一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體純化方法。該方法將待純化重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品上樣于平衡后的陽離子交換層析柱，經(jīng)洗滌、淋洗、再平衡后，洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液；待純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品的制備方法為：取整合了人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Protein?A親和層析，即得；淋洗為線性梯度洗脫；再平衡的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液。本發(fā)明通過淋洗步驟，成功提高了重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純度。
【專利說明】一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆 抗體的純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] WBP204(又名UBP1211)是重組人源抗人腫瘤壞死因子（hTNF-α )單克隆抗體，是一 種分子量約150kDa的蛋白質(zhì)分子，能有效拮抗人體內(nèi)的hTNF-a，用于治療由于hTNF-a異 常表達(dá)造成的多種免疫疾病。目前對其制備通常是通過真核細(xì)胞表達(dá)后經(jīng)純化而得，但是， 在真核細(xì)胞表達(dá)過程中，DNA經(jīng)翻譯表達(dá)成為蛋白質(zhì)后的會進(jìn)行如糖基化、氧化、脫氨基、磷 酸化、N端焦谷氨酸化及C端賴氨酸切除反應(yīng)等修飾，這些修飾過程會引起單克隆抗體的表 面電荷不均一性。單克隆抗體表面電荷不均一性成分的產(chǎn)生會影響單克隆抗體功能、體內(nèi) 代謝及樣品穩(wěn)定性，因此，在單克隆抗體藥物工藝開發(fā)中，表面電荷的均一性控制已經(jīng)成為 樣品制備和質(zhì)量考察的一個重要指標(biāo)。
[0003] 按照抗體蛋白分子攜帶電荷的不同，通常將其分為三個部分，即酸性組分、主要組 分和堿性組分。利用CEX-HPLC (離子高效液相層析）對WBP204電荷不均一性的組分進(jìn)行 分析，在層析圖譜上，含量最高的活性成分為主要組分（main peak)，主要組分之前的一些 雜質(zhì)統(tǒng)稱為酸性組分（acidic region),主要組分之后的統(tǒng)稱為堿性組分（basic region)。 酸性組分及堿性組分是主要組分在生產(chǎn)過程中受環(huán)境影響使氨基酸分子或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 而產(chǎn)生的。天冬酰胺向天冬氨酸的轉(zhuǎn)變、谷氨酰胺的環(huán)化、唾液酸化程度增加等都會使酸性 組分的含量提高。在細(xì)胞培養(yǎng)和純化階段，WBP204抗體蛋白的C端賴氨酸異構(gòu)化和糖基修 飾等因素造成一些抗體蛋白異構(gòu)體產(chǎn)生，使抗體蛋白的酸性組分產(chǎn)生，對產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生 影響，因此在生產(chǎn)過程中需要加以去除。WBP204的酸性組分作為WBP204正?？贵w分子的異 構(gòu)體，其生物活性也有別于WBP204正常的抗體分子，因此在WBP204抗體蛋白的制備過程中 要盡可能的加以去除。
[0004] 然而，WBP204的酸性組分和WBP204正?？贵w分子有著極其相似的理化性質(zhì)，通常 難以去除傳統(tǒng)的純化生產(chǎn)工藝中，陽離子交換層析可以利用兩者間的等電點(diǎn)的區(qū)別加以分 離，較其他的純化方法有更好的分離效果。但利用陽離子層析分離去除WBP204抗體蛋白中 的酸性組分效果一般，不能滿足生產(chǎn)實(shí)際的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單 克隆抗體的純化方法，本發(fā)明提供的方法降低了純化后重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆 抗體中的酸性組分含量，提高了抗體蛋白的純度。
[0006] 本發(fā)明提供了一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法，包括以下 步驟：將待純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品上樣于平衡后的陽離子交換 層析柱，經(jīng)洗滌、淋洗、再平衡后，洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗 體溶液；
[0007] 待純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品的制備方法為：取整合了人 源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上 清液，采用Protein A親和層析，即得；
[0008] 淋洗為線性梯度洗脫，淋洗采用的淋洗液為A液與B液的混合液，其中A液的體積 分?jǐn)?shù)逐漸降低；
[0009] 再平衡的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液；
[0010] A液為含有NaCl的緩沖液；緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液， 其中，A液中NaCl的摩爾體積濃度為50mmol/L?100mmol/L ；
[0011] B液為含有NaCl的第二緩沖液；第二緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷 酸緩沖液，其中，B液中NaCl的摩爾體積濃度為80mmol/L?140mmol/L。
[0012] 待純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品中，WBP204抗體蛋白的C端 賴氨酸異構(gòu)化和糖基修飾等因素造成部分抗體蛋白異構(gòu)體產(chǎn)生，使抗體蛋白的酸性組分產(chǎn) 生，與WBP204的正?？贵w分子相比，WBP204酸堿性組分對陽離子交換層析柱的結(jié)合能力不 同，所以遷移速率不同。因此，用含有NaCl的淋洗液進(jìn)行淋洗，便使樣品中的WBP204酸堿 性組分與WBP204的正常抗體在層析過程中的產(chǎn)生差別，形成組分富集帶。在將酸性雜質(zhì)去 掉以后，用平衡液重新固定區(qū)帶，再進(jìn)行產(chǎn)品洗脫。待純化的人源抗人腫瘤壞死因子單克隆 抗體樣品中正?？贵w組分在全部抗體中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為38%?46%，酸性抗體組分在全 部抗體中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常為32%?35%。因此，本發(fā)明通過淋洗步驟，成功提高了 WBP204正 ?？贵w的純度。
[0013] 作為優(yōu)選，線性梯度洗脫的淋洗液中A液與B液的體積分?jǐn)?shù)比為90% :10% - 28% : 72%。
[0014] 淋洗對溶液電導(dǎo)值、純化溫度、層析柱柱效敏感，用兩種濃度的淋洗液保證去除酸 性抗體峰效果的穩(wěn)定性。淋洗采用的方式為線性梯度洗脫，淋洗液為A液與B液的混合液， 其中，A液為低鹽緩沖液，B液為高鹽緩沖液。淋洗過程中，A液的體積分?jǐn)?shù)逐漸減少，B液 的體積分?jǐn)?shù)逐漸增多，淋洗液的鹽濃度逐漸升高。淋洗液中A液與B液初始體積比為9:1， 最終體積比為7:18,淋洗效果較好。
[0015] 優(yōu)選的，A液采用含有NaCl的磷酸緩沖液。
[0016] 更優(yōu)選的，A液中NaCl的摩爾體積濃度為87. 5mmol/L，磷酸根離子的濃度為 20mmol/L ?80mmol/L，pH 值為 5. 8 ?6. 6。
[0017] 最優(yōu)選的，A液中NaCl的摩爾體積濃度為87. 5mmol/L，磷酸根離子的濃度為 50mmol/L, pH 值為 5. 8 ?6. 6。
[0018] 優(yōu)選的，B液采用含有NaCl的磷酸緩沖液。
[0019] 更優(yōu)選的，B液中NaCl的摩爾體積濃度為112. 5mmol/L，磷酸根離子的濃度為 20mmol/L ?80mmol/L，pH 值為 5. 8 ?6. 6。
[0020] 最優(yōu)選的，B液中NaCl的摩爾體積濃度為112. 5mmol/L，磷酸根離子的濃度為 50mmol/L, pH 值為 5. 8 ?6. 6。
[0021] 作為優(yōu)選，淋洗液的pH值為5. 8?6. 6。
[0022] 作為優(yōu)選，淋洗液的用量為12倍柱體積。
[0023] 作為優(yōu)選，再平衡的緩沖液為磷酸緩沖液。
[0024] 優(yōu)選的，再平衡緩沖液采用的磷酸緩沖液的pH值為5. 8?6. 6。
[0025] 優(yōu)選的，再平衡緩沖液采用的磷酸緩沖液磷酸根離子的濃度為20mmol/L? 80mmol/L〇
[0026] 更優(yōu)選的，再平衡緩沖液采用的磷酸緩沖液的pH值為6. 2,磷酸根離子的濃度為 50mmol/L〇
[0027] 作為優(yōu)選，再平衡緩沖液的用量為5倍柱體積。
[0028] 作為優(yōu)選，洗脫的緩沖液為含有NaCl的緩沖液；緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸 緩沖液或磷酸緩沖液。
[0029] 優(yōu)選的，洗脫的緩沖液中采用含有NaCl的磷酸緩沖液。
[0030] 更優(yōu)選的，洗脫的緩沖液中NaCl的摩爾體積濃度為70mmol/L?110mmol/L。
[0031] 更優(yōu)選的，洗脫的緩沖液的pH值為6. 4?7. 2。
[0032] 最優(yōu)選的，洗脫的緩沖液中NaCl的摩爾體積濃度為90mmol/L。
[0033] 最優(yōu)選的，洗脫的緩沖液的pH值為6. 8。
[0034] 作為優(yōu)選，平衡的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液和磷酸緩沖液。
[0035] 優(yōu)選的，平衡的緩沖液為磷酸緩沖液。
[0036] 更優(yōu)選的，平衡采用的磷酸緩沖液中，磷酸根離子的濃度為20?80mmol/L，pH值 為 5. 8 ?6. 6。
[0037] 最優(yōu)選的，平衡采用的磷酸緩沖液中，磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為 6. 2〇
[0038] 作為優(yōu)選，洗滌的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液和磷酸緩沖液。
[0039] 優(yōu)選的，洗滌的緩沖液為磷酸緩沖液。
[0040] 更優(yōu)選的，洗滌采用的磷酸緩沖液中，磷酸根離子的摩爾體積濃度為20mmol/L? 80mmol/L, pH 值為 5. 8 ?6. 6。
[0041] 最優(yōu)選的，洗滌采用的磷酸緩沖液中，磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為 6. 2〇
[0042] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的純化方法中陽離子交換層析柱的填料為P0R0SXS。
[0043] 一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法，將待純化的重組人源抗 人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品上樣于平衡后的陽離子交換層析柱，經(jīng)洗滌、淋洗、再平衡 后，洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液；待純化的重組人源抗 人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品的制備方法為：取整合了人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗 體基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Protein A親和層析，即 得；淋洗為線性梯度洗脫，淋洗采用的淋洗液為A液與B液的混合液，其中A液的體積分?jǐn)?shù) 逐漸降低；再平衡的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液；A液為含有NaCl 的緩沖液；緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液，其中，A液中NaCl的摩爾 體積濃度為50mmol/L?100mm 〇l/L ;B液為含有NaCl的第二緩沖液；第二緩沖液選自檸 檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液，其中，B液中NaCl的摩爾體積濃度為80mmol/L? 140mmol/L。本發(fā)明通過在純化方法中增加中間淋洗步驟，使樣品中的WBP204酸堿性組 分與WBP204的正?？贵w在層析過程中的產(chǎn)生差別，形成組分富集帶。在將酸性雜質(zhì)去掉 以后，用平衡液重新固定區(qū)帶，再進(jìn)行產(chǎn)品洗脫。因此，本發(fā)明通過淋洗步驟，成功提高了 WBP204抗體的純度。采用CEX-HPLC檢測結(jié)果表明：采用本發(fā)明提供的方法純化的WBP204 抗體中，WBP204的正?？贵w的含量以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)為85. 24%，較現(xiàn)有技術(shù)提高了 24%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1示本發(fā)明實(shí)施例1提供方法純化重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體純化 過程監(jiān)測譜圖；線1示淋洗下來的酸性雜質(zhì)的檢測曲線，線2示洗脫收獲目的產(chǎn)物的檢測曲 線。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 本發(fā)明提供了一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和 改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及 應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍 內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0046] 本發(fā)明采用的試劑皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0047] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0048] 實(shí)施例1采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的 純化
[0049] 采用P0R0S XS填充陽離子交換層析柱；
[0050] 采用磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 2的磷酸緩沖液平衡柱子；
[0051] 將質(zhì)量體積濃度為27. 3mg/mL的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體上樣至 平衡后的陽離子交換層析柱；
[0052] 采用磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 2的磷酸緩沖液洗滌上樣后的陽離 子交換層析柱；
[0053] 采用12倍柱體積的淋洗液對洗滌后的陽離子交換層析柱進(jìn)行淋洗，淋洗液中：
[0054] A液為磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 2,含有87. 5mmol/LNaCl的磷酸 緩沖液；
[0055] B液為磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 2,含有112. 5mmol/LNaCl的磷酸 緩沖液；
[0056] 淋洗液中A液與B液的初始體積比為9:1，線性梯度洗脫過程中，A液體積分?jǐn)?shù)逐 漸減少直至A液與B液的初始體積比為7:18,結(jié)束淋洗。
[0057] 采用5倍柱體積的磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 2的磷酸緩沖液對柱 子進(jìn)行再平衡；
[0058] 采用磷酸根離子的濃度為50mmol/L，pH值為6. 8,含有90mmol/L NaCl的磷酸緩 沖液進(jìn)行洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液。
[0059] 實(shí)施例2采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的 純化
[0060] 采用P0R0S XS填充陽離子交換層析柱；
[0061] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為5. 8的磷酸緩沖液平衡柱子；
[0062] 將質(zhì)量體積濃度為27. 3mg/mL的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體上樣至 平衡后的陽離子交換層析柱；
[0063] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為5. 8的磷酸緩沖液洗滌上樣后的陽離 子交換層析柱；
[0064] 采用12倍柱體積的淋洗液對洗滌后的陽離子交換層析柱進(jìn)行淋洗，淋洗液中：
[0065] A液為磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為5. 8,含有50mmol/L NaCl的磷酸緩 沖液；
[0066] B液為磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為5. 8,含有80mmol/L NaCl的磷酸緩 沖液；
[0067] 淋洗液中A液與B液的初始體積比為9:1，線性梯度洗脫過程中，A液體積分?jǐn)?shù)逐 漸減少直至A液與B液的初始體積比為7:18,結(jié)束淋洗。
[0068] 采用5倍柱體積的磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為5. 8的磷酸緩沖液對柱 子進(jìn)行再平衡；
[0069] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為6. 4,含有70mmol/L NaCl的磷酸緩 沖液進(jìn)行洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液。
[0070] 實(shí)施例3采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的 純化
[0071] 采用P0R0S XS填充陽離子交換層析柱；
[0072] 采用磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為6. 6的磷酸緩沖液平衡柱子；
[0073] 將質(zhì)量體積濃度為27. 3mg/mL的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體上樣至 平衡后的陽離子交換層析柱；
[0074] 采用磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為6. 6的磷酸緩沖液洗滌上樣后的陽離 子交換層析柱；
[0075] 采用12倍柱體積的淋洗液對洗滌后的陽離子交換層析柱進(jìn)行淋洗，淋洗液中：
[0076] A液為磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為6. 6,含有100mmol/L NaCl的磷酸 緩沖液；
[0077] B液為磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為6. 6,含有140mmol/L NaCl的磷酸 緩沖液；
[0078] 淋洗液中A液與B液的初始體積比為9:1，線性梯度洗脫過程中，A液體積分?jǐn)?shù)逐 漸減少直至A液與B液的初始體積比為7:18,結(jié)束淋洗。
[0079] 采用5倍柱體積的磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為6. 6的磷酸緩沖液對柱 子進(jìn)行再平衡；
[0080] 采用磷酸根離子的濃度為80mmol/L，pH值為7. 2,含有110mm〇l/L NaCl的磷酸緩 沖液進(jìn)行洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液。
[0081] 實(shí)施例4采用CEX-HPLC對采用本發(fā)明提供的方法純化的重組人源抗人腫瘤壞死 因子單克隆抗體檢測
[0082] 采用CEX-HPLC對實(shí)施例1、2和3中的方法純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單 克隆抗體檢測，檢測結(jié)果如表1所示：
[0083] 表1本發(fā)明實(shí)施例純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體檢測結(jié)果
[0084] 實(shí)施例序號|WBP204酸性組分含量|WBP204堿性組分含量|正常WBP204含量 ? 13.63% 0.83% 85. 54% 2 16.82% 0.81% 82. 37% 3 16.47% 0.84% 82.69%
[0085] 對本發(fā)明實(shí)施例1提供方法純化重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體過程監(jiān) 測的譜圖如圖1所示。如圖1可知，在層析體積在300?470mL的范圍內(nèi)，酸性組分大量被 洗脫下來，此過程為淋洗步驟；而層析體積在550?590mL范圍內(nèi)，正常抗體被大量洗脫，此 過程為洗脫步驟。
[0086] 比較例1采用現(xiàn)有方法進(jìn)行重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化
[0087] 采用P0R0S XS填充陽離子交換層析柱；
[0088] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0的磷酸緩沖液平衡柱子；
[0089] 將質(zhì)量體積濃度為27. 3mg/mL的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體上樣至 平衡后的陽離子交換層析柱；
[0090] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0的磷酸緩沖液洗滌上樣后的陽離 子交換層析柱；
[0091] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0,含有l(wèi)mol/L NaCl的磷酸緩沖 液20倍柱體積進(jìn)行洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液。
[0092] 比較例2采用現(xiàn)有方法進(jìn)行重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化
[0093] 采用P0R0S XS填充陽離子交換層析柱；
[0094] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0的磷酸緩沖液平衡柱子；
[0095] 將質(zhì)量體積濃度為27. 3mg/mL的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體上樣至 平衡后的陽離子交換層析柱；
[0096] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0的磷酸緩沖液洗滌上樣后的陽離 子交換層析柱；
[0097] 采用磷酸根離子的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0,逐漸增加鹽濃度至磷酸根離子 的濃度為20mmol/L，pH值為7. 0,含有l(wèi)mol/L NaCl的磷酸緩沖液，進(jìn)行連續(xù)線性鹽梯度 洗脫，洗脫液用量為20倍柱體積，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶 液。
[0098] 比較例3采用CEX-HPLC對采用現(xiàn)有方法純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克 隆抗體檢測
[0099] 采用CEX-HPLC對比較例1和2中的方法純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克 隆抗體檢測，檢測結(jié)果如表2所示：
[0100] 表2本發(fā)明實(shí)施例純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體檢測結(jié)果
[0101] 比較例序號|WBP204酸性組分含量 |WBP204堿性組分含量 |正常WBP204含量 ? 30.9% 0. 75% 68. 35% 2 29.4% 0.82% 69. 78%
[0102] 比較例1和2中提供的是傳統(tǒng)的陽離子層析純化方法，不包括淋洗和再平衡的步 驟，獲得的抗體蛋白純度較低。而實(shí)施例1、2和3中通過增加淋洗步驟，有效去除酸性雜質(zhì)， 使目的蛋白純度增加24%。
[0103] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體的純化方法，其特征在于，將待純化的 重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品上樣于平衡后的陽離子交換層析柱，經(jīng)洗滌、 淋洗、再平衡后，洗脫，得到純化后的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體溶液； 所述待純化的重組人源抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體樣品的制備方法為：整合了人源 抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清 液，采用Protein A親和層析，即得； 所述淋洗為線性梯度洗脫，所述淋洗采用的淋洗液為A液與B液的混合液，其中A液的 體積分?jǐn)?shù)逐漸降低； 所述再平衡的緩沖液為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩沖液； 所述A液為含有NaCl的緩沖液；所述緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液或磷酸緩 沖液，其中，所述A液中NaCl的摩爾體積濃度為50mmol/L?100mmol/L ; 所述B液為含有NaCl的第二緩沖液；所述第二緩沖液選自檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液 或磷酸緩沖液，其中，所述B液中NaCl的摩爾體積濃度為80mmol/L?140mmol/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述線性梯度洗脫的淋洗液中所述A 液與所述B液的體積分?jǐn)?shù)比為90% :10% - 28% :72%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述淋洗液的pH值為5. 8?6. 6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述再平衡的緩沖液的pH值為 5. 8 ?6. 6〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液的pH值為6. 4? 7. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液中NaCl的摩爾體積 濃度為 70nun〇l/L ?110mmol/L〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述平衡的緩沖液的pH值為5. 8? 6. 6〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述洗滌的緩沖液的pH值為5. 8? 6. 6〇
【文檔編號】C12P21/08GK104098697SQ201310129636
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月15日
【發(fā)明者】沈克強(qiáng), 陳智勝, 魯錢達(dá), 朱建, 王威 申請人:上海眾合醫(yī)藥科技有限公司, 無錫藥明康德生物技術(shù)有限公司