蛋白質(zhì)源性氨基酸，諸如丙氨酸、鳥氨酸等；和具有本領(lǐng)域技術(shù)中已 知的作為氨基酸特征的特性的化學(xué)合成化合物。非天然產(chǎn)生的氨基酸的實(shí)例包括（但不 限于）a -甲基氨基酸（例如，a -甲基丙氨酸）、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸（例如，2-氨 基-組氨酸、羥基-組氨酸、高組氨酸）、側(cè)鏈中具有額外亞甲基的氨基酸（"高"氨基 酸）和側(cè)鏈中的羧酸官能團(tuán)被磺酸基團(tuán)取代的氨基酸（例如，磺基丙氨酸）。向本發(fā)明的蛋 白質(zhì)中并入非天然氨基酸（包括合成非天然氨基酸、經(jīng)取代的氨基酸或一種或多種D-氨基 酸）可在多種不同方面有利。含有D-氨基酸的肽等與含有L-氨基酸的對應(yīng)物相比展示增 加的體外或體內(nèi)穩(wěn)定性。因此，合并有D-氨基酸的肽構(gòu)造等在需要或要求較大的胞內(nèi)穩(wěn)定 性時可尤其適用。更具體而言，D-肽等對內(nèi)源性肽酶和蛋白酶具有抗性，由此在這些特性 合意時提供分子的改善的生物利用度和延長的體內(nèi)壽命。另外，D-肽等無法被有效處理用 于主要組織相容性復(fù)合物II級限制呈現(xiàn)給T輔助細(xì)胞，且因此更不可能在整個生物體中引 發(fā)引發(fā)體液免疫反應(yīng)。
[0125] 在本文中氨基酸可由其通常已知的三個字母符號或由IUPAC-IUB生化命名委員 會推薦的一個字母符號提及。同樣，核苷酸可由其通常被接受的單字母代碼提及。
[0126] "保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。關(guān)于具體的核酸序列，"保守修飾的 變體"是指編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼氨基酸序列 的情況下，是指基本上一致的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能一致的核酸編碼任何 給定的蛋白質(zhì)。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶全部編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙 氨酸由密碼子指定的每個位置，密碼子可變成所述的任何相應(yīng)的密碼子而不改變編碼的多 肽。所述核酸變化是"沉默變化"，這是保守修飾變化的一種。本文中編碼多肽的每個核酸 序列也描述核酸的每種可能的沉默變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到，核酸中的每個密 碼子（除了 AUG(它一般是蛋氨酸的唯一密碼子）和TGG(它一般是色氨酸的唯一密碼子） 以外）都可以被修飾來產(chǎn)生功能一致的分子。因此，每個描述序列中都暗含編碼多肽的核 酸的每個沉默變化。
[0127] 關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識到對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn) 行的改變、增加或缺失編碼序列中的單一氨基酸或小百分比的氨基酸的個別取代、缺失或 增加是"保守修飾變體"，其中改變導(dǎo)致氨基酸的缺失、氨基酸的增加或用化學(xué)上類似的氨 基酸取代氨基酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知提供功能類似氨基酸的保守取代表。所述保守 修飾變體是除了本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因以外且不排除這些。
[0128] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知提供功能類似氨基酸的保守取代表。以下八組各自含有 作為另一種的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸（A)，甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸（D)，谷氨酸（E); 3)天冬酰胺（N)，谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)， 蛋氨酸（M)，纈氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)，蘇氨酸 (T);和[0139]8)半胱氨酸（C)，蛋氨酸（M)(參見例如，Creighton, Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.;第 2 版（1993 年 12 月）
[0129] 術(shù)語"一致"或"同一性百分比"在兩個或更多個核酸或多肽序列的情形中是指 相同的兩個或更多個序列或子序列。，當(dāng)在比較窗口內(nèi)或如使用以下序列比較算法（或本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員可用的其它算法）之一測量的指定區(qū)或通過手動比對和視覺觀察比較 并比對最大對應(yīng)性時，如果序列具有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同，就認(rèn)為它們 是"基本上一致的"（g卩，在指定區(qū)內(nèi)約60 %同一性、約65 %、約70 %、約75 %、約80 %、約 85%、約90%或約95%同一性）。此定義也指檢驗(yàn)序列的互補(bǔ)序列。可在長度為至少約50 個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上或在長度為75至100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或（在不指 定時）在多核苷酸或多肽的整個序列上存在同一'I"生。編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸（包括 來自除類以外的物種的同系物）可以通過包含以下步驟的方法來獲得：在嚴(yán)格的雜交條件 下用具有本發(fā)明的多核苷酸序列或其片段的標(biāo)記探針篩選文庫并分離全長cDNA和含有所 述多核苷酸序列的基因組克隆。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所述雜交技術(shù)。
[0130] 對于序列比較而言，通常一個序列充當(dāng)參考序列，檢驗(yàn)序列與其進(jìn)行比較。在使用 序列比較算法時，將檢驗(yàn)和參考序列輸入計算機(jī)，接著指定座標(biāo)，如果必要并指定序列算法 程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或者可以指定替代參數(shù)。序列比較算法隨后基于程 序參數(shù)來計算檢驗(yàn)序列相對于參考序列的序列同一性百分比。
[0131] 如本文所用的"比較窗口"包括提及選自20至600、通常約50至約200、更通常 約100至約150的連續(xù)位置數(shù)中的任一個的區(qū)段，其中可以在使兩個序列最佳對準(zhǔn)后將一 個序列與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列進(jìn)行比較。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知用于比較 的序列對準(zhǔn)方法。用于比較的最佳序列對準(zhǔn)可以通過（包括但不限于）Smith和Waterman 的局部同源算法（1970) Adv. Appl. Math. 2:482c、通過Needleman和Wunsch的同源比對 算法（1970) J. Mol. Biol. 48:443、通過 Pearson 和 Lipman 對類似性方法的搜尋（1988) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85:2444、通過計算機(jī)執(zhí)行這些算法（GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，在 Wisconsin Genetics 軟件包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, Wis.)或通過手動對比對和視覺觀察（參見例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995 增刊））來進(jìn)行。
[0132] 適合測定序列同一性百分比和序列類似性的算法的一個實(shí)例是BLAST和BLAST 2. 0 算法，分別在 Altschul 等人（1997)Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 和 Altschul 等人 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中進(jìn)行描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過在萬維 網(wǎng)ncbi. nlm. nih. gov上可用的國家生物技術(shù)信息中心公開獲得。BLAST算法參數(shù)W、T和X 決定比對的敏感性和速度。BLASTN程序（對于核苷酸序列而言）使用字長（W)為11、期望值 (E)為10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對于氨基酸序列而言，BLASTP程序使 用字長為3、且預(yù)期值（E)為10、且BL0SUM62計分矩陣（參見Henikoff和Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對（B)為 50、預(yù)期值（E)為 10、M = 5、N = -4 和兩 條鏈的比較作為默認(rèn)值。BLAST算法通常在"低復(fù)雜性"過濾器關(guān)閉的情形下進(jìn)行。
[0133] BLAST算法也在兩個序列之間進(jìn)行對類似性的統(tǒng)計學(xué)分析（參見例如，Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)。由 BLAST 算法提供的類似性的 一個量度是最小概率和（P (N))，它對于兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率 提供指示。舉例而言，如果檢驗(yàn)核酸與參考核酸比較中的最小概率和小于約〇. 2、或小于約 0. 01、或小于約0. 001,就認(rèn)為核酸與參考序列類似。
[0134] 短語"選擇性地（或特異性地）雜交"是指當(dāng)復(fù)合混合物（包括（但不限于）總 的細(xì)胞或文庫DNA或RNA)中存在特定的核苷酸序列時，分子只與此序列在嚴(yán)格的雜交條件 下結(jié)合、成雙鏈或雜交。
[0135] 短語"嚴(yán)格的雜交條件"是指DNA、RNA或其它核酸或其組合的序列在如本領(lǐng)域 已知的低離子強(qiáng)度和高溫條件下雜交。通常，在嚴(yán)格條件下，探針將與核酸復(fù)合混合物 (包括（但不限于）總細(xì)胞或文庫DNA或RNA)中的其靶標(biāo)子序列雜交，但不與復(fù)合混合 物中的其它序列雜交。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境下將不同。較長的序 列在較高溫度下特異性地雜交。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)可見于Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"（1993)中。
[0136] 如本文所用，術(shù)語"真核生物"是指屬于原核生物（Eucarya)系統(tǒng)發(fā)育域的生物 體，諸如動物（包括（但不限于）哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等）、纖毛蟲、植物（包括 (但不限于）單子葉植物、雙子葉植物、藻類等）、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物 等。
[0137] 如本文所用，術(shù)語"原核生物"是指原核生物體。舉例而言，非-真核生物體可 屬于真細(xì)菌（Eubacteria)(包括（但不限于）大腸桿菌（Escherichia coli)、嗜熱細(xì)菌 (Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)、突光假 單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、綠胺假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、惡臭 假單胞菌（Pseudomonas putida)等）系統(tǒng)發(fā)育域或古生菌（Archaea)(包括（但不限 于）詹氏甲燒球菌（Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌（Methanobacterium thermoautotrophicum)、鹽桿菌屬（Halobacterium)(諸如沃氏嗜鹽富饒菌（Haloferax volcanii)和鹽桿菌屬物種NRC-1)、閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus)、強(qiáng)烈熾熱 球菌（Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌（Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細(xì)菌 (Aeuropyrum pernix)等）系統(tǒng)發(fā)育域。
[0138] 如本文所用的術(shù)語"受治療者"是指動物，在一些實(shí)施方案中是指哺乳動物，且在 其它實(shí)施方案中是指人，它們是治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的目標(biāo)。動物可以是同伴動物（例如，狗、 貓等）、農(nóng)場動物（例如，奶牛、綿羊、豬、馬等）或?qū)嶒?yàn)室動物（例如，大鼠、小鼠、豚鼠等）。
[0139] 如本文所用的術(shù)語"有效量"是指施用的將在一定程度上減輕接受治療的疾病、病 況或病癥的一種或多種癥狀的單價抗體構(gòu)建體的量。含有本文所述的構(gòu)建體的組合物可被 施用來用于預(yù)防性、增強(qiáng)性和/或治療性治療。
[0140] 術(shù)語"增強(qiáng)（enhance或enhancing) "意思是增加或延長所需作用的效能或持續(xù) 時間。因此，關(guān)于增強(qiáng)藥物分子或治療劑的作用而言，術(shù)語"增強(qiáng)"是指增加或延長治療劑 對系統(tǒng)作用的效能或持續(xù)時間的能力。如本文所用的"增強(qiáng)有效量"是指足以增強(qiáng)另一種 治療劑或藥物在所需系統(tǒng)中的作用的量。當(dāng)用在患者中時，對此用途有效的量將取決于疾 病、病癥或病況的嚴(yán)重程度和過程、先前的治療、患者的健康狀態(tài)和對藥物的反應(yīng)以及治療 醫(yī)師的判斷。
[0141] 如本文所用的術(shù)語"修飾"是指對給定多肽進(jìn)行的任何改變，諸如改變多肽的長 度、多肽的氨基酸序列、化學(xué)結(jié)構(gòu)、共翻譯修飾或翻譯后修飾。"（修飾）"形式的術(shù)語意思是 討論的多肽任選地經(jīng)修飾，即討論的多肽可以是修飾的或未修飾的。
[0142] 術(shù)語"翻譯后修飾"是指在天然或非天然氨基酸被并入多肽鏈中之后此種氨基酸 發(fā)生的任何修飾。僅舉例而言，此術(shù)語涵蓋共翻譯體內(nèi)修飾、共翻譯體外修飾（諸如在無細(xì) 胞翻譯系統(tǒng)中）、翻譯后體內(nèi)修飾和翻譯后體外修飾。
[0143] 如本文所用的術(shù)語"單特異性二價抗體構(gòu)建體"是指具有兩個與相同表位/抗原 結(jié)合（單特異性）的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（二價）的抗體構(gòu)建體。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是（但 不限于）諸如Fab(片段抗原結(jié)合）、scFv (單鏈Fv)核sdab (單結(jié)構(gòu)域抗體）的蛋白質(zhì)構(gòu) 建體。單特異性二價抗體構(gòu)建體在本文中也稱為"全尺寸抗體"或"FSA"。單特異性二價抗 體構(gòu)建體是測量單價抗體構(gòu)建體特性的參考。
[0144] 術(shù)語"親合力"在本文中用來指治療性單特異性二價抗體的結(jié)合親和力和重要結(jié) 構(gòu)與生物屬性的組合協(xié)同強(qiáng)度。缺乏親合力和喪失協(xié)同結(jié)合強(qiáng)度可導(dǎo)致表觀靶標(biāo)結(jié)合親和 力減小。另一方面，在具有固定抗原數(shù)的靶細(xì)胞上，由多價（或二價）結(jié)合產(chǎn)生的親合力導(dǎo) 致在相對于展示單價結(jié)合的抗體而言較少的抗體分子數(shù)時對靶抗原的占有率增加。在較少 數(shù)目的抗體分子與靶細(xì)胞結(jié)合時，在二價裂解性抗體的應(yīng)用中，抗體依賴性的細(xì)胞毒性殺 傷機(jī)制可能無法有效進(jìn)行，導(dǎo)致功效減小。無足夠的抗體結(jié)合來介導(dǎo)ADCC，因?yàn)锳DCC、CDC、 ADCP -般被認(rèn)為具有Fc濃度閾值依賴性。在激動性抗體的情形下，親合力減小使其交聯(lián)和 二聚抗原且活化路徑的效率減小。
[0145] "單結(jié)構(gòu)域抗體"或"Sdab"-單結(jié)構(gòu)域抗體（諸如Camelid VhH結(jié)構(gòu)域）是個別 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。Sdab相當(dāng)穩(wěn)定且易于表達(dá)成具有抗體Fc鏈的融合配偶體（Harmsen MM, De Haard HJ(2007). "Properties,production, and applications of camelid single-domain antibody fragments，'? Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1):13-22) 〇
[0146] "HER受體"是屬于人表皮生長因子受體（HER)家族的受體蛋白酪氨酸激酶且包括 EGFR、HER2、HER3和HER4受體。HER受體一般將包含胞外結(jié)構(gòu)域，其可結(jié)合HER配體；親脂 性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和具有幾個可經(jīng)磷酸化的酪氨酸殘基的羧 基端信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0147] HER2的胞外（ecto)結(jié)構(gòu)域包括四個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域I(ECD1，約1至195的氨基酸 殘基）、結(jié)構(gòu)域II (E⑶2,約196至319的氨基酸殘基）、結(jié)構(gòu)域III (E⑶3,約320至488的 氨基酸殘基）和結(jié)構(gòu)域IV (ECD4,約489至630的氨基酸殘基）（殘基編號不含信號肽）。 參見 Garrett 等人，Mol. Cell. 11:495-505 (2003)、Cho 等人，Nature 421:756-760 (2003)、 Franklin 等人，Cancer Cell 5:317-328(2004)、Tse 等人，Cancer Treat Rev. 2012 年 4 月；38 (2) : 133-42 (2012)或 Plowman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)。
[0148] 表達(dá)"ErbB2"和"HER2"在本文中可互換使用且是指例如在Semba等 人，PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)和 Yamamoto 等人，Nature 319:230-234(1986)(基因 庫登錄號X03363)中所述的人HER2蛋白。術(shù)語"erbB2"和"neu"是指編碼人ErbB2蛋白 的基因。P185或pl85neu是指neu基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。
[0149] "HER配體"意思是結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。在本文中特別關(guān)注 的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子（EGF) (Savage等人，J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972));轉(zhuǎn)化生長因子 a (TGF-a ) (Marquardt 等人，Science 223:1079-1082(1984));雙調(diào)蛋白，也稱為神經(jīng)鞘瘤或角化細(xì)胞自分泌生長因子（Shoyab 等人，Science 243:1074-1076(1989) ;Kimura 等人，Nature348:257-260 (1990);和 Cook 等人，Mol.Cell. Biol. 11:2547-2557(1991)) 細(xì)胞素（Shing 等人，Science 259:1604-1607 (1993);和 Sasada 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); 肝素-結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF)(Higashiyama 等人，Science 251:936-939(1991)); 上皮調(diào)節(jié)蛋白（Toyoda 等人，J. Biol. Chem. 270:7495-7500(1995);和 Komurasaki 等 人，0ncogenel5:2841_2848 (1997));調(diào)蛋白（heregulin)(參見下文）；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白 _2 (NRG-2) (Carraway 等人，Nature 3耵：512_516 (I"7));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 _3 (NRG-3) (Zhang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. M: 9562_9567 (I"7));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4 (NRG-4) (Harari 等人，Oncogene 18:2681-89(1999))或畸胎瘤衍化生長因子（cripto，CR-1) (Kannan 等人，J. Biol. Chem. 272 (6) : 3330-3335 (1997))。結(jié)合 EGFR 的 HER 配體包括 EGF、 TGF-a、雙調(diào)蛋白、@細(xì)胞素、HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白。 能結(jié)合HER4的HER配體包括0細(xì)胞素、上皮調(diào)節(jié)蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和調(diào) 蛋白。
[0150] "調(diào)蛋白"（HRG)在本文中使用時是指如美國專利號5,641，869或Marchionni 等人，Nature, 362:312-318(1993)中公開的由調(diào)蛋白基因產(chǎn)物編碼的多肽。調(diào) 蛋白的實(shí)例包括調(diào)蛋白- ct、調(diào)蛋白- @1、調(diào)蛋白-@2和調(diào)蛋白-@3 (Holmes等 人，Science, 256:1205-1210 (1992);和美國專利號 5,641,869) ;neu 分化因子 (NDF) (Peles 等人，Cell 69:205-216(1992));乙酰膽堿受體-誘發(fā)活性（ARIA) (Falls 等人，Cell 72:801-815(1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長因子（GGF) (Marchionni 等 人，Nature, 362:312-318 (1993));感覺和運(yùn)動神經(jīng)元衍生因子（SMDF) (Ho等人，J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995));y-調(diào)蛋白（Schaefer 等人，Oncogene 15:1385-1394 (1997))。此術(shù)語包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列 變體，諸如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段（例如，HRGP 1177-244)。
[0151] "HER活化"或"HER2活化"是指任一種或多種HER受體或HER2受體的活化或磷酸 化。HER活化一般導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（例如，由HER受體或基質(zhì)多肽中的HER受體磷酸化酪氨酸 殘基的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起）。ffiR活化可由與包含所關(guān)注ffiR受體的ffiR二聚體結(jié)合的 HER配體來介導(dǎo)。與HER二聚體結(jié)合的HER配體可活化二聚體中一個或多個HER受體的激 酶結(jié)構(gòu)域且由此導(dǎo)致一個或多個HER受體中的酪氨酸殘基的磷酸化作用和/或另外基質(zhì)多 肽（諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶）中的酪氨酸殘基的磷酸化作用。
[0152] 抗體"效應(yīng)功能"是指由抗體的Fc區(qū)（天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū)） 引起的那些生物活性?？贵w效應(yīng)功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體 結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體（例如，B細(xì)胞受 體；BCR)的下調(diào)等。
[0153] 抗體的"Fab片段"（也稱為片段抗原結(jié)合）含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域（CL)和重鏈 的第一恒定結(jié)構(gòu)域（CH1)以及分別位于輕鏈和重鏈上的可變結(jié)構(gòu)域VL和VH?？勺兘Y(jié)構(gòu)域 包含在抗原結(jié)合中涉及的互補(bǔ)決定環(huán)（⑶R，也成為高變區(qū)）。Fab'片段與Fab片段的不同 之處在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端加入幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半 胱氨酸。
[0154] "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于 單多肽鏈中。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)v多肽另外在VH與VL結(jié)構(gòu)域之間包含多肽連接子，這使 得scFv形成抗原結(jié)合所需要的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷中，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁（1994)。HER2 抗體 scFv 片段在 TO93/16185 ;美國專利號 5, 571，894 ; 和美國專利號5, 587, 458中描述。
[0155] "人源化"形式的非人（例如，嚙齒動物）抗體是含有源自非人免疫球蛋白的最小 序列的嵌合抗體。在大多數(shù)的情況下，人源化抗體是其中受體高變區(qū)的殘基由來自諸如小 鼠、大鼠、兔子或非人靈長動物的非人物種（供體抗體）的高變區(qū)的具有所需特異性、親和 力和能力的殘基取代的人免疫球蛋白（受體抗體）。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架 區(qū)（FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中 未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾來進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本 上全部的至少一個、且通常是兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本上全部的高變環(huán)對應(yīng)于非 人免疫球蛋白的高變環(huán)且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體 任選地也將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)（Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白 的恒定區(qū)。關(guān)于進(jìn)一步詳情，參見Jones等人，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann等 人，Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
[0156] 人源化HER2抗體包括如以引用的方式明確并入本文中的美國專利號5, 821，337 的表 3 中所述的 huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、 huMAb4D5-6、huMAb4D5-7 和 huMAb4D5-8 或曲妥珠單抗(HERCEPTIN?);如美國專利公布 號2006/0018899中所述的人源化520C9 (W093/21319)和20'人源化2C4抗體。
[0157] "表位2C4"是抗體2C4結(jié)合的HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)。為了篩選結(jié)合2C4表位 的抗體，可進(jìn)行諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 編者Harlow和David Lane(1988)中所述的常規(guī)交叉阻斷分析?；蛘撸梢赃M(jìn)行表位定 位來評估是否使用本領(lǐng)域已知的方法使抗體與J1ER2的2C4表位結(jié)合和/或可以研究抗 體-HER2 結(jié)構(gòu)（Franklin 等人，Cancer Cell 5:317-328(2004))來確定抗體結(jié)合 HER2 的 哪個結(jié)構(gòu)域。表位2C4包含來自HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)域II的殘基。2C4和帕妥 珠單抗在結(jié)構(gòu)域I、II和III的接合處結(jié)合HER2的胞外結(jié)構(gòu)域。Franklin等人，Cancer Cell5:317-328(2004)。
[0158] "表位4D5"是抗體4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠單抗結(jié)合的HER2的胞外結(jié)構(gòu)域 中的區(qū)。此表位接近HER2的跨膜結(jié)構(gòu)域且在HER2的結(jié)構(gòu)域IV中。為了篩選結(jié)合4D5表位 的抗體，可進(jìn)行諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 編者Harlow和David Lane (1988)中所述的常規(guī)交叉阻斷分析?；蛘?，可以進(jìn)行表位定位 來評估抗體是否結(jié)合J1ER2的4D5表位（例如，大約殘基529至大約殘基625 (包括殘基529 和殘基625在內(nèi)）區(qū)內(nèi)的任一個或多個殘基，參考美國專利公布號2006/0018899的圖1)。
[0159] "表位7C2/F3"是7C2和/或7F3抗體（各自以ATCC寄存，參考下文）結(jié)合的 HER2的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I內(nèi)N端的區(qū)。為了篩選結(jié)合7C2/7F3表位的抗體，可進(jìn)行諸 如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,編者Harlow和 DavidLane(1988)中所述的常規(guī)交叉阻斷分析。或者，可以進(jìn)行表位定位來確定抗體是否 結(jié)合HER2上的7C2/7F3表位（例如，HER2的大約殘基22至大約殘基53區(qū)內(nèi)的任一個或 多個殘基，參見美國專利公布號2006/0018899的圖1)。
[0160] 如本文所用的術(shù)語"抗原調(diào)節(jié)"是指諸如在ADC中的表面受體密度通過內(nèi)化或下 調(diào)）的變化或損失。
[0161] 抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體
[0162] 單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體可源自已知的抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或 可源自新型的抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。識別用于單價抗體構(gòu)建體的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體是 基于靶細(xì)胞的選擇和基于在靶細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原的選擇。舉例而言，一旦選定靶細(xì)胞， 就選擇a)在靶細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)，而不在其它細(xì)胞的表面上表達(dá)，或b)在靶細(xì)胞的細(xì) 胞表面上以較高水平表達(dá)，而在其它細(xì)胞的表面上以較低水平表達(dá)的抗原。這樣可以選擇 性地來靶向靶細(xì)胞。
[0163] 靶細(xì)胞的選擇
[0164] 基于單價抗體構(gòu)建體的預(yù)期用途來選擇靶細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是在 癌癥、感染性疾病、自體免疫疾病或炎癥性疾病中活化或擴(kuò)增的細(xì)胞。
[0165] 在一個實(shí)施方案中，當(dāng)單價抗體構(gòu)建體打算用于治療癌癥時，靶細(xì)胞源自展示 HER23+過度表達(dá)的腫瘤。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞源自展示HER2低表達(dá)的腫瘤。在一個 實(shí)施方案中，靶細(xì)胞源自展示J1ER2抗性的腫瘤。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞源自為三陰性 (ER/PR/HER2)腫瘤的腫瘤。
[0166] 在單價抗體構(gòu)建體打算用于治療癌癥的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是代表HER23+過度 表達(dá)的癌細(xì)胞系，例如SKBR3、BT474。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是代表HER2低表達(dá)的癌 細(xì)胞系，例如MCF7。在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是代表HER2抗性的癌細(xì)胞系，例如JIMT1。 在一個實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是代表乳癌三陰性的癌細(xì)胞系，例如MDA-MD-231細(xì)胞。
[0167] 在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單價抗體構(gòu)建體被設(shè)計成靶向乳癌細(xì)胞。示例 性種類的乳癌細(xì)胞包括（但不限于）以下：孕酮受體（PR)陰性和雌激素受體（ER)陰性細(xì) 胞、低HER 2表達(dá)細(xì)胞、中HER2表達(dá)細(xì)胞、高HER2表達(dá)細(xì)胞或抗HER2抗體抗性細(xì)胞。
[0168] 在一個實(shí)施方案中，本文所述的單價抗體構(gòu)建體被設(shè)計成靶向胃腺癌和食管腺 癌。示例性的組織學(xué)類型包括：具有腸表型的HER2陽性近端胃癌和HER2陽性遠(yuǎn)端彌漫性 胃癌。示例性種類的胃癌細(xì)胞包括（但不限于）（N-87、0E-19、SNU-216和MKN-7)。
[0169] 在另一個實(shí)施方案中，本文所述的單價抗體構(gòu)建體被設(shè)計成靶向腦中的轉(zhuǎn)移性 HER2+乳癌腫瘤。示例性種類的胃癌細(xì)胞包括（但不限于）BT474(如上文關(guān)于乳癌）。
[0170] 抗原的選擇
[0171] 如上文所示，抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體結(jié)合的抗原是取決于單價抗體構(gòu)建體打算結(jié)合 的靶細(xì)胞來選擇。在一個實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體結(jié)合的抗原是基于與其它細(xì)胞 表面相比1)在靶細(xì)胞表面上的表達(dá)增加或b)在靶細(xì)胞表面上的選擇性表達(dá)來選擇。因此， 在一個實(shí)施方案中，單價抗體構(gòu)建體被設(shè)計成靶向表A1中列出的靶細(xì)胞類型之一。
[0172] 表A1 :抗體和各自靶細(xì)胞的清單
[0173]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含： 單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和 二聚Fc多肽構(gòu)建體，所述Fc多肽構(gòu)建體包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽， 其中一個所述單體Fc多肽與至少一個來自所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的多肽融合； 其中所述單價抗體構(gòu)建體以以下參數(shù)選擇性地和/或特異性地結(jié)合展示所述抗原的 靶細(xì)胞： 與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體相比增加的結(jié)合密度和Bmax; 與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)?shù)慕怆x常數(shù)（Kd); 與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)或較慢的解離速率； 且其中所述單價抗體構(gòu)建體展示與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)?shù)纳镂锢韺W(xué) 和體內(nèi)穩(wěn)定性；和與所述單特異性二價抗體構(gòu)建體相當(dāng)或更大的對靶細(xì)胞毒性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價抗體構(gòu)建體阻斷同源 配體與所述靶抗原的結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價抗體構(gòu)建體不阻斷同 源配體與所述靶抗原的結(jié)合。
4. 如權(quán)利要求1所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中在抗體與靶標(biāo)的比率為1:1時， 在大于觀察到的所述抗體的平衡常數(shù)（Kd)直到飽和濃度的濃度下觀察到結(jié)合密度和Bmax 相對于單特異性二價抗體的增加。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中在大于觀察到的所 述抗體的平衡常數(shù)（Kd)直到飽和濃度的濃度下，所述單價抗體構(gòu)建體與所述相應(yīng)二價抗 體構(gòu)建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C功效中的至少一種。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是包含 參與效應(yīng)物活性的Fc結(jié)構(gòu)域的單價裂解性抗體構(gòu)建體， 其中所述裂解性抗體構(gòu)建體是非激動性的、可阻斷同源配體與所述靶抗原結(jié)合、阻斷 抗原信號傳導(dǎo)、抑制細(xì)胞生長；且 其中所述裂解性抗體構(gòu)建體以與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建 體相比增加的Bmax、快速的結(jié)合速率和相當(dāng)?shù)慕怆x速率結(jié)合所述靶細(xì)胞并使其飽和。
7. 如權(quán)利要求6所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體未經(jīng)內(nèi)化。
8. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體經(jīng)內(nèi)化。
9. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是經(jīng)過 有效內(nèi)化的單價內(nèi)化抗體構(gòu)建體； 其中所述內(nèi)化抗體可阻斷抗原信號傳導(dǎo)、是非激動性的、阻斷同源配體與所述靶抗原 結(jié)合且不引發(fā)細(xì)胞生長；且 其中所述內(nèi)化抗體構(gòu)建體以與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu)建體 相比增加的Bmax、快速的結(jié)合速率和較慢的解離速率結(jié)合所述靶細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求1至6、8或9中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體 的內(nèi)化大于、等于或小于所述單特異性二價抗體的內(nèi)化。
11. 如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 Bmax的增加與所述靶細(xì)胞上的所述抗原的密度無關(guān)。
12. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 Bmax的增加與所述靶抗原表位無關(guān)。
13. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述靶細(xì)胞是表 達(dá)所述同源抗原的細(xì)胞，所述細(xì)胞選自包括以下的清單：癌細(xì)胞和表達(dá)HER受體的病變細(xì) 胞。
14. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體不展 現(xiàn)親合力。
15. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述二聚Fc多肽 構(gòu)建體是異源二聚體的。
16. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗原結(jié)合多 肽構(gòu)建體結(jié)合HER2且其中所述靶細(xì)胞是以下中的至少一種：低、中或高HER2表達(dá)細(xì)胞、孕 酮受體陰性細(xì)胞或雌激素受體陰性細(xì)胞。
17. 如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗原結(jié)合多 肽構(gòu)建體結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域是E⑶1、2、3和4中的至少一種。
18. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價抗原結(jié) 合多肽構(gòu)建體是能結(jié)合所述抗原的Fab片段、scFv、SdAb、抗原結(jié)合肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
19. 如權(quán)利要求17所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述Fab片段包含重鏈多肽和 輕鏈多肽。
20. -種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含： 單價地結(jié)合HER2的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和 包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合； 其中在高于Kd的等摩爾濃度下和在飽和下，與結(jié)合HER2的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比， 所述抗體構(gòu)建體介導(dǎo)由免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fe γ R對所述靶細(xì)胞的增加的裝飾。
21. -種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含： 單價地結(jié)合HER2的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和 包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合； 其中所述抗體構(gòu)建體由靶細(xì)胞內(nèi)化， 其中所述構(gòu)建體與結(jié)合HER2的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出與所述祀細(xì)胞上展示 的HER2的結(jié)合密度和Bmax的增加，且 其中在高于Kd的等摩爾濃度下和在飽和下，所述構(gòu)建體與所述相應(yīng)二價HER2結(jié)合抗 體構(gòu)建體相比展示較高ADCC、較高ADCP和較高⑶C中的至少一種。
22. -種結(jié)合HER2的分離的單價抗體構(gòu)建體，其包含： 單價地結(jié)合HER2的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體；和 包含兩個各自包含CH3結(jié)構(gòu)域的單體Fc多肽的二聚Fc多肽構(gòu)建體，其中所述單體Fc 多肽中的一個與所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合； 其中所述抗體構(gòu)建體結(jié)合FcRn，但與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)單特異性二價抗體構(gòu) 建體相比展示較高的Vss。
23. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價抗體構(gòu) 建體與一個或多個藥物分子偶聯(lián)。
24. 如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述抗體構(gòu)建體 不展現(xiàn)親合力。
25. 如權(quán)利要求13至14中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單價HER2 結(jié)合多肽構(gòu)建體是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一種。
26. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備 的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種大于具有兩個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建 體的約105%。
27. 如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備 的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種是具有兩個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體 的至少約125%。
28. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備 的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種是相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的至少約150 %。
29. 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具備 的ADCC、ADCP和CDC中的至少一種是具有兩個抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體 的至少約300%。
30. 如權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 Bniax的增加是所述相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約125%。
31. 如權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 Bniax的增加是所述相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約150%。
32. 如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)合密度和 Bniax的增加是所述相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體的結(jié)合密度和Bmax的至少約200%。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述二聚Fc構(gòu) 建體是包含變體CH3結(jié)構(gòu)域的異源二聚Fc構(gòu)建體。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，所述變體CH3結(jié)構(gòu)域包含促使形 成具有與天然同源二聚Fc區(qū)相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性的所述異源二聚體的氨基酸突變。
35. 如權(quán)利要求33所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約 70°C或更高的熔解溫度（Tm)。
36. 如權(quán)利要求34所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約 75°C或更高的熔解溫度（Tm)。
37. 如權(quán)利要求35所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約 80°C或更高的熔解溫度（Tm)。
38. 如權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述二聚Fe構(gòu)建 體還包含含有促使選擇性結(jié)合Fe γ受體的氨基酸修飾的變體CH2結(jié)構(gòu)域。
39. 根據(jù)權(quán)利要求32至37中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述異源二聚體Fe 構(gòu)建體相對于野生型Fe區(qū)而言在所述CH3結(jié)構(gòu)域中不包含另外的二硫鍵。
40. 根據(jù)權(quán)利要求32至38中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述異源二聚體Fe 構(gòu)建體相對于野生型Fe區(qū)而言在所述變體CH3結(jié)構(gòu)域中包含另外的二硫鍵，且其中所述變 體CH3結(jié)構(gòu)域具有至少約77. 5°C的熔解溫度（Tm)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構(gòu)建體是 以大于約75%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。
42. 根據(jù)權(quán)利要求1至40中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構(gòu)建體是 以大于約80%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。
43. 根據(jù)權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構(gòu)建體是 以大于約90%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體，其中所述二聚Fc構(gòu)建體是 以大于約95%的純度形成的異源二聚Fc構(gòu)建體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求1至43中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述單體Fc多 肽通過連接子與所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體融合。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述連接子是多肽連接子。
47. -種宿主細(xì)胞，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1至45中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體 構(gòu)建體的核酸。
48. 如權(quán)利要求46所述的宿主細(xì)胞，其中所述編碼所述抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體的核酸和 所述編碼所述Fc構(gòu)建體的核酸存在于單一載體中。
49. 一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至47中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體的方法，所 述方法包括以下步驟：(a)培養(yǎng)包含編碼所述抗體片段的核酸的宿主細(xì)胞；和（b)從所述宿 主細(xì)胞培養(yǎng)物回收所述抗體片段。
50. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體和 藥學(xué)上可接受的載劑。
51. 如權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其還包含與所述單價抗體構(gòu)建體偶聯(lián)的藥物分 子。
52. -種治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權(quán)利要求49至51中 任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
53. -種治療HER信號傳導(dǎo)紊亂的方法，其向有需要的患者提供有效量的如權(quán)利要求 49至51中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
54. -種抑制腫瘤生長的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至 45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
55. -種使腫瘤萎縮的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至45 中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
56. -種抑制抗原分子的信號傳導(dǎo)的方法，其包括使所述抗原與包含有效量的根據(jù)權(quán) 利要求1至45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
57. -種抑制抗原與其同源結(jié)合配偶體結(jié)合的方法，其包括使所述抗原與包含足以與 所述抗原結(jié)合的量的根據(jù)權(quán)利要求1至45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
58. -種治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權(quán)利要求12至45中 任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體。
59. -種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDMl和抗HER二價抗體中的一種或多種的治 療具有部分反應(yīng)的患者中治療乳癌的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的如 權(quán)利要求12至45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體。
60. -種在對用曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、TDMl (ADC)和抗HER二價抗體中的一種或多 種的治療無反應(yīng)的患者中治療乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的如權(quán)利要 求12至45中任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體。
61. 如權(quán)利要求57至60中任一項(xiàng)所述的治療乳癌的方法，其中所述方法包括除另一種 治療劑以外還提供所述抗體構(gòu)建體。
62. 如權(quán)利要求60所述的治療乳癌的方法，其中所述抗體構(gòu)建體與所述治療劑同時提 供。
63. 如權(quán)利要求60所述的治療乳癌的方法，其中所述抗體構(gòu)建體與所述治療劑偶聯(lián)。
64. -種在穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生糖基化單價抗體構(gòu)建體或糖基化工程改造的無 巖藻糖基化單價抗體構(gòu)建體的方法，其包括： 用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞： 編碼包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和第一 Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列； 編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽 無可變結(jié)構(gòu)域；和 編碼包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA序列， 以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞 中以預(yù)定比率轉(zhuǎn)染； 在所述至少一種哺乳動物細(xì)胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第 三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)成需 要的糖基化單價不對稱抗體。
65. 如權(quán)利要求63所述的方法，其包括用不同預(yù)定比率的所述第一DNA序列、所述第二 DNA序列和所述第三DNA序列轉(zhuǎn)染至少兩種不同細(xì)胞以便所述至少兩種細(xì)胞各自以不同的 比率表達(dá)所述重鏈多肽和所述輕鏈多肽。
66. 如權(quán)利要求64所述的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列中至少兩 種的多順反子載體轉(zhuǎn)染所述至少一種哺乳動物細(xì)胞。
67. 如權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種哺乳動物細(xì)胞選自 VERO、HeLa、HEK、NS0、中國倉鼠卵巢（CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2 和 MDCK 細(xì)胞及其子 類和變體。
68. 如權(quán)利要求63至66中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序 列：第三DNA序列的所述預(yù)定比率是約1: 1:1。
69. 如權(quán)利要求63至67中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 DNA序列：第二DNA序 列：第三DNA序列的所述預(yù)定比率使得所翻譯的第一重鏈多肽的量約等于所述第二重鏈多 肽的量和所述輕鏈多肽的量。
70. 如權(quán)利要求63至68中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞 的表達(dá)產(chǎn)物與所述單體重鏈或輕鏈多肽或其它抗體相比包含更大百分比的所述需要的糖 基化單價抗體。
71. 如權(quán)利要求63至69中任一項(xiàng)所述的方法，其包括鑒定和純化所述需要的糖基化單 價抗體。
72. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述鑒定是通過液相色譜法和質(zhì)譜分析法中的一 者或兩者來進(jìn)行。
73. -種產(chǎn)生具有改善的ADCC的抗體構(gòu)建體的方法，其包括： 用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞： 編碼包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和第一 Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列； 編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽 無可變結(jié)構(gòu)域；和 編碼包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA序列， 以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞 中以預(yù)定比率轉(zhuǎn)染； 在所述至少一種哺乳動物細(xì)胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第 三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)成糖 基化單價抗體，其中所述糖基化單價不對稱抗體與相應(yīng)野生型抗體相比具有較高的ADCC。
74. -種產(chǎn)生具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種的HER2結(jié)合抗體構(gòu)建體的 方法，其包括： 用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞： 編碼包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和第一 Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第一重鏈多肽的第一 DNA序列； 編碼包含第二Fc結(jié)構(gòu)域多肽的第二重鏈多肽的第二DNA序列，其中所述第二重鏈多肽 無可變結(jié)構(gòu)域；和 編碼包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的輕鏈多肽的第三DNA序列， 以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳動物細(xì)胞 中以預(yù)定比率轉(zhuǎn)染； 在所述至少一種哺乳動物細(xì)胞中翻譯所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第 三DNA序列以便所述重鏈和輕鏈多肽在所述至少一種穩(wěn)定的哺乳動物細(xì)胞中被表達(dá)成不 對稱的糖基化單價HER2結(jié)合抗體，其中所述糖基化單價HER2結(jié)合抗體與相應(yīng)野生型HER2 結(jié)合抗體相比具有改善的ADCC、ADCP和⑶C中的至少一種。
75. -種增加至少一種靶細(xì)胞上的抗體濃度的方法，其向所述靶細(xì)胞提供包含以下的 單價抗體構(gòu)建體： 單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體； 二聚Fc區(qū)； 其中所述單價抗體構(gòu)建體與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出 與展示所述抗原的靶細(xì)胞的結(jié)合密度和Bmax的增加，且 其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯示改善的功效，且其中所述改 善的功效并非由所述抗原的交聯(lián)、抗原二聚化而引起。
76. -種增加至少一種靶細(xì)胞上的抗體濃度的方法，其向所述靶細(xì)胞提供包含以下的 單價抗體構(gòu)建體： 單價地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體； 二聚Fc區(qū)； 其中所述單價抗體構(gòu)建體與具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比展示出 與展示所述抗原的靶細(xì)胞的結(jié)合密度和Bmax的增加，且 其中所述單價抗體構(gòu)建體與相應(yīng)二價抗體構(gòu)建體相比顯示改善的功效，且其中所述改 善的功效可包括抗原調(diào)節(jié)。
77. -種殺傷腫瘤的方法，其包括使所述腫瘤與包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至45中 任一項(xiàng)所述的單價抗體構(gòu)建體的組合物接觸。
78. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述靶細(xì)胞是表 達(dá)所述同源抗原的細(xì)胞，所述細(xì)胞選自包括以下的清單：癌細(xì)胞和表達(dá)HER2的病變細(xì)胞。
79. 如權(quán)利要求6所述的分離的單價抗體構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是非激動性的或部 分激動性的。
【文檔編號】C12N15/85GK104520327SQ201380036769
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月10日
【發(fā)明者】G·Y·K·吳, S·B·迪克西特, T·斯普雷特馮克羅登斯泰恩 申請人:酵活有限公司