專利名稱：針對腫瘤壞死因子α的改進的納米體^TM的制作方法
針對腫瘤壞死因子α的改進的納米體 本申請是國際申請日為2006年5月17日，國際申請?zhí)枮镻CT/EP2006/004678，進入中國的日期為2008年I月8日，中國申請?zhí)枮?00680026278.X，發(fā)明名稱為“針對腫瘤壞死因子α的改進的納米體 ”的分案申請。本發(fā)明涉及針對腫瘤壞死因子a (TNF- α )的改進的納米體 (Nanobodies )，以及包括或者基本上由一種或多種所述納米體組成的多肽。[注意:Nanobody ,Nanobodies 和 Nanoclone 為 Ablynx N.V.的商標]本發(fā)明還涉及編碼所述納米體和多肽的核酸；涉及制備所述納米體和多肽的方法；涉及表達或者能夠表達所述納米體和多肽的宿主細胞；涉及包括所述納米體、多肽、核酸或宿主細胞的組合物；并且涉及所述納米體、所述多肽、所述核酸、所述宿主細胞或所述組合物的應用，特別是用于預防、治療或診斷目的，諸如下文提及的預防、治療或診斷目的。本發(fā)明的其它方面、實施方案、優(yōu)點和應用將通過下文的進一步描述而變得清楚。申請人:的W O 04/041862涉及針對TNF-α的納米體，并且涉及它的制備和應用，特別是用于預防和/或治療與TNF-α相關和/或受TNF-α調控的疾病和紊亂，諸如炎癥、類風濕性關節(jié)炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸炎綜合征、多發(fā)性硬化病、艾迪生病、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病、急性熱病性多神經炎、橋本病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、男性不育、多發(fā)性硬化病、重癥肌無力、天皰瘡、銀屑病、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、和脈管炎。按照WO 04/041862的抗-TNF納米體可以被人源化，并且可以是單價或多價的，其中后者導致對TNF的增加的親和力。按照WO 04/041862的抗-TNF納米體 還可以是多特異性的，并且特別可以是多特異性構建體的形式，其包括針對TNF的兩個或多個納米體和針對血清蛋白諸如人血清白蛋白的另一個納米體，這在體內導致增加的半衰期。WO 04/041862還涉及制備抗-TNF納米體的方法，涉及編碼抗-TNF納米體的核酸或構建體，以及涉及包括所述抗-TNF納米體的藥物組合物，所述藥物組合物可以適用于靜脈內、皮下、口服、舌下、局部、鼻內、陰道內或直腸給藥，或者適用于通過吸入給藥。按照WO04/041862的抗-TNF納米體還可以用于診斷目的,任選地以成分試劑盒(kit_of-parts)形式。EP O 486 526描述了針對TNF特定表位的TNF-α結合配體。在所述結合配體中，提及單結構域抗體(“dAbs”)。Reiter 等.，J.Mol.Biol (分子生物學雜志).(1999)，290，685-698 描述了從隨機化噬菌體展示文庫獲得的針對TNF- α的單結構域抗體，其從小鼠雜交瘤起始于VH結構域支架而產生。WO 00/29004描述了針對TNF-α的鼠單結構域抗體(“微體(microbodies)”)。WO 04/003019尤其描述了這樣的配體，S卩，其包括針對TNF-α的第一結合結構域，和針對血清蛋白諸如血清白蛋白的第二結合結構域。本發(fā)明的一般目的是提供針對TNF-a的納米體，特別是針對人TNF-a的納米體。
具體地，本發(fā)明的一個目的是提供針對TNF-α的納米體，特別是針對人TNF-α的納米體，并且提供包括所述納米體的蛋白或多肽，其適用于治療和/或診斷應用，并且特別用于預防、治療和/或診斷與TNF- α相關的和/或受之調控的諸如那些上文提及的一種或多種疾病和紊亂，和/或其可以用于制備預防和/或治療與TNF- α相關的和/或受之調控的諸如上文提及的那些一種或多種疾病的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明的目的是提供針對TNF- α的納米體，并且提供包括所述納米體的蛋白和多肽，其為WO 04/041862所述的針對TNF-α的納米體和多肽的備選物，和/或與WO 04/041862所述的針對TNF-α的納米體和多肽相比，其具有一種或多種改進的性能或特性。更具體地，本發(fā)明的一個目的是提供針對TNF- α的納米體，并且提供包括所述納米體的蛋白和多肽，與WO 04/041862所述的針對TNF-α的納米體和多肽相比，其是改進的，具有下列一種或多種改進的性能或特性:-增加的對于TNF-α的親和力，以單價形式，以多價形式(例如以二價形式)和/或多特異性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特異性形式的一種)；-更好的適用性，適用于以多價形式(例如，以二價形式)設計；-更好的適用性，適用于以多特異性形式(例如，WO04/041862或下文所述的多特異性形式的一種)設計；-對于“人源化”取代(如本文定義那樣)的提高的適用性或敏感性；和/ 或-更低的免疫原性，以單價形式，以多價形式(例如以二價形式)和/或以多價形式的多特異性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特異性形式的一種)；-增加的穩(wěn)定性，以單價形式，以多價形式(例如以二價形式)和/或以多價形式的多特異性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特異性形式的一種)；-增加的針對TNF-α的特異性，以單價形式，以多價形式(例如以二價形式)和/或以多價形式的多特異性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特異性形式的一種)；-減小的或在需要的情形中增加的與來自不同物種的TNF-α的交叉反應性；和/ 或-一種或多種適于醫(yī)藥應用(包括預防應用和/或治療應用)和/或診斷應用(包括但不限于成像目的的應用)的其它改進的特性，以單價形式，以多價形式(例如以二價形式)和/或以多特異性形式(例如，WO 04/041862中或下文所述的多特異性形式的一種)。這些目的通過本文所述的納米體、蛋白和多肽而實現。這些納米體在本文中還叫作“本發(fā)明的納米體(Nanobodies of the invention) ” ；并且這些蛋白和多肽在本文中還籠統(tǒng)地叫作“本發(fā)明的多肽(polypeptides of the invention)”。由于本文所述的納米體和多肽主要意欲用于治療和/或診斷應用，所以它們是針對(如本文所定義的那樣)人TNF-α的。然而，不排除(但也不需要)本文所述的納米體和多肽表現出與來自一種或多種其它溫血動物物種的TNF-α交叉反應，例如與來自一種或多種其它靈長類物種的TNF- α交叉反 應，和/或與來自通常用作疾病動物模型的一種或多種動物物種(例如小鼠、大鼠、兔、豬或狗)特別是與TNF-α相關的疾病和紊亂的動物模型的物種(諸如本文提及的物種和動物模型)的TNF-α交叉反應。在這方面，對于有經驗的技術人員應該清楚，由于這允許針對人TNF-α的納米體和多肽可以在這樣的疾病模型中進行檢驗，所以，從藥物開發(fā)的觀點來看，所述交叉反應性，當存在時，可能是有優(yōu)點的。在其最廣泛的意義上，本發(fā)明也沒有特別局限于或者由本發(fā)明的納米體和多肽所針對的TNF-α的特異性抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象(當適用時)而定義。然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本文所述的納米體、蛋白或多肽針對和/或可以結合TNF- α的表位，其位于和/或形成部分TNF受體結合位點(例如，TNF-RI，THF-RII的結合位點，也叫作Ρ55或ρ75)。正如本領域公知的那樣，TNF三聚體包括3個受體結合位點，其基本上是等價的，并且其由/在位于TNF三聚體內的2個TNF單體的接觸面上形成。例如，本文所述的納米體、蛋白或多肽優(yōu)選地針對和/或可以結合TNF-α的表位，其包括下列TNF- α的氨基酸殘基:位置88的Gln，位置90的LysJP /或位置146的Glu。特別地，本文所述的納米體、蛋白或多肽針對和/或可以結合TNF-α三聚體的表位，其位于和/或形成部分TNF受體結合位點。例如，本文所述的納米體、蛋白或多肽可以針對和/或可以結合TNF-a三聚體的表位，其包括下列氨基酸殘基:第一個TNF單體(本文叫作“單體A”)上位置88的Gln，和位置90的Lys，以及第二個TNF單體(本文叫作“單體B”)上位置146的Glu (其中單體A和單體B在TNF三聚體中一起形成TNF受體結合位點)。更具體地，本文所述的納米體、蛋白或多肽針對和/或可以結合TNF-a三聚體的表位，其包括上文提及的氨基酸(單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu)，并且另外包括TNF- a單體A的下列氨基酸殘基的至少一個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的He，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置97的He，位置131的Arg，位置1 35的Glu，位置136的He，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp和單體B中的下列殘基:位置20的Pro，位置32的Arg，位置65的Lys，位置112的Lys，位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。備選地，本文所述的納米體、蛋白或多肽針對和/或可以結合TNF-α的表位，其包括上文提及的氨基酸(單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu)，并且另外包括TNF- α單體A的下列氨基酸殘基的至少一個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置75的Leu，位置77的Thrdi置79的Thr，位置80的He，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的He，位置135的Glu，位置136的He，位置137的Asn以及單體B的下列殘基:位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser。所述表位可以通過與TNF分子復合結晶的納米體的結構分析，或者通過其它途徑諸如通過肽掃描分析進行的表位繪圖而進行描繪。通過比較，從結晶數據(未顯示)可以看出WO 04/041862的納米體3E結合與本發(fā)明優(yōu)選的表位不同的表位(即，包括位置141的Tyr，位置140的Asp，位置67的GlnJi置24的Gly和位置23的Glu的表位)。因此，另一方面，本發(fā)明涉及免疫球蛋白可變結構域(或其適當的部分)，其可以結合位于和/或形成部分TNF受體結合位點的TNF-α的表位，并且優(yōu)選地結合這樣的表位，即，所述表位包括下列TNF-α氨基酸殘基中的至少I個、優(yōu)選地2個或多個、并且優(yōu)選地全部:位置88的Gln ;位置90的Lys和位置146的Glu。這樣的免疫球蛋白可變結構域優(yōu)選地是重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域，并且特別是重鏈可變結構域，其可以是任何哺乳動物的重鏈可變結構域，包括但不限于人重鏈可變結構域、小鼠重鏈可變結構域和駱駝科(Camelid)重鏈可變結構域(諸如駱駝科4_鏈免疫球蛋白的重鏈可變結構域或所謂的重鏈抗體的重鏈可變結構域(VHH結構域))。所述免疫球蛋白可變結構域優(yōu)選地是結構域抗體或單結構域抗體或者適于用作(單)結構域抗體。最優(yōu)選地，所述免疫球蛋白可變結構域是納米體(如本文定義的那樣)，并且適合用于本發(fā)明這一方面的納米體的一些優(yōu)選的但非限制性的實例是PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO:52)和 PMP5F10 (TNF3，SEQ ID NO:60),以及其人源化的和其它變體(如本文進一步所述的那樣)。關于納米體，前述免疫球蛋白可變結構域還可以是本文所述的人源化的(作為舉例，并沒有限制)。本發(fā)明還涉及包括或者基本上由這樣的免疫球蛋白可變結構域組成的蛋白和多肽，例如，其可以如本文定義的那樣。備選地，這樣的可變結構域可以形成部分ScFv構建體、雙特異性構建體、嵌合抗體或抗體結構以及其它免疫球蛋白構建體，例如，Hoogenboom(Nature Biotechnology (自然生物學技術)(1997), 15: 125-126)綜述的那些。然而，優(yōu)選地，針對上述表位的免疫球蛋白可變結構域是納米體，在這種情形中，包括這樣的納米體的蛋白和多肽可以在本文中進一步描述。因此，本發(fā)明的一些優(yōu)選的方面涉及:I)針對TNF- α三聚體上相同的表位的納米體，納米體TNFl (SEQ ID NO:52)。II)針對TNF- α三聚體上相同的表位的納米體，納米體TNF3 (SEQ ID NO:60)。III)針對TNF- α三聚體的表位的納米體，所述表位至少包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu。IV)針對TNF- α三聚體的表位的`納米體，所述表位包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu ;并且其還包括至少包括TNF-α單體A下列氨基酸殘基中的至少I個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的He，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置97的He，位置131的Arg，位置135的Glu，位置136的He，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp和單體B中的下列殘基:位置20的Pro,位置32的Arg,位置65的Lys,位置112的Lys,位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。V)針對TNF- α三聚體的表位的納米體，所述表位包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu ;并且其還包括TNF- α單體A下列氨基酸殘基中的至少I個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置80的Πθ，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的He，位置135的Glu，位置136的He，位置137的Asn以及單體B的下列殘基 位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser
-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其具有這樣的關于TNF的Ktjff速率:好于
2.10_3(l/s)，優(yōu)選地好于 1.10_3。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在WO 04/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于WO 04/041862中納米體VHH3E(SEQ ID N0:4)在相同檢測中的EC50值；或者所述納米體的人源化變體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在WO 04/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于12nM ;或者所述納米體的人源化變體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在WO 04/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于5nM ;或者所述納米體的人源化變體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在WO 04/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于3nM ;或者所述納米體的人源化變體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為人源化的納米體。并且本實施方案的一些優(yōu)選的方面涉及:-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為GLEW-類納米體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為人源化的GLEW-類納米體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在位置103含有精氨酸殘基(R)。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在位置103含有精氨酸殘基(R)，并且其是人源化的。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為GLEW-類納米體，并且其在位置103含有精氨酸殘基(R)，并且其是人源化的。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其在位置108含有亮氨酸殘基(L)。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其與氨基酸序列SEQID NO’ s 52 (TNFl)，76 (TNF13)，77 (TNF14)，95 (TNF29)或 96 (TNF30)之一具有至少 80%、優(yōu)選地至少 90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文定義)。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中a) CDRl 包括:-氨基酸序列DYWMY;或-與氨基酸序列DYWMY有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列DYWMY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；和b) CDR2 包括:-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或

-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；
以及c) CDR3 包括:-氨基酸序列SPSGFN;或-與氨基酸序列SPSGFN有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SPSGFN有2個或只有I個氨 基酸差異的氨基酸序列。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中:-⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY;并且⑶R3包括氨基酸序列SPSGFN ;或-⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY;并且⑶R2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-⑶R2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG;并且⑶R3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY ;并且⑶R3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl包括氨基酸序列DYWMYKDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中a) CDRl 為:-氨基酸序列DYWMY;或-與氨基酸序列DYWMY有至少80%、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列DYWMY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且其中:b) CDR2 為:-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；以及其中:c) CDR3 為:-氨基酸序列SPSGFN;或-與氨基酸序列SPSGFN有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SPSGFN有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl是氨基酸序列DYWMY。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。
-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R3是氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中:-⑶Rl是氨基酸序列DYWMY；并且⑶R3是氨基酸序列SPSGFN ；或-⑶Rl是氨基酸序列DYWMY;并且⑶R2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl是氨基酸序列DYWMY;并且⑶R3是氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl是氨基酸序列DYWMYKDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中-任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代；和/或-與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。并且本實施方案的一些優(yōu)選的方面涉及:-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為KERE-類納米體。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其為人源化的KERE-類納米體。-按照上述I)-V)中·任一項的納米體，其與氨基酸序列SEQID NO’ s 50 (TNF3)，83 (TNF20)，85 (TNF21)，85 (TNF22)，96 (TNF23)或 98 (TNF33)之一具有至少 80 %、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中a) CDRl 為:-氨基酸序列NYYMG；或-與氨基酸序列NYYMG有至少80%、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列NYYMG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且b)CDR2 為:-氨基酸序列NI SWRGYNIYYKDSVKG ;或-與氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列NISWRGYNI YYKDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；以及c)CDR3 為:-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl是氨基酸序列NYYMG。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶R3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中:-⑶Rl是氨基酸序列NYYMG;并且⑶R3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-CDRl是氨基酸序列NYYMG ;并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG ;或-CDR2是氨基酸序列NI SWRGYNI YYKDSVKG ；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中⑶Rl是氨基酸序列NYYMGKDR2是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY并且CDR3是氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY。-按照上述I)-V)中任一項的納米體，其中-任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代；和/或-與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。并且仍有一些其它特別優(yōu)選的方面為:VI)蛋白或多肽，其包括或者基本上由按照上述I)-V)中任一項的納米體組成。VII)蛋白或多肽，其 包括或者基本上由至少一種按照上述I)-V)中任一項的納米體組成。VIII)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體。IX)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其是這樣的蛋白或多肽，即，當與TNF三聚體結合時，所述蛋白或多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體交聯和/或由這樣的受體交聯調控的信號傳導。X)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其能夠分子內結合TNF三聚體上的至少兩個TNF受體結合位點。XI)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，其通過適當的接頭連接。XII)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，其通過適當的接頭連接，并且其被聚乙二醇化(pegylated)。XIII)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括至少一種針對人血清白蛋白的納米體。XIV)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括至少一種針對人血清白蛋白的納米體，并且其是這樣的蛋白或多肽，即，當與TNF三聚體結合時，所述蛋白或多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體交聯和/或這樣的受體交聯調控的信號傳導。XV)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括至少一種針對人血清白蛋白的納米體，并且其能夠分子內結合TNF三聚體上的至少兩個TNF受體結合位點。XVI)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括一種針對人血清白蛋白的納米體，其中按照上述D-V)中任一項的兩個納米體的每一種都交聯到，任選地通過適宜的接頭，針對人血清白蛋白的一種納米體上。
XVII)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括一種針對人血清白蛋白的納米體，其中按照上述D-V)中任一項的兩個納米體每一種都交聯到，任選地通過適宜的接頭，針對人血清白蛋白的一種納米體上，并且其為這樣的蛋白或多肽，即，當與TNF三聚體結合時，所述蛋白或多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體交聯和/或這樣的受體交聯調控的信號傳導。XVIII)蛋白或多肽，其包括兩種按照上述I)-V)中任一項的納米體，并且其還包括一種針對人血清白蛋白的納米體，其中按照上述D-V)中任一項的兩個納米體每一種都交聯到，任選地通過適宜的接頭，針對人血清白蛋白的一種納米體上，并且其能夠分子內結合TNF三聚體上的至少兩個TNF受體結合位點。-按照上述VI)-XVIII)中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米體是人源化的納米體。-按照上述VI)-XVIII)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體是納米體ALB I (SEQ ID NO:63)的人源化變體。-按照上述VI)-XVIII)中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米體選自由下列各項組成的組:ALB 3 (SEQ ID NO:87)，ALB 4 (SEQ ID NO:88)，ALB5(SEQ ID NO:89),ALB 6(SEQ ID NO: 100),ALB 7(SEQ ID NO:101),ALB 8 (SEQ ID NO:102)ALB 9(SEQID NO:103)和 ALB 10 (SEQ ID NO:104)。-按照上述VI)-XVIII)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體是ALB 8。-按照上述VI)-XVI II)中任一項的蛋白或多肽，其包括或者基本上由兩種按照上述I)-V)中任一項的人源化納米體，以及納米體ALB 1(SEQID NO:63)的一種人源化變體組成。應該注意，當納米體按上文提法作為“按照上述I)-V)中任一項(in accordancewith any one of I) to V)above) ”時,它是至少按照I)-V)中的一項,可以按照I)_V)中的兩項或多項，并且還可以包括視為“按照上述ι)-ν)中任一項”的其它方面中的任何一個或多個。類似地，當蛋白或多肽按上文提法作為“按照上述I)-V)中任一項(in accordancewith any one of VI) to XVIII)above) ”時，它是至少按照VI)-XVIII)中的一項，可以按照VI)-XVIII)中的兩項或多項，并且還可以包括視為“按照上述VI)-XVIII)中任一項”的其它方面中的任何一個或多個。下列情形也在本發(fā)明的范圍內，在適用的情形中，本發(fā)明的納米體或多肽可以結合TNF-α的兩個或多個抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基或構象。在這樣的情形中，本發(fā)明的納米體和/或多肽結合的TNF-a抗原決定簇、表位、部分、結構域或亞基可以是基本相同的(例如，如果TNF-a包含重復的結構基序或者作為多聚體存在)，或者可以是不同的(并且在后一種情形中，本發(fā)明的納米體和多肽可以以可能相同或不同的親和力和/或特異性與TNF-a的這樣不同的抗原決定簇、表位、部分、結構域、亞基相結合)。并且，例如，當TNF-a以活化的構象和以無活性構象存在時，本發(fā)明的納米體和多肽可以結合這些構象的任一種，或者可以結合這兩種構象(即，以可能相同或不同的親和力和/或特異性結合)。并且，例如，本發(fā)明的納米體和多肽可以結合這樣的TNF-a構象，即在其中它與相關配體結合，可以結合這樣的TNF-a構象，即在其中它不與相關配體結合，或者可以結合這兩種構象(也是以可能相同或不同的親和力和/或特異性結合)。還期望本發(fā)明的納米體和多肽廣泛地結合所有天然存在的或合成的TNF-α類似物、變體、突變體、等位體、部分和片段，或者至少結合TNF-α的這些類似物、變體、突變體、等位體、部分和片段，所述類似物、變體、突變體、等位體、部分和片段包含與本發(fā)明的納米體和多肽在TNF-α中(例如，在野生型TNF-α中)結合的抗原決定簇或表位基本上相同的一個或多個抗原決定簇或表位。此外，在這樣的情形中，本發(fā)明的納米體和多肽可以結合這樣的類似物、變體、突變體、等位體、部分和片段，其以與本發(fā)明的納米體結合(野生型)TNF-α的親和力和特異性相同或不同(即，高于或低于)的親和力和/或特異性結合。本發(fā)明的納米體和多肽結合一些TNF-α類似物、變體、突變體、等位體、部分和片段，而不結合其它的，這也包括在本發(fā)明的范圍內。一般地，本發(fā)明的納米體和多肽至少結合這些形式(包括單體、多聚體及相關的形式)，所述形式從生物學和/或治療觀點來看是最相關的，這對于熟練的技術人員是清楚的。此外，由于TNF-α以單體形式和多聚體形式存在，并且特別以三聚體形式存在，所以下述也在本發(fā)明范圍內:本發(fā)明的納米體和多肽只結合單體形式的TNF-α，或者本發(fā)明的納米體和多肽另外還結合一種或多種這樣的多聚體形式，諸如TNF的三聚體形式；或者可以只結合這樣的多聚體(例如，三聚體)形式。因此，一般地，在本敘述中當提及針對TNF-α的納米體、蛋白或多肽時，應該理解這還包括針對以其三聚體形式存在的TNF-α的納米體(包括但不限于針對這樣的三聚體的受體結合位點(例如，用于TNF-RI,THF-RII的結合位點，也叫作Ρ55或ρ75)的納米體)。在所有這些情形中，本發(fā)明的納米體和多肽可以結合這樣的多聚體或締合的蛋白復合物，其以與本發(fā)明的納米體和多肽與單體和非締合狀態(tài)的TNF-α結合的親和力和/或特異性可能相同或不同(即，高于或低于)的親和力和/或特異性而結合。此外，一般地， 包含兩個或多個針對TNF- α的納米體的本發(fā)明的多肽可以以比相對應的一個或多個單體納米體更高的親和力結合。例如，并且沒有局限性，包含兩個或多個針對TNF-α多價(如本文所定義那樣)蛋白或多肽的不同表位的納米體的多價(如本文所定義那樣)蛋白或多肽可以以比相對應的單體更高的親和力結合TNF-α，所述TNF-α多價蛋白或多肽包含兩個或多個針對不同TNF-α表位的納米體。更重要地，包含兩個或多個針對TNF-α的納米體的多價(如本文所定義那樣)蛋白或多肽可以(并且通常應該)以比TNF-α單體更高的親和力結合TNF-α多聚體，并且通常還應該以比相對應的單體納米體更高的親和力結合。在這樣的多價蛋白或多肽中，例如，所述兩個或多個納米體可以針對相同的表位、基本上等價的表位或不同的表位。在這樣的多價蛋白或多肽的一個實施方案中，所述兩個或多個納米體可以是相同的(并且因此針對相同的表位)。由于已知通過TNF的信號傳導的初級模式包括TNF受體與TNF分子三聚體的交聯，所述TNF分子三聚體包含3個受體結合位點(例如參見Peppel等，J.Exp.Med.(實驗醫(yī)學雜志)，174 (1991)，1483-1489 ；EngeImann 等，J.Biol.Chem.(生物化學雜志),265(1990)，14497 ;Smith 和 Baglioni，J.Biol.Chem.(生物化學雜志)，264 (1989)，14646)，所以后者特別重要。例如，如P印pel等所述那樣，與單價胞外結構域相比，TNF受體的工程單價胞外結構域——其僅能夠阻滯TNF三聚體上的單個受體結合位點——不能防止TNF受體與其余兩個受體結合位點的交聯；而包括兩個這樣的胞外結構域的工程蛋白——因此能夠阻滯兩個受體結合位點一提供了顯著的功效。在本發(fā)明中，已經發(fā)現，在體外模型中，在細胞模型中以及在先體外后體內模型中，所述單價納米體能夠以TNF活性減小的這樣的方式結合TNF-α (參見下文實驗部分)。盡管本發(fā)明不受限于任何具體的機制、解釋或者假說，但是假設，由于它們小的大小和針對TNF- α的高親和力，兩個或三個本發(fā)明的單價納米體能夠同時占據TNF三聚體上的兩個或三個不同的受體結合位點，因此防止所述三聚體起始受體交聯并且由此而起始信號傳導(然而，并不排除其它作用機制:例如，取決于其所針對的表位，本發(fā)明的納米體還可以抑制TNF締合成三聚體狀態(tài))。還應該注意，除了結合單一 TNF-三聚體上的兩個或多個受體結合位點之外或者作為備選，包括或者基本上由針對TNF-α表位的兩個或多個免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)組成的本發(fā)明的蛋白或多肽可以結合(例如分子間地結合)在兩個分開的TNF-α分子(例如，兩個分開的三聚體)上的表位。然而，按照一個特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及這樣的蛋白或多肽，S卩，其包括或基本上由兩種或多種免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)組成，所述免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)的每一種都針對TNF-α上(并且特別是TNF-α三聚體上)的表位，所述表位位于和/或形成TNF三聚體受體結合位點的部分，以致當與TNF三聚體結合時，所述多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體交聯和/或由這樣的受體交聯調控的信號傳導。特別地，按照這一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及這樣的蛋白或多肽，S卩，其包括或基本上由兩種或多種免疫球蛋 白可變結構域(或其適當的片段)組成，所述免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)的每一種都針對TNF-α上(并且特別是TNF-α三聚體上)的表位，所述表位位于和/或形成TNF三聚體受體結合位點的部分，其中所述免疫球蛋白可變結構域以蛋白或多肽能夠同時結合單一 TNF三聚體上的兩個或多個受體結合位點(換言之，能夠分子內結合TNF三聚體上的至少兩個TNF受體結合位點)的這樣的方式彼此交聯。在這一實施方案中，所述兩種或多種免疫球蛋白可變結構域優(yōu)選地如上文定義，并且最優(yōu)選地是納米體(以致所述蛋白或多肽是多價納米體構建體，如本文進一步所述)。此外，在這一實施方案中，所述兩種或多種免疫球蛋白可變結構域可以是相同的或不同的；并且可以針對TNF受體結合位點中的不同表位,但是優(yōu)選地針對相同的表位。在這一實施方案的一個優(yōu)選的方面，所述兩種或多種免疫球蛋白可變結構域針對TNF- α三聚體的表位,其表位位于和/或形成TNF受體結合位點的部分。例如,所述兩種或多種免疫球蛋白可變結構域優(yōu)選地針對和/或可以結合TNF- α三聚體的表位，所述表位包括下列氨基酸殘基:第一個TNF單體(本文叫作“單體Α”)上位置88的Gln和位置90的Lys，以及第二個TNF單體(本文叫作“單體B”)上位置146的Glu(其中在TNF三聚體中單體A和單體B —起形成TNF受體結合位點)。正如下文參考納米體更詳細的描述那樣，在這樣的蛋白或多肽中，所述至少兩個免疫球蛋白可變結構域優(yōu)選以這樣的方式連接，即，在這樣的蛋白或多肽中存在的兩個免疫球蛋白可變結構域的N端和C端之間的距離優(yōu)選地至少為50埃，并且更優(yōu)選地在55-200埃區(qū)間，并且更優(yōu)選地在埃區(qū)間，并且特別是65-150埃區(qū)間。在這一實施方案的一個特別優(yōu)選的方面，這兩個或多個免疫球蛋白序列是納米體，并且優(yōu)選地選自本文所述的納米體。用于本發(fā)明的這一實施方案的一些特別優(yōu)選的納米體是 PMPIC2 (TNFI，SEQ ID NO:52)和 / 或 PMP5F10 (TNF3，SEQ ID NO:60)，以及其人源化的和其它變體(如本文所述)；其中PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO:52)及其人源化變體是特別優(yōu)選的。因此，現在將參考納米體更詳細地描述本實施方案。然而，技術人員應該清楚，本文的教導可以類似地應用到免疫球蛋白可變結構域。在本發(fā)明的這一實施方案中，所述兩個或多個免疫球蛋白序列通常通過一個或多個適宜的接頭連接，所述接頭是這樣的，即，每一個免疫球蛋白序列可以結合在同一 TNF三聚體上的不同受體結合位點。適宜的接頭尤其取決于TNF三聚體上免疫球蛋白序列結合的表位(之間的距離)，并且基于本文的內容，可選地在一些有限程度的常規(guī)實驗后，這對于技術人員是顯而易見的。例如，當所述兩個或多個免疫球蛋白序列是(單一)結構域抗體或納米體時，適宜的接頭可以選自本文所述的接頭，但是其具有這樣的接頭長度，即，所述兩個或多個(單一)結構域抗體或納米體可以分別結合到同一 TNF三聚體上的不同的受體結合位點。此外，當結合到TNF-α的受體結合位點的兩個或多個免疫球蛋白序列是(單一)結構域抗體或納米體時，它們還可以通過第三(單一)結構域抗體或納米體彼此連接(其中所述兩個或多個免疫球蛋白序列可以直接與第三(單一)結構域抗體/納米體連接或者通過適宜的接頭連接)。例如，這樣的第三(單一)結構域抗體或納米體可以是提供增加的半衰期的(單一)結構域抗體或納米體，如本文進一步所述。例如，后者(單一)結構域抗體或納米體可以是能夠·結合(人)血清蛋白諸如(人)血清白蛋白的(單一)結構域抗體或納米體，如本文進一步所述。備選地，與TNF-a的受體結合位點結合的所述兩個或多個免疫球蛋白序列可以串連連接(直接地或者通過適宜的接頭)，并且所述第三(單一)結構域抗體或納米體(其可以提供增加的半衰期，如上文所述)可以直接或者通過適宜的接頭與這兩個或多個前文提及的免疫球蛋白序列之一連接。這樣的構建體的一些非限制性實例是SEQ ID NOS:93或94的構建體。特別地，本發(fā)明已經發(fā)現(參見本文的結晶學數據)，當存在于本發(fā)明的多價或多特異性蛋白或多肽中的納米體與上述特異性表位(其為TNFl及其人源化變體的表位，以及TNF3及其人源化變體的表位)相結合時，那么優(yōu)選地，在這樣的蛋白或多肽中存在的兩個(或多個)抗-TNF納米體應該以這樣的方式連接，即，在這樣的蛋白或多肽中存在的兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的距離應該優(yōu)選地為至少50埃，并且更優(yōu)選地在55-200埃區(qū)間，并且特別在65-150埃區(qū)間(上限較不嚴格，并且可以出于便利的緣故進行選擇，例如，考慮到蛋白的表達/生產)；或者更普遍地，所述距離應該是這樣的，即，其允許蛋白或多肽進行分子內結合TNF-三聚體(B卩，取代分子間結合)。兩個抗-TNF納米體的N端和C端的距離可以通過任何適宜的方法確定，諸如通過結晶學或分子建模(如本文所述)。這些技術通常還使得確定特異的多價或多特異性蛋白或多肽是否能夠提供分子內建模成為可能。備選地，本發(fā)明還提供使用大小排阻層析的簡單實驗(如Santora等，Anal.Biochem.(分析生物化學)，299:119-129所述)，其可以用來確定本發(fā)明給出的蛋白或多肽是否(最顯著地)提供與TNF-三聚體的分子內結合或者(最顯著地)兩個或多個TNF-三聚體之間的分子間結合。因此，在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的蛋白或多肽優(yōu)選是這樣的，即，在這一實驗中，它最顯著地或者基本上專一地導致分子內結合。然而，如上文所強調，應該注意到通過獨立的TNF-α分子(例如，三聚體)的分子間結合而運作的本發(fā)明的蛋白或多肽也在本發(fā)明的范圍內。因此，在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供包括至少兩個針對TNF-a (并且特別是TNF-a三聚體)的納米體的多價或多特異性蛋白或多肽，其中所述納米體優(yōu)選地針對基本上與納米體PMP1C2相同的表位(如本文所述)，并且其中所述至少兩個納米體以這樣的方式連接，即，至少兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的距離是這樣的:所述蛋白或多肽能夠進行與TNF-三聚體的分子內結合(如本文所述)。優(yōu)選地，在這樣的蛋白或多肽中，兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的距離為至少50埃，并且更優(yōu)選地在55-200埃區(qū)間，并且特別是65-150埃區(qū)間。在這樣的優(yōu)選蛋白或多肽中，所述兩個或多個納米體可以以任何適當的方式連接，條件是可以獲得在至少兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的優(yōu)選距離，和/或條件是所述蛋白或多肽能夠進行與TNF-單聚體的分子內結合(如本文所述)。例如，在其最簡單的形式中，所述至少兩個納米體通過適宜的接頭或間隔直接連接，所述接頭或間隔提供至少兩個抗-TNF納米體的N端和C端的優(yōu)選距離，并且其可以允許所述蛋白或多肽進行與TNF-三聚體的分子內結合(如本文所述)。本文描述了適宜的接頭，并且可以——例如并 且沒有限制——包括一種氨基酸序列，其中氨基酸序列優(yōu)選地具有14個氨基酸的長度，更優(yōu)選地至少17個氨基酸，諸如約20-40個氨基酸序列(對于每一氨基酸使用3.5埃的平均距離，其分別對應49埃、59.5埃和約70埃的接頭距離；基于上文提及的距離，以相同方式計算氨基酸的最大量)。優(yōu)選地，這樣的氨基酸序列還應該是這樣的，即，其允許所述蛋白或多肽進行與TNF-三聚體的分子內結合(如本文所述)。因此，在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供包括至少兩個針對TNF-a (并且特別是TNF-a三聚體)的納米體的多價或多特異性蛋白或多肽，其中所述納米體優(yōu)選地針對基本上與納米體PMP1C2相同的表位(如本文所提及)，并且其中所述至少兩個納米體使用適宜的接頭或間隔彼此連接，以致至少兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的距離是這樣的:所述蛋白或多肽能夠進行與TNF-三聚體的分子內結合(如本文所述)。優(yōu)選地，在這樣的蛋白或多肽中，兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間的距離(由此所述接頭或間隔的優(yōu)選長度)為至少50埃，并且更優(yōu)選地在55-200埃區(qū)間，并且特別是65-150埃區(qū)間。更優(yōu)選地，在這一優(yōu)選的方面，所述接頭或間隔是這樣的氨基酸序列，S卩，其包括至少14個，優(yōu)選地至少17個，更優(yōu)選地至少20個氨基酸(具有出于便利緣故而選擇的非嚴格性上限，約50個，并且優(yōu)選地約40個氨基酸)。在一個優(yōu)選的但是非限制性實施方案中，所述接頭基本上由甘氨酸和絲氨酸殘基組成(如下文進一步所述)。例如，一個適宜的接頭是本文所述的GS30接頭，其包括30個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，所述至少兩個針對TNF-a的納米體通過另一部分(任選地通過一個或兩個接頭)諸如另一蛋白或多肽而彼此連接。在這一實施方案中，可以理想地在至少兩個抗-TNF納米體的N端和C端之間具有優(yōu)選的距離(即，如上文提及)，例如，以便蛋白或多肽仍然可以進行與TNF-三聚體的分子內結合(如本文所述)。在這一實施方案中，所述至少兩個納米體可以直接與另一部分連接，或者使用適宜的接頭或間隔而連接，條件還是仍然可以獲得優(yōu)選的距離和/或理想的分子內結合。所述部分可以是沒有偏離所述蛋白或多肽與TNF的結合和/或所述蛋白或多肽更理想的生物或藥理學特征(太多)的任何適宜的部分。同樣地，所述部分可以基本上沒有活性，或者可以是生物活性的，并且同樣可以或者不可以提高所述蛋白或多肽的理想的特性和/或可以賦予所述蛋白或多肽一種或多種額外的理想特性。例如，并且沒有限制地，所述部分可以提高蛋白或多肽的半衰期，和/或可以減小其免疫原性或者提高任何其它理想的特性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述部分可以是另一種納米體(包括但不限于針對TNF-α的第三納米體，盡管這不是必要的并且通常較不優(yōu)選)，并且特別地是提高蛋白或多肽半衰期的另一種納米體，諸如針對血清蛋白例如針對人血清蛋白的納米體。本文描述了這樣的蛋白和多肽的實例。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括兩種或多種免疫球蛋白序列(或其適當的片段)的多價多特異性構建體，其每一種針對TNF-a (例如，TNF-a三聚體)上位于和/或形成受體結合位點的部分的表位，并且其通過提供提高的半衰期的至少一個免疫球蛋白序列(并且任選地通過一個或多個適宜的接頭)彼此連接，以致當與TNF三聚體結合時，所述多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體的交聯和/或信號傳導。這樣的多肽可以是這樣的，即，以便前文提及的兩個或多個免疫球蛋白序列可以分別與TNF三聚體上的不同受體結合位點結合。特別地，在這一實施方案中，所述多肽可以包括三價雙特異性納米體，其包括每一種分別針對TNF-a (并且特別是TNF-a三聚體)上位于和/或形成受體結合位點的部分的表位的兩個納米體，其中所述納米體通過提供提高的半衰期的第三納米體(例如，針對血清蛋白諸如人血清白蛋白的納米體)彼此連接，其中每一前文提及的兩個納米體可以直接與所述第三納米體連接或者通過一個或多個適宜的接頭連接，以致當與TNF三聚體結合時，所述多肽能夠抑制或者減少TNF受體交聯和/或由所述TNF三聚體調控的信號傳導。這樣的多肽可以是這樣的，以致前文提及的兩個納米體可以分別與TNF三聚體上的不同受體結合位點結合。此外，用于本發(fā)明的這一實施方案的一些特別優(yōu)選的納米體是PMPIC2 (TNFI, SEQ IDNO:52)和 / 或 PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO:60)，以及其人源化的和其它變體(如本文所述)；其中PMP1C2(TNF1，SEQ ID NO:52)及其人源化變體是特別優(yōu)選的；并且所述納米體針對本文所述的人血清白蛋白。本發(fā)明的這一實施方案的一些優(yōu)選的但是非限制性的構建體是 TNF 24 (SEQ IDNO: 90)，TNF 26 (SEQ ID NO: 92)，TNF 27 (SEQ ID NO:93)，TNF 28(SEQID NO:94)，TNF 60 (SEQ ID NO:417)和 TNF 62 (SEQ ID NO:418)，其中 TNF60是特別優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的這一實施方案的一些優(yōu)選方面涉及:XIX)包括或者基本上由兩種或多 種免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)組成的蛋白或多肽，所述免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)每一種針對TNF-a (并且特別是TNF-a三聚體)上位于和/或形成TNF三聚體的受體結合位點的部分的表位，以致當與TNF三聚體結合時，所述多肽能夠抑制或者減少由所述TNF三聚體調控的TNF受體交聯和/或由所述受體交聯調控的信號傳導。
XX)包括或者基本上由兩種或多種免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)組成的蛋白或多肽，所述免疫球蛋白可變結構域(或其適當的片段)每一種針對TNF-α (并且特別是TNF-a三聚體)上位于和/或形成TNF三聚體的受體結合位點的部分的表位，以致所述多肽能夠分子內結合TNF三聚體上的至少兩個TNF受體結合位點。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可變結構域以這樣的方式彼此連接，即，所述蛋白或多肽能夠同時結合單一 TNF三聚體上的兩個或多個受體結合位點。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可變結構域能夠結合與納米體TNFl (SEQ ID NO:52)相同的表位。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可變結構域能夠結合TNF三聚體的TNF受體結合位點內的表位，所述表位包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可變結構域能夠結合TNF三聚體的TNF受體結合位點內的表位，所述表位至少包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu ;并且其還包括TNF- a單體A的下列氨基酸殘基的至少I個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置24的Gly，位置25的Gln，位置72的Thr，位置73的His，位置74的Val，位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置83的He，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置97的He，位置131的Arg，位置135的Glu，位置136的He，位置137的Asn，位置138的Arg，位置139的Pro，位置140的Asp，以及單體B中的下列殘基:位置20的Pro，位置32的Arg，位置65的Lys，位置112的Lys，位置115的Tyr，位置145的Ala，位置147的Ser。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述免疫球蛋白可變結構域能夠結合TNF三聚體的TNF受體結合位點內的表位，其至少包括下列氨基酸殘基:單體A中位置88的Gln ;單體A中位置90的Lys和單體B中位置146的Glu ;并且其還包括TNF- α單體A的下列氨基酸殘基的至少I個、優(yōu)選地2個或多個、更優(yōu)選地5個或多個、并且優(yōu)選地全部或基本上全部:位置75的Leu，位置77的Thr，位置79的Thr，位置80的Πθ，位置81的Ser，位置87的Tyr，位置89的Thr，位置91的Val，位置92的Asn，位置95的Ser，位置97的He，位置135的Glu，位置136的He，位置137的Asn，以及單體B中的下列殘基:位置33的Ala，位置145的Ala，位置147的Ser。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少兩種免疫球蛋白可變結構域以這樣的方式連接，即，在這樣的蛋白或多肽中存在的第一免疫球蛋白可變結構域的N端和第二免疫球蛋白可變結構域的C端之間的距離為至少50埃。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中第一免疫球蛋白可變結構域的N端和第二免疫球蛋白可變結構域的C端之間的距離為55-200埃。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中第一免疫球蛋白可變結構域的N端和第二免疫球蛋白可變結構域的C端之間的距離為65-150埃。-按照上述XI X)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域通過接頭或間隔彼此連接。
-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔是氨基酸序列。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔包括至少14個
氣基酸殘基。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔包括至少17-50個氨基酸殘基。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔基本上由甘氨酸和絲氨酸殘基組成。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔是GS30(SEQID NO:69)。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域通過另一部分彼此連接。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述其它部分是蛋白或多肽部分。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述其它部分賦予所述蛋白或多肽至少一種理想的特性，或者提高所述蛋白或多肽的至少一種理想的特性。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述其它部分提高所述蛋白和/或多肽的半衰期和/或減小所述蛋白或多肽的免疫原性。-按照上述XI X)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域的每一種通過接頭或間隔與所述其它部分連接。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔是氨基酸序列。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭或間隔基本上由甘氨酸和絲氨酸殘基組成。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述其它部分是納米體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述其它部分是針對人血清白蛋白的納米體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體是人源化的納米體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體是納米體ALB I (SEQ ID NO:63)的人源化的變體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體選自由下列各項組成的組:ALB 3 (SEQ IDNO:87)，ALB 4 (SEQ ID NO:88)，ALB5(SEQ ID NO:89),ALB 6(SEQ ID NO:100),ALB 7(SEQ ID NO: 101),ALB 8(SEQ ID NO:102)ALB 9 (SEQ ID NO:103)和 ALB 10 (SEQ ID NO:104)。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述至少一種針對人血清白蛋白的納米體是ALB 8。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是納米體。
-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是具有優(yōu)于2.1O-3 (Ι/s)、優(yōu)選地優(yōu)于1.1O-3 (Ι/s)的對于TNF的Ktjff速率的納米體；或者這樣的納米體的人源化變體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是這樣的納米體，即，所述納米體在W004/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于WO 04/041862的納米體VHH 3E(SEQIDNO:4)在相同檢測中的EC50值；或者這樣的納米體的人源化變體。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是這樣的納米體，即，所述納米體在W004/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于12nM ;或者這樣的納米體的人源化變體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是這樣的納米體，即，所述納米體在W004/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于5nM ;或者這樣的納米體的人源化變體。

-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是這樣的納米體，即，所述納米體在W004/041862實施例1第3)中所述的使用KYM細胞進行的基于細胞的檢測中所具有的EC50值好于3nM ;或者這樣的納米體的人源化變體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是按照上述XIX)-XX)中任一項的納米體，其是人源化的；這一實施方案的一些特別優(yōu)選的方面為:-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是GLEW-類納米體。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是在位置103具有精氨酸殘基(R)的納米體。-按照上述XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是在位置103具有精氨酸殘基(R)的GLEW-類納米體。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是與氨基酸序列 SEQ ID NO，s 52 (TNFl), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29)
96 (TNF30)之一具有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的納米體(如本文所定義)。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:a) CDRl 包括:-氨基酸序列DYWMY ；或-與氨基酸序列DYWMY有至少80%、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列DYWMY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；
并且b) CDR2 包括:-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；以及c) CDR3 包括:-氨基酸序列SPSGFN ；或-與氨基酸序列SPSGFN有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SPSGFN有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照上述XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl包括氨基酸序列DYWMY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR2包括氨基酸序列 EINTNGLITKYPDSVKG。
·
-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR3包括氨基酸序列 SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:-⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY;并且⑶R3包括氨基酸序列SPSGFN ;或者-⑶Rl包括氨基酸序列DYWMY;并且⑶R2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或
者-CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl包括氨基酸序列DYWMY ;并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl包括氨基酸序列DYWMY ;CDR2包括氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，并且CDR3包括氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中a) CDRl 為:-氨基酸序列DYWMY;或-與氨基酸序列DYWMY有至少80%、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或
-與氨基酸序列DYWMY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且其中:b) CDR2 為:-氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且其中:c) CDR3 為:-氨基酸序列SPSGFN;或-與氨基酸序列SPSGFN有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SPSGFN有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照上XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl是基酸序列 DYWMY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR2是基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR3是基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:-CDRl是氨基酸序列DYWMY ;并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN ;或-⑶Rl是氨基酸序列DYWMY;并且⑶R2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;或-CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG ;并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl是氨基酸序列DYWMY ;并且CDR3是氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl是氨基酸序列DYWMY ;CDR2是氨基酸序列EINTNGLITKYPDSVKG，和CDR3是氨基酸序列SPSGFN。-按照XIX) -XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)_XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中-任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代；和/或-與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域選自由下列各項組成的組:納米體TNF I (SEQ IDNO:52)和納米體TNF I (SEQ ID NO:52)的人源化變體。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域選自由下列各項組成的組:TNF 13 (SEQ ID NO:76)，TNF 14 (SEQ ID NO:77)，TNF29 (SEQ ID NO:95)和 TNF 30(SEQ IDNO:96)。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是 TNF 30 (SEQ ID NO:96)；并且這一實施方案的一些特別優(yōu)選的方面為:-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是KERE-類納米體。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是與氨基酸序列 SEQ ID NO，s 50 (TNF3),83 (TNF20),85 (TNF21),85 (TNF22),96 (TNF23)或98(TNF33)之一有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的納米體(如本文所定義)。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX) 中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:a) CDRl 包括:-氨基酸序列NYYMG;或-與氨基酸序列NYYMG有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列NYYMG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且b) CDR2 包括:-氨基酸序列NI SWRGYNI YYKDSVKG ;或-與氨基酸序列NISWRGYNI YYKDSVKG有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列NISWRGYNI YYKDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；以及c) CDR3 包括:-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl包括氨基酸序列NYYMG。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR2包括氨基酸序列 NI SWRGYNI YYKDSVKG。
-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR3包括氨基酸序列 SILPLSDDPGWNTY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:-⑶Rl包括氨基酸序列NYYMG;并且⑶R3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-CDRl包括氨基酸序列NYYMG ;并且CDR2包括氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG ;或-CDR2包括氨基酸序列NI SWRGYNI YYKDSVKG ；并且CDR3包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl包括氨基酸序列NYYMG KDR2包括氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY，和⑶R3包括氨基酸序列ILPLSDDPGWNTY(SEQ ID NO:436)。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:a) CDRl 為:-氨基酸序列NYYMG；或-與氨基酸序列NYYMG有至少80%、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95 %、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨 基酸序列；或-與氨基酸序列NYYMG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；并且b)CDR2 為:-氨基酸序列NI SWRGYNI YYKDSVKG ;或-與氨基酸序列NISWRGYNI YYKDSVKG有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列NISWRGYNI YYKDSVKG有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列；以及c) CDR3 為:-氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性的氨基酸序列；或-與氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY有2個或只有I個氨基酸差異的氨基酸序列。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl是氨基酸序列 NYYMG。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR2是氨基酸序列 NISWRGYNIYYKDSVKG。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDR3是氨基酸序列 SILPLSDDPGWNTY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中:-⑶Rl是氨基酸序列NYYMG;并且⑶R3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY ;或-CDRl是氨基酸序列NYYMG ;并且CDR2是氨基酸序列NISWRGYNIYYKDSVKG ;或-CDR2是氨基酸序列NI SWRGYNI YYKDSVKG ；并且CDR3是氨基酸序列SILPLSDDPGWNTY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中CDRl是氨基酸序列 NYYMG ;CDR2 是氨基酸序列 SILPLSDDPGWNTY，和 CDR3 是氨基酸序列 ILPLSDDPGWNTY。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域是如對于按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽所述的納米體，其中-任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代；和/或-與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域選自由下列各項 組成的組:納米體TNF 3 (SEQ IDNO:60)和納米體TNF3(SEQ ID NO:60)的人源化變體。-按照XIX)-XX)中任一項的蛋白或多肽，其中所述第一和第二免疫球蛋白可變結構域選自由下列各項組成的組:TNF20 (SEQ ID NO:83)，TNF21 (SEQ ID NO: 84), TNF 22 (SEQID NO:85), TNF23 (SEQ IDNO:86)或 TNF33 (SEQ ID NO:99)。應該注意，當蛋白或多肽按上文提法作為“按照上述XIX)-XX)中任一項(inaccordance with any one of XIX) to XX) above) ” 時，它是至少按照 XIX)-XX)中的一項，可以按照XIX)-XX)中的兩項，并且還可以包括視為“按照上述χιχ)-χχ)中任一項”的其它方面中的任何一個或多個。然而，應該注意，本發(fā)明不局限于任何具體的作用機制或假說。特別地，已經發(fā)現本發(fā)明的單價納米體還可以在本文所述的檢測和模型中有活性，這證實盡管在本發(fā)明的一個具體實施方案中優(yōu)選，但是TNF三聚體的分子內結合不需要以獲得本文所述的納米體、蛋白和多肽的理想的作用和效果。類似地，本文所述的蛋白和多肽通過任何適當的機制(即，通過分子內結合，分子間結合，或者甚至通過與單聚體TNF結合，由此抑制TNF三聚體的形成)實現它們的理想作用，這也包含在本發(fā)明范圍內。以下也在本發(fā)明的范圍內:應用本發(fā)明的納米體和多肽的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位體和/或衍生物，和/或應用包括或基本上由其組成的蛋白或多肽，條件是這些適于本文設想的應用。這樣的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位體、衍生物、蛋白和/或多肽將在本文中進一步描述。另一方面，本發(fā)明涉及針對TNF-α的納米體(如本文所定義)，其由4個構架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)(分別為CDR1-CDR3)組成，其中:(i)⑶Rl是這樣的氨基酸序列，其選自由SEQ ID NOS: 15-21的⑶Rl序列組成的組或者選自由SEQ ID NOS =164-197的CDRl序列組成的組；或者選自由與SEQ ID NOS:15_21組成的組的至少一種CDRl序列或SEQ ID NOS:164-197組成的組的至少一種⑶Rl序列有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或選自由與SEQ ID NOS: 15-21組成的組的至少一種CDRl序列或SEQ ID NOS:164-197組成的組的至少一種⑶Rl序列有2個或只有I個“氨基酸差異”(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；并且其中:(ii) CDR2是這樣的氨基酸序列，其選自由SEQ ID NOS:22_28的CDR2序列組成的組或者選自由SEQ ID NOS =232-265的CDR2序列組成的組；或者選自由與SEQ ID NOS:22~28組成的組的至少一種CDR2序列或SEQ ID NOS:232-265組成的組的至少一種 ⑶R2序列有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或選自由與SEQ ID NOS:22_28組成的組的至少一種CDR2序列或SEQ ID NOS:232-265組成的組的至少一種⑶R2序列有3個、2個或只有I個“氨基酸差異”(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；并且其中:(iii)CDR3是這樣的氨基酸序列，其選自由SEQ ID NOS:29~33的CDR3序列組成的組或者選自由SEQ ID NOS =300-333的CDR3序列組成的組；或者選自由與SEQ ID NOS:29~33組成的組的至少一種CDR3序列或SEQ ID NOS:300-333組成的組的至少一種⑶R3序列有至少80 %、優(yōu)選地至少90 %、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；
和/或選自由與SEQ ID NOS =300-333組成的組的至少一種CDR3序列有3個、2個或只有I個“氨基酸差異”(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；或者選自由與SEQ ID NOS:34和35的CDR3序列組成的組或者選自與SEQ ID NOS:34和35的至少一種⑶R3序列有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或選自與SEQ ID NOS:34和35的至少一種⑶R3序列有3個、2個或只有I個“氨基酸差異”(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。上述以及下文進一步描述的針對TNF-α的納米體在本文中還叫作本發(fā)明的納米體。在本發(fā)明的納米體中，特別優(yōu)選包括一個或多個上文明確列出的CDR’ s的納米體；更特別優(yōu)選包括兩個或多個上文明確列出的CDR’ s的納米體；并且最特別優(yōu)選包括三個上文明確列出的⑶R’ s的納米體`。在下表I中可以看出一些CDR序列的特別優(yōu)選的但非限制性的結合，其列出在許多優(yōu)選的(但是非限制性的)本發(fā)明納米體中存在的CDR’s和構架序列。熟練的技術人員應該清楚，存在于同一克隆中的⑶RU⑶R2和⑶R3序列的結合(即，在表I中在同一行提到的⑶R1XDR2和⑶R3序列)通常是優(yōu)選的(盡管本發(fā)明在其最廣泛意義上不限于此，并且還包括表I中提及的⑶R序列的其它適當的結合)。此外，在包括表I提及的⑶R’ s結合的本發(fā)明納米體中，每一⑶R可以被選自由與所提及的⑶R’ s有至少80%、優(yōu)選地至少90%、更優(yōu)選地至少95%、甚至更優(yōu)選地至少99%的序列相同性(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組的⑶R所取代；其中(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或選自由與所提及的CDR(S)上述氨基酸序列之一有3個、2個或者只有I個(如在前述段落中所指示)“氨基酸差異”(如本文所定義)的氨基酸序列組成的組，其中:(I)任何氨基酸取代優(yōu)選地是保守氨基酸取代(如本文所定義)；和/或(2)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列優(yōu)選地只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入。然而，熟練的技術人員應該清楚，表I中提及的CDR序列(的結合)通常是優(yōu)選的。
權利要求
1.針對人血清白蛋白的納米抗體，其由4個構架區(qū)和3個互補性決定區(qū)組成，所述4個構架區(qū)分別為FR1-FR4，所述3個互補性決定區(qū)分別為⑶Rl-⑶R3，其中ADRl包括或者是SEQ ID NO 36的氨基酸序列SFGMS <DR2包括或者是SEQ ID NO 40的氨基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG ;和 CDR3 包括或者是 SEQ ID NO 48 的氨基酸序列 GGSLSR。
2.權利要求I的納米抗體，其是VHH、人源化的VHH或駱駝源化的VH。
3.針對人血清白蛋白的納米抗體，其選自由下列各項組成的組SEQIDN0:87的ALB3，SEQ ID NO :88 的 ALB 4，SEQ ID NO 89 的 ALB 5，SEQ ID NO :100 的 ALB 6，SEQ ID NO 101 的 ALB 7，SEQ ID NO :102 的 ALB 8，SEQ ID NO :103 的 ALB 9 和 SEQ ID NO :104 的 ALB10。
4.權利要求3的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中所述納米抗體是SEQID NO :102的 ALB 8。
5.針對人血清白蛋白的納米抗體,其由4個構架區(qū)和3個互補性決定區(qū)組成，所述4個構架區(qū)分別為FR1-FR4，所述3個互補性決定區(qū)分別為⑶Rl-⑶R3，其中 (i)⑶Rl包括或者是SEQID NO 36的氨基酸序列SFGMS，或 ⑶Rl與SEQ ID NO 36有2個或只有I個“氨基酸差異”； 和 (ii)CDR2包括或者是SEQID NO 40的氨基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG，或 CDR2與SEQ ID NO 40有至少80%的序列相同性;和/或 其中所述⑶R2與SEQ ID NO 40有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”； 和 (iii)CDR3包括或者是SEQID NO 48的氨基酸序列GGSLSR ;或 CDR3與SEQ ID NO 48有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”。
6.權利要求5的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中 (1)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或 (2)任何氨基酸取代是保守氨基酸取代。
7.權利要求5或6的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中⑶R2與SEQID NO 40有至少90%的序列相同性。
8.權利要求5或6的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中⑶R2與SEQID NO 40有至少95%的序列相同性。
9.權利要求5或6的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中⑶R2與SEQID NO 40有至少99%的序列相同性。
10.權利要求5的納米抗體，其中⑶Rl是SEQID NO 36的氨基酸序列SFGMS KDR2是SEQ ID NO 40的氨基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG ;和CDR3是SEQ ID NO 48的氨基酸序列GGSLSRo
11.權利要求5至10中任一項的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中 (i)FRl是或包括選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQID NO =370,368,369,.371，372，373 和 374 ； (ii)FR2是或包括選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQIDNO :384,383和.385-388 ； (iii)FR3是或包括選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQIDNO =398,396,397,.399,400 和 402 ;和 (iv)FR4是或包括選自由下列各項組成的組的氨基酸序列SEQIDNO =412,410,411和.413-416。
12.權利要求5至10中任一項的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中i)FRl 選自由下列氨基酸序列組成的組SEQ ID NO 1 的 QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG 和SEQ ID NO 5 的 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG ;或 選自由與SEQ ID NO :1或5有至少80%序列相同性的氨基酸序列組成的組； 和/或 選自由與上述氨基酸序列之一有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”的氨基酸序列組成的組； 和其中ii)FR2 選自由下列氨基酸序列組成的組SEQ ID NO 2 的 WPQAPGK^XEXVASEQ ID NO 6 的 WERQAPGKEEEUASEQ ID NO 7 的 WERQAPGKEEEEVASEQ ID NO 8 的 WERQAPGKEEE￡ASEQ ID NO 9 的 WERQAPGKQEEUASEQ ID NO :10 的 WERQAPGKQEEEVASEQ ID NO :11 的 MRQAPGK^LEIA ;或 選自由與SEQ ID NO :2和6-11有至少80%序列相同性的氨基酸序列組成的組；和/或 選自由與上述氨基酸序列之一有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”的氨基酸序列組成的組； 和其中iii)FR3 選自由下列氨基酸序列組成的組SEQ ID NO 3 的 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA 和SEQ ID NO 12 的 RFTISRDNAKNTVYLQMNSLg￡EDTAVYYCAA ;或 選自由與SEQ ID NO 3或12有至少80%序列相同性的氨基酸序列組成的組； 和/或 選自由與上述氨基酸序列之一有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”的氨基酸序列組成的組； 和其中iv)FR4選自由下列氨基酸序列組成的組SEQ ID NO 4 的 MQGTXVTVSSSEQ ID NO 13 的盟QGTQVTVSS 和SEQ ID NO 14 的盟QGTUTVSS ;或 選自由與SEQ ID NO :4，13和14有至少80%序列相同性的氨基酸序列組成的組； 和/或 選自由與上述氨基酸序列之一有3個，2個或只有I個“氨基酸差異”的氨基酸序列組成的組； 其中標志殘基用“X”表示并且如上文所定義，并且其中括號內的數字是指按照Kabat編號方式的氨基酸位置。
13.權利要求12的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中 (1)與上述氨基酸序列相比較，所述氨基酸序列只包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；和/或 (2)除標志位置之外的任何位置的FRl中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或如表4所限定的氨基酸取代；和/或 (3)除標志位置之外的任何位置的FR2中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或如表5所限定的氨基酸取代；和/或 (4)除標志位置之外的任何位置的FR3中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或如表6所限定的氨基酸取代；和/或 (5)除標志位置之外的任何位置的FR4中的任何氨基酸取代是保守氨基酸取代和/或如表7所限定的氨基酸取代。
14.權利要求12或13的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中與SEQIDNO :1或5的序列相同性為至少90%，與SEQ ID NO :2和6-11的序列相同性為至少90%，與SEQ ID NO 3或12的序列相同性為至少90%，或與SEQ ID NO :4，13和14的序列相同性為至少90%。
15.權利要求12或13的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中與SEQIDNO :1或5的序列相同性為至少95%，與SEQ ID NO :2和6-11的序列相同性為至少95%，與SEQ ID NO 3或12的序列相同性為至少95%，或與SEQ ID NO :4，13和14的序列相同性為至少95%。
16.權利要求12或13的針對人血清白蛋白的納米抗體，其中與SEQIDNO :1或5的序列相同性為至少99%，與SEQ ID NO :2和6-11的序列相同性為至少99%，與SEQ ID NO 3或12的序列相同性為至少99%，或與SEQ ID NO :4，13和14的序列相同性為至少99%。
17.權利要求5-10中任一項的納米抗體，其為GLEW-類納米抗體。
18.權利要求5-10中任一項的納米抗體，其在位置103包含精氨酸殘基。
19.權利要求5-10中任一項的納米抗體，其在位置108包含亮氨酸殘基。
20.蛋白或多肽，其包括或者基本上由權利要求1-19中任一項的納米抗體組成。
21.權利要求20的蛋白或多肽，其包括或者基本上由至少一種權利要求1-19中任一項的納米抗體組成。
22.包括兩種以上納米抗體的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽包括至少一種權利要求1-19中任一項的納米抗體。
23.權利要求22的包括兩種以上納米抗體的蛋白或多肽，其中所述納米抗體通過接頭序列連接。
24.權利要求22的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽包括兩種權利要求1-19中任一項的納米抗體。
25.包括三種納米抗體的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽包括至少一種權利要求1-19中任一項的納米抗體。
26.權利要求25的包括三種納米抗體的蛋白或多肽，其中所述納米抗體通過兩個接頭序列連接。
27.權利要求25的蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽包括兩種或三種權利要求1-19中任一項的納米抗體。
28.雙特異性多肽，其包括權利要求1-19中任一項的第一納米抗體和針對第二抗原的第二納米抗體。
29.權利要求28的雙特異性多肽，其中所述第一納米抗體和第二納米抗體通過接頭序列連接。
30.三特異性多肽，其包括權利要求1-19中任一項的第一納米抗體，針對第二抗原的第二納米抗體和針對第三抗原的第三納米抗體。
31.權利要求30的三特異性多肽，其中所述第一納米抗體，第二納米抗體和第三納米抗體通過一個以上接頭序列連接。
32.權利要求31的三特異性多肽，其中所述第一納米抗體，第二納米抗體和第三納米抗體通過兩個接頭序列連接。
33.蛋白或多肽，其包括權利要求1-19中任一項的納米抗體，還包括至少一種其它納米抗體，其中所述納米抗體直接彼此連接或者通過接頭彼此連接。
34.權利要求22-33中任一項的蛋白或多肽，其中所述接頭是氨基酸序列。
35.權利要求34的蛋白或多肽，其中所述接頭是包括至少14個氨基酸的氨基酸序列。
36.權利要求34的蛋白或多肽，其中所述接頭是包括至少17個氨基酸的氨基酸序列。
37.權利要求34的蛋白或多肽，其中所述接頭是20-40個氨基酸。
38.權利要求34的蛋白或多肽，其中所述接頭包括甘氨酸和絲氨酸殘基。
39.權利要求20-38中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米抗體具有SEQ ID NO :102的ALB 8中存在的CDR序列。
40.權利要求20-38中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米抗體是人源化的納米抗體。
41.權利要求20-38中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米抗體是SEQ ID NO 63的納米抗體ALBl的人源化變體。
42.權利要求20-38中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米抗體選自由下列各項組成的組SEQ ID NO :87的ALB 3，SEQ ID NO :88的ALB 4，SEQ IDNO:89 的 ALB 5,SEQ ID NO :100 的 ALB 6,SEQ ID NO :101 的 ALB 7,SEQ ID NO :102 的 ALB8，SEQ ID NO :103 的 ALB 9 和 SEQ ID NO :104 的 ALB 10。
43.權利要求20-38中任一項的蛋白或多肽，其中至少一種針對人血清白蛋白的納米抗體是 SEQ ID NO :102 的 ALB 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的改進的納米體TM，以及包括或者基本上由一種或多種所述納米體組成的多肽。本發(fā)明還涉及編碼所述納米體和多肽的核酸；涉及制備所述納米體和多肽的方法；涉及表達或者能夠表達所述納米體和多肽的宿主細胞；涉及包括所述納米體、多肽、核酸或宿主細胞的組合物；并且涉及所述納米體、所述多肽、所述核酸、所述宿主細胞或所述組合物的應用，特別是用于預防、治療或診斷目的，諸如預防、治療或診斷目的。
文檔編號C07K16/18GK103254309SQ20121035004
公開日2013年8月21日 申請日期2006年5月17日 優(yōu)先權日2005年5月18日
發(fā)明者埃爾斯·拜爾內德 申請人:埃博靈克斯股份有限公司