一種果酒生物降酸新菌株、制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種果酒生物降酸新菌株、制備方法及其應用，該菌種是一株植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌Lactobacillus?plantarum已保藏于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.7462。本發(fā)明還涉及該菌株的制備方法以及在含有蘋果酸和/或檸檬酸的果酒中進行生物降酸的應用。本發(fā)明的植物乳桿菌SGJ-24對高酒精度、低pH值、高SO2的酒體環(huán)境適應良好，能迅速降解果酒中的蘋果酸和檸檬酸，安全性高，具有降低果酒酸度、提高果酒感官質量的作用,具有良好的應用前景。
【專利說明】一種果酒生物降酸新菌株、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌，尤其涉及一種果酒生物降酸新菌株、制備方法及其應用，命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum,已于2013年4月11日保藏在位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7462。
【背景技術】
[0002]在果酒釀造過程中，通常面臨著降酸問題，這是由生態(tài)條件、釀造原料的品種特性及栽培方式所決定的。對果酒而言，適量的有機酸可以賦予果酒醇厚感和清爽感，但是當果酒中的有機酸含量較高時，會給人以酸澀、粗糙的感覺，容易引起消費者的反感，因此已成為制約果酒產業(yè)進一步發(fā)展壯大的一個重要因素。通過果酒的生物降酸途徑來改善果酒品質是生產高品質果酒的關鍵技術，也是果酒生產必須解決的重要難題。
[0003]果酒降酸的途徑主要有物理法、化學法和生物法。目前果酒生產企業(yè)所用的降酸手段主要是化學方法，如堿中和、碳酸鈣沉淀等，在降酸的同時帶入諸多問題，如處理后的果酒的特征性風味消失，口感差，生物活性物質損失嚴重等。現代降酸工藝的研究和發(fā)展方向是生物降酸法，其典型代表是蘋果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)，即將蘋果酸分解形成酸感柔和的乳酸，該方法不僅降酸效果明顯，而且MLF過程還能提高果酒對微生物的穩(wěn)定性，改變酒中微量組分的含量和比例，改變呈香物質的濃度，有利于提高果酒的風味復雜性。
[0004]對于不同品種、不同產地、不同栽培方式的水果而言，其含有的有機酸的種類和濃度存在較大差異，但普遍都含有蘋果酸、檸檬酸和酒石酸，在釀造成為果酒后可能會嚴重影響果酒的口感。酒石酸一般可通過冷凍沉淀法去除，但蘋果酸和檸檬酸在冷凍條件下幾乎不沉淀，因此在實際生產中迫切需要的是能夠去除以上兩種有機酸、同時不影響其他營養(yǎng)成分的生物降酸法。具備分解蘋果酸和檸檬酸的能力，對酒質有增益作用，且符合食品衛(wèi)生標準的微生物主要是乳酸菌。乳 桿菌(Lactobacillus)、酒球菌(Oenococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)和片球菌(Pediococcus)的一些特殊的種經過分離、篩選、馴化可能會成為降解蘋果酸和檸檬酸的優(yōu)良菌株，在果酒生產中具有良好的應用前景。
[0005]現有的一些乳酸菌在分解蘋果酸的表現上較好，但是能同時高效地降解果酒中的檸檬酸和蘋果酸的菌株鮮有報道。此外，由于果酒較苛刻的生長條件，包括較低的PH環(huán)境、較高的酒精度、較高的SO2濃度、較低的生長溫度，導致很多從事生物降酸的乳酸菌生長困難或表現較差。因此，篩選獲得能迅速果酒的嚴苛環(huán)境，同時高效降解果酒中檸檬酸和蘋果酸的優(yōu)良乳酸菌株是生產優(yōu)質果酒必須要解決的一個關鍵問題。

【發(fā)明內容】

[0006]針對上述果酒中存在的問題和缺陷，本發(fā)明的目的是選育出一種能快速降解果酒中的有機酸、改善果酒口感的生物降酸新菌株、制備方法及其應用。
[0007]本發(fā)明涉及一種果酒生物降酸新菌株，是從自然發(fā)酵的櫻桃酒中獲得，具有在嚴格的酒體環(huán)境中生長和較高的分解蘋果酸和檸檬酸的能力，可在pH≥3.2、總SO2濃度≥100mg/L、酒精度≥13%的果酒中正常生長，命名為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum，于2013年4月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC N0.7462。
[0008]另外，本發(fā)明提供的果酒生物降酸新菌株來自于自然發(fā)酵的櫻桃酒中，經人工分離、篩選、馴化而得。
[0009]另外，本發(fā)明提供的果酒生物降酸新菌株在具有如下一個或多個條件的酒體內能正常生長:S02 含量 80±20mg/L，酒精度(v/v) 12±3%，ρΗ3.2±0.2，培養(yǎng)溫度 23±5°C。
[0010]其中，本發(fā)明提供的果酒生物降酸新菌株可在含120mg/L 302或13%酒精度且PH為3.0的酒體內正常生長，無需通過降低SO2 (≤60mg/L)或酒精含量(≤10%)及酸度(PH ^ 3.5)來改變酒體環(huán)境，既能保證果酒的發(fā)酵品質，又能達到生物降酸的效果。
[0011]另外，本發(fā)明提供的果酒生物降酸新菌株的發(fā)酵條件如下:培養(yǎng)基的組成:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、檸檬酸二銨2g/L、乙酸鈉5g/L、K2HP042g/L、MnS04.4Η200.25g/L、MgS04.7Η200.58g/L 和吐溫 _8(llmL/L，其余為水；培養(yǎng)溫度:28~370C ;培養(yǎng)時間:24~72h ;發(fā)酵起始pH:6.2~6.4。
[0012]本發(fā)明涉及一種果酒生物降酸新菌株的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)以新鮮的櫻桃果實為原料，經挑選、清洗、去梗去核、破碎等工藝，制成櫻桃果衆(zhòng)，而后添加果膠酶、SO2和活化的釀酒酵母,每升樓桃果衆(zhòng)添加30mg果膠酶、60mg SO2和300mg活化的釀酒酵母，并于23~28°C進行酒精發(fā)酵；酒精發(fā)酵結束后，6000轉/分離心15min除去釀酒酵母，而后進行自然二次發(fā)酵，得到樣品；監(jiān)測二次發(fā)酵過程中有機酸含量的變化，含量降低說明已進行生物降酸，所述有機酸包括蘋果酸和/或檸檬酸，選擇已進行生物降酸的樣品作為乳酸菌的分離源；
[0014](2)在無菌條件下,采用MRS瓊脂培養(yǎng)基中添加50mg/L放線菌酮和50mg/L萬古霉素對生物降酸菌株進行分離和篩選；
[0015]其中MRS瓊脂培養(yǎng)基的組成:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖 20g/L、檸檬酸二銨 2g/L、乙酸鈉 5g/L、K2HP042g/L、MnSO4.4Η200.25g/L、MgSO4.7H200.58g/L、吐溫_8(llmL/L以及水，培養(yǎng)基初始pH6.2，培養(yǎng)溫度32~35°C ；
[0016]細菌分離采用涂布法:取0.1mL經過自然降酸的櫻桃酒進行10倍梯度稀釋，梯度分別是?ο—1~10Λ涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)4~5d，菌落形成后，根據乳酸菌的菌落特征挑取可疑菌落鏡檢，通過平板劃線分離法反復分離純化，直到獲得純菌落。
[0017]本發(fā)明涉及一種果酒生物降酸新菌株的應用，本發(fā)明提供的果酒生物降酸新菌株可在含有蘋蘋果酸和檸檬酸的果酒中通過生長代謝，對果酒進行生物降酸，達到改善果酒酸澀口感、提高酒體柔和度的目的。
[0018]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的植物乳桿菌SGJ-24 (即果酒生物降酸新菌株)能夠很好的適應果酒酒體環(huán)境，能有效降低果酒中的蘋果酸和檸檬酸、增加揮發(fā)酯含量，從而使果酒口感更加柔和、協(xié)調，氣味芳香濃郁，為提高果酒品質奠定基礎。
【具體實施方式】
[0019]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。[0020]分別進行以下步驟已制備本發(fā)明的果酒生物降酸菌株:
[0021]A:果酒生物降酸菌株的分離[0022](I)以新鮮的櫻桃果實為原料，經挑選、清洗、去梗去核、破碎等工藝，制成櫻桃果衆(zhòng)，而后添加果膠酶、SO2和活化的釀酒酵母,每升樓桃果衆(zhòng)添加30mg果膠酶、60mg SO2和300mg活化的釀酒酵母，并于23~28°C進行酒精發(fā)酵；酒精發(fā)酵結束后，6000轉/分離心15min除去釀酒酵母，而后進行自然二次發(fā)酵，得到樣品；監(jiān)測二次發(fā)酵過程中有機酸含量的變化，含量降低說明已進行生物降酸，所述有機酸包括蘋果酸和/或檸檬酸，選擇已進行生物降酸的樣品作為乳酸菌的分離源；
[0023](2)在無菌條件下，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基中添加50mg/L放線菌酮和50mg/L萬古霉素對生物降酸菌株進行分離和篩選；
[0024]其中MRS瓊脂培養(yǎng)基的組成:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖 20g/L、檸檬酸二銨 2g/L、乙酸鈉 5g/L、K2HP042g/L、MnSO4.4Η200.25g/L、MgSO4.7H200.58g/L、吐溫_8(llmL/L以及水，培養(yǎng)基初始pH6.2，培養(yǎng)溫度32~35°C ；
[0025]細菌分離采用涂布法:取0.1mL經過自然降酸的櫻桃酒進行10倍梯度稀釋，梯度分別是?ο—1~10Λ涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)4~5d，菌落形成后，根據乳酸菌的菌落特征挑取可疑菌落鏡檢，通過平板劃線分離法反復分離純化，直到獲得純菌落，共獲得純菌株26株；
[0026]B.果酒生物降酸菌株的鑒定
[0027](I)挑選涂布平板上的單菌落，接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2d左右，將有產酸跡象的單菌落接種到乳酸菌培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征，研究生理生化變化，通過革蘭氏染色、吲哚試驗和接觸酶試驗等檢測技術，發(fā)現這些菌株均無芽孢、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性、硝酸鹽還原試驗陰性、不液化明膠、不產生硫化氫氣體、吲哚試驗陰性、無運動性、能在PH6.2的MRS液體培養(yǎng)基中生長發(fā)育，因此將該菌株初步鑒定為植物乳桿菌；
[0028](2)為了考查初選菌株分解有機酸的情況，進行有機酸分解試驗，在無菌條件下，用接種針挑取分離純化到的乳酸菌純菌落于5mL額外添加有機酸MRS液體培養(yǎng)基中進行生物降酸試驗，其中蘋果酸添加量為2g/L、檸檬酸添加量為lg/L，32°C靜置培養(yǎng)，每隔12h進行紙層析監(jiān)測，結果表明，10株乳酸菌的蘋果酸、檸檬酸層析點明顯減弱，乳酸層析點較大且清晰，即供試菌株能夠進行蘋果酸和檸檬酸發(fā)酵，對其編號后轉移至MRS斜面培養(yǎng)基上，并于4°C保藏，備用；
[0029]C.果酒生物降酸菌株的選育[0030]在無菌條件下，將分離得到的乳酸菌分別以107cfu/mL菌體量接種于5mL額外添加總濃度60~120mg/L的SO2、酒精度12%~15%以及pH為2.9~3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，32°C靜置培養(yǎng)，同時進行耐受18°C培養(yǎng)溫度的試驗，將所得數據進行統(tǒng)計分析，考察各菌落對二氧化硫、酒精、pH值、低溫的耐受性，其中SGJ-24的耐受性最強，在pH ( 3.2、總SO2濃度≥100mg/L、酒精度≥13%的模擬酒中能實現旺盛生長；
[0031]D.果酒生物降酸菌株的最終鑒定
[0032]將篩選到的具有降酸活性且能夠在較嚴格的酒體環(huán)境中進行旺盛生長的SGJ-24乳酸菌菌種進行糖發(fā)酵試驗鑒定，根據各菌株糖發(fā)酵反應結果，表明菌株SGJ-24為植物乳桿菌；為了進一步確定菌株SGJ-24的種屬，用細菌的16S rDNA通用引物從SGJ-24的基因組DNA中PCR擴增得到I條1479bp的條帶，將PCR擴增產物測序，獲得的序列進行同源序列檢索，結果顯示SGJ-24與Lactobacillus plantarum的16S rDNA序列同源性超過99%，因此，菌株SGJ-24在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學上屬于植物乳桿菌；該結果與生理生化鑒定結果相符，因此綜合形態(tài)特征觀察、生理生化試驗、分子生物學測序結果，最終確定SGJ-24菌株為植物乳桿菌，命名為Lactobacillus plantarum SGJ-24,簡稱SGJ-24。
[0033]對本發(fā)明果酒生物降酸新菌株SGJ-24的微生物特征，諸如形態(tài)學、生理生化、16rDNA序列測定和同源性分析，進行測定，結果如下:
[0034](I) SGJ-24的形態(tài)學和生理生化特征
[0035]表1乳酸菌菌株的形態(tài)學鑒定結果
[0036]
【權利要求】
1.一種果酒生物降酸新菌株，其特征在于，該菌株是乳桿菌屬的植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum,已保藏在位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7462。
2.根據權利要求1所述的果酒生物降酸新菌株，其特征在于，在具有如下一個或多個條件的酒體內能正常生長:302含量80±2011^/1，酒精度(￥八)12±3%，pH3.2±0.2，培養(yǎng)溫度 23±5°C。
3.根據權利要求1所述的果酒生物降酸新菌株，其特征在于，所述酒生物降酸菌株的發(fā)酵條件如下: 培養(yǎng)基的組成:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、檸檬酸二銨 2g/L、乙酸鈉 5g/L、K2HP042g/L、MnSO4.4Η200.25g/L、MgS04.7Η200.58g/L 和吐溫 _80lmL/L，其余為水； 培養(yǎng)溫度:28~37°C ;培養(yǎng)時間:24~72h ;發(fā)酵起始pH:6.2~6.4。
4.一種果酒生物降酸新菌株的制備方法，其特征在于，其制備方法包括以下步驟: (1)以新鮮的櫻桃果實為原料，經挑選、清洗、去梗去核、破碎等工藝，制成櫻桃果漿，而后添加果膠酶、SO2和活化的釀酒酵母,每升樓桃果衆(zhòng)添加30mg果膠酶、60mg SO2和300mg活化的釀酒酵母，并于23~28°C進行酒精發(fā)酵；酒精發(fā)酵結束后，6000轉/分離心15min除去釀酒酵母，而后進行自然二次發(fā)酵，得到樣品；監(jiān)測二次發(fā)酵過程中有機酸含量的變化，含量降低說明已進行生物降酸，所述有機酸包括蘋果酸和/或檸檬酸，選擇已進行生物降酸的樣品作為乳酸菌的分離源； (2)在無菌條件下，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基中添加50mg/L放線菌酮和50mg/L萬古霉素對生物降酸菌株進行分離和篩選； 其中MRS瓊脂培養(yǎng)基的組成:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、檸檬酸二銨 2g/L、乙酸鈉 5g/L、K2HP042g/L、MnSO4.4H200.25g/L、MgS04.7H200.58g/L、吐溫_8QlmL/L以及水，培養(yǎng)基初始pH6.2，培養(yǎng)溫度32~35°C ； 細菌分離采用涂布法:取0.1mL經過自然降酸的櫻桃酒進行10倍梯度稀釋，梯度分別是KT1~10_8，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)4~5d，菌落形成后，根據乳酸菌的菌落特征挑取可疑菌落鏡檢，通過平板劃線分離法反復分離純化，直到獲得純菌落。
5.一種如根據權利要求1至3任一項所述果酒生物降酸新菌株的應用，其特征在于，所述果酒生物降酸菌株能夠在含有蘋果酸和/或檸檬酸的果酒中進行生物降酸。
【文檔編號】C12G3/02GK103509734SQ201310219173
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年6月4日 優(yōu)先權日:2013年6月4日
【發(fā)明者】孫舒揚, 貢漢生, 姜文廣 申請人:魯東大學