專利名稱：：TNF-α結(jié)合肽和TNFR1封閉肽及其在治療TNF相關(guān)疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及能拮抗腫瘤壞死因子-a(TNF-a)生物學(xué)活性的TNF結(jié)合肽、TNFR1封閉肽等小分子多肽及TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白。
背景技術(shù)：
：TNF-a是一類重要的促炎癥細(xì)胞因子，是促炎細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)中的起始因子，可促進(jìn)一系列促炎細(xì)胞因子(如IL-l、IL-6、IL-8等)的釋放。臨床研究證實在多種感染或非感染性炎癥及其并發(fā)癥(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病、內(nèi)毒素休克、急性肝壞死、Crohn's病等)的發(fā)生和發(fā)展中，全身或炎癥局部TNF-a產(chǎn)生增加起著關(guān)鍵作用；體內(nèi)TNF-a水平過高，往往預(yù)示病人預(yù)后不良。在動物實驗中，單一應(yīng)用大劑量TNF-a即可直接導(dǎo)致內(nèi)毒素樣休克，而用抗TNF抗體則可減輕及阻止內(nèi)毒素性休克的發(fā)生。轉(zhuǎn)TNF-a基因小鼠易患慢性關(guān)節(jié)炎；最近報道給大鼠輸入TNF-a可誘導(dǎo)胰島素抵抗，此為II型糖尿病發(fā)生的重要機制。(WilliamsR0，MethodsMolecularBiology,2006，361:265-284;YanoY等，DiabetesCare，2004，27(3):844-845。)與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在國內(nèi)外呈大幅度上升的趨勢。例如，全球II型糖尿病患者總?cè)藬?shù)已超過1.5億人，預(yù)計到2025年將達(dá)到3億人；在我國大城市中，20歲以上人群的II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)發(fā)病率達(dá)到10%，另有10%為糖調(diào)節(jié)異常，即每5個成年人中就有一個糖代謝異常。在我國，目前已有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者400萬以上，患病率達(dá)總?cè)丝诘?.32-0.34X，Crohn's病(人群潰瘍性結(jié)腸炎)、銀屑病、強直性脊柱炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的與TNF發(fā)病相關(guān)的疾病的發(fā)病率在我國正在逐年上升。由于TNF-a在多種疾病中有重要的致病作用，因此，以TNF-a或TNF受體為靶點設(shè)計藥物，有效阻斷上述病理過程，治療TNF相關(guān)疾病，成為國際藥學(xué)界研究開發(fā)的熱點(SteedPaulM等，Science,2003，301，18951898;ScottD.L.等，TheNewEnglandJournalofMedicine,2006，355:704-712)。目前，國際上已獲FDA和EMEA(EuropeanMedicinesEvaluationAgency)正式批準(zhǔn)，在美國和歐洲已進(jìn)入臨床試用階段的抗TNF-a試劑主要有抗TNF抗體鼠人嵌合單克隆抗體(IgGl)，商品名為infliximab、cA2、Remicade或Centocor，(Centocor，Inc，Malvern，PA，F(xiàn)DAlicensed.#1242，8/24/1998)靜脈注射，人源化抗TNF抗體adalimumab(商業(yè)名Humira，CDP571License12/2002)，全人源化抗體(D2E7)也已問世?？扇苄訲NF受體TNFR1-Fc融合蛋白(Etanerc印t、Enbrel或Immunex)(Imm皿exCorp，Seattle,WA，License#1132，6/6/2000)。上述商品化的抗TNF-a試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)雖然已取得較好的臨床治療作用，但仍然存在一系列問題，如存在潛在的副作用、來源受到限制、生物穩(wěn)定差、價格昂貴等。目前，臨床試驗已發(fā)現(xiàn)上述抗TNF-a試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)存在導(dǎo)致紅細(xì)胞和血小板減少、結(jié)核感染、上呼吸道、尿路感染、皮疹、發(fā)熱、低/高血壓等副作用，嚴(yán)重者有可引發(fā)腫瘤。目前，研究開發(fā)安全性好、毒副作用小、成本低的小分子TNF-a拮抗劑已受到人們的關(guān)注。(SteedPaulM.等，Science,2003，301，18951898;Gonzale-ReyE等，ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(11)4228-4233。)噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)(phagedisplaytechniques,PDT)是九十年代初發(fā)展起來的一項新興技術(shù)(LowmanH.B.等.An皿.Rev.Biophys.BiomolStruct1997;26:401-24)，是研究蛋白質(zhì)分子之間相互作用的一個有效工具。PDT所得到的肽均是來源于噬菌體肽庫，氨基酸序列分析得到肽的序列，人工合成進(jìn)行機制研究。隨著肽庫構(gòu)建及篩選技術(shù)的不斷發(fā)展、完善，使其對研究蛋白質(zhì)識別機制、確定抗原決定簇、藥物設(shè)計、疫苗研制等方面提供了全新的思路與先進(jìn)的手段?，F(xiàn)有的噬菌體隨機肽文庫主要有兩種非限制性肽庫(線性肽庫)和限制性肽庫(例如半胱氨酸環(huán)限制的肽庫、引入a-螺旋等二級結(jié)構(gòu)的突變庫等)。一般研究所選用的噬菌體隨機肽庫都是線性的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面選擇噬菌體12線肽庫，以rhTNFRl為誘佴，從中釣取出一條線性的12肽，該肽可與TNFR1結(jié)合，競爭性抑制TNF-a與TNFR1的結(jié)合，從而拮抗TNF-a的生物學(xué)效應(yīng)，我們將此肽命名為"TNFR1封閉肽"。但人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內(nèi)的半衰期較短，從而制約其臨床應(yīng)用。為了克服這些缺陷，本發(fā)明又在此工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建TNFR1封閉肽一Fc融合蛋白表達(dá)載體pIG/3C-TNFRlBP，并借助可高表達(dá)外源蛋白的真核細(xì)胞C0S7成功表達(dá)TNFRlBP/hFc融合蛋白。體外實驗證實這種融合蛋白也能有效地競爭性抑制TNF-a與TNFR1結(jié)合，從而發(fā)揮拮抗TNF-a生物學(xué)活性的作用；體內(nèi)實驗也證實這種融合蛋白能預(yù)防和治療高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型。另一方面，由于與線肽庫相比噬菌體隨機環(huán)肽庫具有以下優(yōu)點(l)由于環(huán)肽固定了兩個半胱氨酸殘基，附加二硫鍵的限制可以幫助維持肽的折疊結(jié)構(gòu)。因此，環(huán)肽庫比線性肽庫更可能篩選到高親和力、高特異性的肽。因為它經(jīng)歷了構(gòu)象的選擇，使之盡可能與靶分子表面和內(nèi)部結(jié)合。(2)環(huán)肽由于其構(gòu)象的復(fù)雜性，故其降解速度較線肽慢，使之半壽期明顯延長。(3)由于受到轉(zhuǎn)化效率的影響，噬菌體肽庫不可能達(dá)到完全的隨機化，各種肽庫的多樣性就存在差異。因此，本發(fā)明又選擇噬菌體C7C環(huán)肽庫，分別以rhTNF-a和rhTNFRl為誘餌，從該環(huán)肽庫中篩選TNF結(jié)合肽和TNFR1封閉肽。通過體外實驗證實這兩種環(huán)肽能抑制TNF-a介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)；體內(nèi)實驗證實這兩種環(huán)肽抑制三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。本發(fā)明的目的在于提供一種TNFR1封閉肽(線12肽)和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白。本發(fā)明的目的還在于提供編碼所述TNFR1封閉肽和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白的核酸分子。本發(fā)明目的還在于提供制備本發(fā)明融合蛋白的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與一條TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)。本發(fā)明的目的還在于提供上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)的核酸分子。本發(fā)明的目的還在于將上述TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)和TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)應(yīng)4用于治療潰瘍性結(jié)腸炎；將TNF-a受體1封閉肽用于治療關(guān)節(jié)炎；將TNFR1封閉肽_Fc融合蛋白用于治療II型糖尿病。本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容如下—、TNFR1封閉肽(12線肽)和TNFR1封閉肽_Fc融合蛋白1.借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與TNFR1結(jié)合的含12個氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)；2.體外實驗證實人工合成的該封閉肽可以完全封閉大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(何亞萍等，中國免疫學(xué)雜志，2003，19(6):385-387);3.體內(nèi)實驗證實該封閉肽可有效減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的局部關(guān)節(jié)腫脹及炎癥細(xì)胞的浸潤，并可抑制促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，顯示具有較好的治療作用(何亞萍等，藥學(xué)學(xué)報，2003，38(12):889-892)。4.構(gòu)建TNF封閉肽-IgFc融合蛋白(1)借助DNA合成技術(shù)，構(gòu)建該封閉肽的編碼DNA片段(并含內(nèi)切酶位點)；(2)借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達(dá)載體中，構(gòu)建TNFR1I封閉肽-IgFc的重組體，其技術(shù)路線見圖36。(3)將此重組體瞬時轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞使之成功表達(dá)TNFRl封閉肽-hFc融合蛋白；利用間接免疫熒光、流式細(xì)胞技術(shù)、胞毒抑制實驗證實此融合蛋白可與細(xì)胞表面TNFR1結(jié)合，從而抑制TNF-a的生物學(xué)活性；用RT-PCR及激光共聚焦顯微鏡檢測證實此融合蛋白可明顯抑制TNF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞NF-KB核轉(zhuǎn)位，從而抑制促炎細(xì)胞因子IL_1PmRNA和IL_8mRNA的轉(zhuǎn)錄。(4)將重組體轉(zhuǎn)染CH0-K1和BHK-21細(xì)胞并建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，對其分泌的肽-IgFc融合蛋白進(jìn)行純化并檢測其穩(wěn)定性和生物學(xué)效應(yīng)；5.融和蛋白的主要藥效研究，如體外對炎性細(xì)胞活化的影響以及體內(nèi)對高脂喂養(yǎng)大鼠引起的II型糖尿病的預(yù)防和治療作用。二、TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)1.采用噬菌體隨機環(huán)9肽庫展示技術(shù)分別以hrTNF-a和hrTNFRl為誘餌進(jìn)行親和篩選及生物學(xué)效應(yīng)鑒定得到分別能與TNF-a和TNFR1特異性結(jié)合的TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)。(尹丙姣等，華中科技大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2005，34(6)670-677)2.外實驗證實人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFR1封閉肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細(xì)胞膜上TNFR1結(jié)合；非變性聚丙烯凝膠電泳證明TNF結(jié)合肽與TNFR1封閉肽之間不互為配體和受體而相互結(jié)合；TNF結(jié)合肽與TNFR1封閉肽對TNF-a的細(xì)胞毒效應(yīng)均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，二者聯(lián)用的效果更好；TNF結(jié)合肽與TNFR1封閉肽聯(lián)用能有效抑制TNF-a和IFN-Y誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)強度，抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL-IP、IL-8mRNA轉(zhuǎn)錄。(尹丙姣等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜，2007，已校對，待發(fā)表)3.體內(nèi)實驗證實人工合成的TNF結(jié)合肽與TNFRl封閉肽聯(lián)用可顯著減輕TNBS誘導(dǎo)大鼠實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的病理損傷，改善癥狀，有效抑制大鼠血清和結(jié)腸組織中NO含量以及結(jié)腸組織中MPO活性的活性，抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中、IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄和結(jié)腸組織中TNF-a蛋白的表達(dá)，對TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用。(尹丙姣5等，免疫學(xué)雜志，2007，已投稿)通過以上所述并結(jié)合后文實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出本發(fā)明的特征和優(yōu)點。制作用)一、圖1至圖22:TNFR1封閉肽(12線肽)和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白圖1TNFR1封閉肽(12線肽)對TNF-a誘導(dǎo)的大鼠腹腔M①呼吸爆發(fā)的影響(抑圖2.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導(dǎo)大鼠腹腔M①IL-1PmRNA的影響圖3.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導(dǎo)大鼠腹腔MOTNF-amRNA的影響圖4.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導(dǎo)大鼠腹腔MONF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響圖5.TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)病理改變的影響(X200)圖6.TNFR1封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔MOIL-1PmRNA的影響圖7.TNFR封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔MOTNF-amRNA的影響圖8.重組表達(dá)載體pIG/3C-TNFRBP的酶切鑒定圖譜圖9.融合蛋白TNFRI-hlgGFc的表達(dá)濃度與轉(zhuǎn)染時間的關(guān)系圖10.融合蛋白TNFRI-IgGFc的Western-Blotting鑒定圖11.間接免疫熒實驗檢測融合蛋白與TNFR的結(jié)合圖12.流式細(xì)胞術(shù)檢測TNFR封閉肽-hlgGFc融合蛋白與TNFR的結(jié)合能力圖13.胞毒實驗檢測融合蛋白對TNF-a胞毒效應(yīng)的拮抗作用圖14.融合蛋白對TNF-a誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IL-113mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖15.融合蛋白對TNF-a誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IL-8mRNA轉(zhuǎn)錄的影響圖16.融合蛋白對TNF-a誘導(dǎo)單核細(xì)胞NF-kB核轉(zhuǎn)位的影響圖17.高脂高糖誘導(dǎo)大鼠肥胖和胰島素抵抗圖18.融合蛋白可抵抗高脂高糖誘導(dǎo)的大鼠肥胖圖19.融合蛋白對肥胖大鼠糖耐量的影響圖20.融合蛋白能提高胰島素的敏感性圖21.融合蛋白抑制TNF-a的產(chǎn)生圖22.融合蛋白促進(jìn)組織中胰島素剌激的IRS-1酪氨酸磷酸化二、圖23至35:TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)圖23.不同噬菌體克隆對TNF-a誘導(dǎo)U937細(xì)胞毒效應(yīng)的抑制率作用圖24.噬菌體聯(lián)用對TNF-a誘導(dǎo)U937細(xì)胞毒效應(yīng)的抑制作用圖25.各噬菌體與靶蛋白結(jié)合的特異性圖26.TNFR封閉噬菌體對TNF-a誘導(dǎo)IL-1PmRNA水平的抑制作用，圖中1.陰性對照；2.TNF-a;3.TNF-a+pha.X2;4.TNF-a+pha.X4;5.pha.X2;6.pha.X4;M.Marker圖27.TBP和TRBP對GFP-TNF融合蛋白與L929細(xì)胞TNF受體結(jié)合的影響，圖中A:GFP-TNFB:GFP_TNF+無關(guān)肽C:GFP-TNF+p印.38+X4圖28.TBP和TRBP的非變性聚丙烯凝膠電泳圖，圖中1:p印.382:p印.X43:6p印.38+X4圖29.TBP和TRBP對TNF_a介導(dǎo)的U937細(xì)胞毒效應(yīng)抑制作用的劑量反應(yīng)關(guān)系圖30.TBP和TRBP對TNF-a禾PIFN-Y誘導(dǎo)單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響圖31.TBP和TRBP對TNF-a誘導(dǎo)Mo的IL-1P、IL_8mRNA的抑制作用，圖中1:正常對照2:TNFa對照3:TNF-a十p印.X4;4:TNF—a+pep.385:TNF-a+pep.38+X4圖32.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸病理改變的影響圖33.各實驗組大鼠結(jié)腸組織病理改變(10X)，圖中A.正常對照組；B.模型組；C.無關(guān)肽對照組D.聯(lián)合多肽治療組；E.抗體治療組F.5-氨基水楊酸治療組圖34.各種治療對結(jié)腸炎大鼠腹腔M小中1L-1P和IL-8mRNA水平的影響，圖中1.生理鹽水對照組2.模型組3.多肽治療組4.無關(guān)肽對照組5.抗體治療組6.5-氨基水楊酸治療組圖35.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TNF-a蛋白表達(dá)的影響(40X)，圖中A.正常對照組；B.模型組；C.無關(guān)肽對照組D.多肽治療組；D.抗體治療組E.5-氨基水楊酸治療組三、圖36.借助分子克隆技術(shù)將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達(dá)載體中，構(gòu)建TNFR1封閉肽-IgFc重組體的技術(shù)路線圖。具體實施例方式—、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽_Fc融合蛋白實施例1TNFR1封閉肽的篩選及其特異性鑒定借助噬菌體展示技術(shù)，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與TNFRl結(jié)合的含12個氨基酸的線肽(TNFRl封閉肽)，其具體篩選過程同下述實施例7之7.1。實施例2TNF受體封閉肽(12線肽)對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響以下TNFRl封閉肽(12線肽)粉劑均由由第三軍醫(yī)大學(xué)合成。2.lTNF受體封閉肽對TNF-a誘導(dǎo)的大鼠腹腔M①呼吸爆發(fā)的影響采用NBT法檢測常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細(xì)，向3X105/ml大鼠腹腔巨噬細(xì)胞加入TNF-a(5ng/ml)100ill禾P/或TNFRl封閉肽(10yg/ml)100y1，每組設(shè)3個復(fù)孔；然后加入100y1/孔NBT(2mg/ml)，放37°CC02培養(yǎng)箱中45分鐘；再加入70%甲醇溶液100y1/孔，固定5min;棄上清，用70%甲醇溶液洗3次；空氣干燥，最后加入120ii/孔2M的K0H溶液和140y1/孔的DMSO，立即混勻，在波長630nm下測其OD值。結(jié)果如圖1:外源性TNF2a可明顯增強M小的呼吸爆發(fā)，約為對照組的3倍(P〈0.05)，而TNF受體封閉肽則能完全阻斷TNF-a誘導(dǎo)的M小呼吸爆發(fā)，其值幾乎接近于其基礎(chǔ)值，提示該肽可競爭性抑制TNF-a誘導(dǎo)的M小呼吸爆發(fā)。2.2TNFR1封閉肽對大鼠腹腔M①IL-1P、TNF-amRNA的影響采用RT-PCR檢測IL-iPmRNA和TNF-amRNA:常規(guī)分離大鼠腹腔巨噬細(xì)，用TRIzolRNA分離試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照BoerhingerMannheim公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。取2iU上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，分別用IL-IP特異性引物(P1-GATAACCTGCTGGTGTGTGA;P2-CTTGTGAGGTGCTGATGTAC)、TNF-a特異性引物(Pl-GCGGATCATGGTCAGATCATCTTCTCGAA;P2-CCCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAGTA)、P-actin特異性引(Pl-AACGGCTCCGGCATGTGCAA;P2-CTTCTGACCCATGCCCACCA)進(jìn)行PCR擴增，IL-1的PCR循環(huán)為94°C30s，62。Clmin，72°Clmin，26個循環(huán)，74。ClOmin;TNF-a的PCR循環(huán)如下94。C30s，58。C30s，72。Clmin，28個循環(huán)，74t:10min。取5iUPCR產(chǎn)物加入liU6X上樣緩沖液混合，在80伏恒壓下進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，在短波紫外燈下觀察結(jié)果并照相。結(jié)果如圖2所示對照組M小未見IL-1PPCR產(chǎn)物出現(xiàn)(泳道4)，TNF-a剌激3h后的M小可見明顯的IL-1PcDNA特異性條帶(泳道2)，而TNF受體封閉肽則可顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL_1PmRNA的表達(dá)(泳道3)，因為其PCR產(chǎn)物條帶明顯減弱，通過密度掃描進(jìn)行相對定量，證實TNFR1封閉肽的抑制率達(dá)50X以上，提示TNFR1封閉肽可有效抑制活化的M小表達(dá)IL_1PmRNA。同時，結(jié)果還顯示(如圖3)，未受剌激的M小不表達(dá)TNF-amRNA(泳道4)，TNF-a可誘導(dǎo)M小強表達(dá)TNF-amRNA，因為圖中可見一條強的特異性PCR產(chǎn)物條帶(泳道2)，而用TNFR1封閉肽則可使TNF-a的PCR產(chǎn)物條帶明顯減弱(泳道3)，其抑制率約為50%，提示TNFR1封閉肽可部分阻斷TNF-a的正反饋作用。2.3TNFR1封閉肽對TNF-a誘導(dǎo)大鼠腹腔M①NF-kBp65核轉(zhuǎn)位的影響NF_kBp65核轉(zhuǎn)位的檢測取用TNFa(5ng/ml)和/或TNFRl封閉肽(lOyg/ml)剌激lh后的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(lX107)，用冷PBS洗滌，12000r/min，lmin離心，收集細(xì)胞；加入400ii1細(xì)胞膜裂解液重懸細(xì)胞；冰上腫脹10min加入0.5XNP240至終濃度為0.1%0.125X;振蕩10s，12000r/min，lmin離心；加入10y1核膜裂解液重懸沉淀物；冰上放置30min，12000r/min，lmin離心，收集上清，按常規(guī)方法做Westernblot。免疫染色的抗體為兔抗人IgGNF-kBp65多克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。結(jié)果如圖4所示。未加任何剌激的對照組無條帶出現(xiàn)，提示在正常情況下腹腔巨噬細(xì)胞核內(nèi)無NF-kBp65存在(泳道1)，單獨給予TNF-a剌激lh后，大量NF-kBp65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，因為出現(xiàn)明顯的NF-KB特異性條帶(泳道3);用TNFRl封閉肽后，則使TNF-a誘導(dǎo)的NF-KB條帶明顯減弱(泳道2)，提示TNFR1封閉肽能部分抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-kBp65核轉(zhuǎn)位。實施例3TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響3.l大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的建立Wistar大鼠，$，體重150200g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。弗氏完全佐劑。實驗分組對照組注射生理鹽水O.lml/只；模型組在大鼠右足墊部皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(F5881，購自美國Sigma公司)0.lml/只；治療1組注射佐劑后，立即注射TNFR1封閉肽0.lml/只，劑量分別為0.5和1.Omg/kg體重，qd，每個劑量4只，連續(xù)治療10d，治療2組方法與劑量同治療組l，連續(xù)治療20d后用游標(biāo)卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)并取關(guān)節(jié)組織按常規(guī)做組織切片，HE染色。注射佐劑后，大鼠煩躁不安，右腳不敢著地行走，18h后出現(xiàn)右后肢踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，走路緩慢，進(jìn)食減少等臨床表現(xiàn)；d3右后肢踝關(guān)節(jié)腫脹減輕，但d8紅腫再度加重(表l);在接種1018d后，形成多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為未注射佐劑一側(cè)(左后肢)的踝關(guān)節(jié)輕度紅腫(結(jié)果未顯示)，與人類RA的發(fā)病過程極為相似。而注射TNF受體封閉肽后數(shù)天，大鼠情緒穩(wěn)定，行走基本自如，踝關(guān)節(jié)腫脹有所減輕等。病理切片顯示，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量的炎性細(xì)胞、漿細(xì)胞的浸潤，血管翳形成并伸向關(guān)節(jié)表面，關(guān)節(jié)腔腔隙縮小，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞(如圖5)。說明大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型建立成功。3.2TNF受體封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹的影響用游標(biāo)卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度(cm)。結(jié)果(表1)顯示大鼠踝關(guān)節(jié)注射佐劑后18h明顯腫脹，但d3則有所減輕，dlO腫脹再度明顯，此后腫脹程度隨時間延長而加重；用TNF受體封閉肽(lmg/kg體重)后，前3d無明顯療效，但10d后，治療組踝關(guān)節(jié)腫脹基本消退，與未注射佐劑對照組相似。所用兩種藥物劑量組之間的療效無顯著性差異。3.3TNF受體封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎病理變化的影響按常規(guī)做組織切片，HE染色。結(jié)果顯示經(jīng)每日lmg/kg體重的TNF受體封閉肽持續(xù)治療20d后，與未用藥的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠相比，其踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞層增生程度減小，滑膜組織充血、水腫好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少以及關(guān)節(jié)軟骨破壞程度減輕等。但與正常大鼠的踝關(guān)節(jié)切片相比，治療組尚未完全恢復(fù)正常(如圖5)。表1.TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*模型組與正常組相比P<0.001**治療組與模型組相比P<0.0013.4TNF受體封閉肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL_1PmRNA的影響取對照組、模型組與治療20d的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞5X107ml，RT-PCR分析方法同實施例1.2。結(jié)果如圖6所示正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞沒有IL-113mRNA的轉(zhuǎn)錄，因為未檢測到RT-PCR產(chǎn)物；注射佐劑后的模型組大鼠的腹腔M①出現(xiàn)一條強的IL-113cDNA特異性條帶(泳道4)，而用TNF受體封閉肽治療后的大鼠腹腔M①的IL-iPcDNA條帶則明顯減弱(泳道2)，通過密度掃描進(jìn)行相對定量，證實TNF受體封閉肽的抑制效率為50%。同樣的方法測得結(jié)果如圖7所示正常大鼠腹腔M①未檢測到TNF-a的RT-PCR產(chǎn)物(泳道3)，佐劑性關(guān)節(jié)炎組大鼠的腹腔M小有明顯TNF-a特異性RT-PCR產(chǎn)物條帶出現(xiàn)(泳道2)，而經(jīng)TNF受體封閉肽治療大鼠的腹腔M①的TNF-a條帶則明顯減弱(泳道4)。通過密度掃描進(jìn)行相對定量，證實TNF受體封閉肽的抑制率達(dá)30%以上。實施例4TNFRl封閉肽-hlgGFc真核表達(dá)載體(PIG/3C_TNFR1BP)構(gòu)建和鑒定經(jīng)上述體內(nèi)外實驗證實此條TNFRl封閉肽(線12肽)能抑制TNF_a的生物學(xué)活性，并對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用。但是，由于人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內(nèi)的半衰期較短，從而制約其臨床應(yīng)用，因此本發(fā)明通過人工合成編碼TNFRl封閉肽的寡核苷酸，將其插入真核細(xì)胞Fc表達(dá)載體pIG/3C，從而成功構(gòu)建TNFRl封閉肽-人Fc表達(dá)載體pIG/3C-TNFRlBP，并在真核細(xì)胞C0S7中成功表達(dá)TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白(TNFRlBP/hlgFc)。具體實施方案如下4.1合成TNFRl封閉肽基因TNFRl封閉肽基因片段由美國PE公司391型DNA自動合成儀合成(上海生物工程技術(shù)有限公司)，在封閉肽寡核苷酸正負(fù)鏈5'端和3'端分別引入Kpnl酶切粘性末端序列和BamHI酶切后粘性末端序列。4.2TNFR1封閉肽單鏈DNA的復(fù)性由于經(jīng)DNA合成儀合成的TNFRl封閉肽基因為正負(fù)兩條DNA單鏈，為使其形成雙鏈DNA分子構(gòu)像和完整的限制性酶BamHI和Kpnl酶切后粘性末端序列，需將正負(fù)兩鏈在一定條件下進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性方法如下將合成的TNFRII封閉肽基因的正負(fù)鏈分別溶于10mmol/LTris-HCl(pH8.5)溶液內(nèi)，使兩鏈的終濃度均為10iimol/L。取正負(fù)鏈各20iil，置同一1.5ml離心管內(nèi)，加4.4ii110XPCRbuffer,IO(TC煮沸3min，置室溫自然冷卻，即得復(fù)性的雙鏈TNFRl封閉肽基因。4.3質(zhì)粒pIG/3C的轉(zhuǎn)化、擴增及大量提取主要方法均參照盧圣棟主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(第2版)(精)一書進(jìn)行。4.4TNFR1封閉肽-hlgG真核表達(dá)載體(PIG/3C-TNFR1BP)構(gòu)建將提取的質(zhì)粒pIG/3C經(jīng)BamHI和Kpnl酶切后以低熔點瓊脂糖電泳回收目的片段。利用合成的TNFR1封閉肽基因兩端的酶切粘性末端序列，與pIG/3C經(jīng)BamHI和Kpnl酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)。取連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)Mcl061，挑選6個氨芐和四環(huán)素抗性的菌落，小量法提取質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，長波紫外燈下觀察。結(jié)果圖8所示3號克隆酶切產(chǎn)物在泳道上可見一大小約為90bp的酶切片段，其分子量與插入的目的基因片段大小相符(泳道3)。4.5重組載體pIG/3C-TNFRlBP導(dǎo)入C0S7細(xì)胞采用Lipofectin2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)(參閱其產(chǎn)品說明書)。取對數(shù)生長期的C0S7細(xì)胞，使90X長滿。實驗前，在12X75mm無菌玻璃管內(nèi)制備下列溶液SolutionA:10ng質(zhì)粒DNA(pIG/3C、pIG/3C-TNFRlBP)溶于50ii1的OPTI-MEMI無血清培養(yǎng)基中；SolutionB:2ii1Lipofectin加入50ii1OPTI-MEMI培養(yǎng)基中，充分混勻，室溫放置5min;合并SolutionA和SolutionB，混勻，室溫下放置20min，以便形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加脂質(zhì)體-DNA混合液。5%C02，37°C培養(yǎng)；分別在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h和120h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測。4.6ELISA檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc的表達(dá)以羊抗人IgG(2ug/ml，100ul)包被酶標(biāo)板，4t:24小時，分別加入不同稀釋濃度的IgG標(biāo)準(zhǔn)品、PIG/3C-TNFR1BP轉(zhuǎn)染各時段收集上清、未轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞培養(yǎng)上清，4t:過夜，PBS-T洗板X3，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgGFc抗體(1:2000)，37°Clh，PBS-T洗板X3，然后加入顯色液，室溫5min，2mol/LH2S04終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定D490。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pIG/3C-TNFRlBP轉(zhuǎn)染上清中可見人IgG蛋白表達(dá)；而未轉(zhuǎn)染上清中IgG表達(dá)為陰性。提示轉(zhuǎn)染pIG/3C-TNFRlBP的真核細(xì)胞表達(dá)TNFR11封閉肽-hlgGFc融合蛋白。根據(jù)IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的結(jié)果圖9，可見在各組重組體轉(zhuǎn)染上清中均有一定量融合蛋白表達(dá)，其中轉(zhuǎn)染48h上清中融合蛋白表達(dá)量最高(8.6g/ml)，后續(xù)實驗中收集轉(zhuǎn)染上清時間均為轉(zhuǎn)染后48小時。4.7Western印跡鑒定融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFcSDS-PAGE采用垂直板不連續(xù)凝膠電泳法。常規(guī)灌制12X分離膠和5X濃縮膠，取重組載體轉(zhuǎn)染上清和未轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞培養(yǎng)上清和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)以每孔20ul加樣，80v電泳至分離膠，120V繼續(xù)電泳6小時，考馬斯亮藍(lán)染色。Western印記SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取下凝膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜(200mA，4°C，1小時)，3%脫脂奶粉-吐溫封閉過夜，PBS-T漂洗X3，每次10分鐘，加入HRP-羊抗人IgG抗體(1:5000稀釋)，37t:30分鐘，顯影。結(jié)果見圖10。實施例5融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc生物學(xué)活性鑒定5.1間接免疫熒光法檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc與TNFR1的結(jié)合在預(yù)先鋪入六孔板中每孔加入L929細(xì)胞1X106個，371:，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞均勻貼壁。分別加入融合蛋白上清、空載體轉(zhuǎn)染上清和合成TNFR1封閉肽37t:作用2小時，經(jīng)固定、封閉后加入兔抗人抗TNFR1—抗(1:100)，4t:過夜，加入FITC標(biāo)記羊抗兔二抗(i:100)，37t:避光孵育ih，再以甘油封片熒光顯微鏡下觀察并照相。結(jié)果見圖ii所示陽性對照組即只加入一抗(兔抗人TNFR1抗體)和二抗(FITC-羊抗兔IgG)作用，L929細(xì)胞表面TNFR1與相應(yīng)抗體結(jié)合，表現(xiàn)為強熒光(圖llb)，而加入含融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc的細(xì)胞培養(yǎng)上清、合成TNFR11封閉肽則表現(xiàn)為熒光著色的細(xì)胞明顯減少(圖llc和d)，僅加入pIG/3C轉(zhuǎn)染空載體上清的則未見任何抑制性效應(yīng)(圖lle)。此結(jié)果提示融合蛋白、合成TNFR11封閉肽能夠特異性識別L929細(xì)胞上表達(dá)的TNFR1，從而競爭性抑制抗TNFR1抗體與該細(xì)胞上的TNFR1結(jié)合。5.2流式細(xì)胞術(shù)檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc與TNFR1的結(jié)合將分別以融合蛋白上清、空載體轉(zhuǎn)染上清和合成TNFR1封閉肽作用后的L929細(xì)胞以常規(guī)方法先后加入加入兔抗人TNFR1—抗(1:100)和FITC標(biāo)記羊抗兔二抗(1:IOO)，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況。結(jié)果如圖12所示與只加入FITC標(biāo)記二抗空白對照組圖12a相比，加入轉(zhuǎn)染空載體上清的熒光陽性細(xì)胞率顯著增高至99.12%，提示其無受體拮抗作用；但加入轉(zhuǎn)染融合蛋白重組載體上清和合成受體封閉肽的熒光陽性細(xì)胞率均明顯降低，其中融合蛋白拮抗率為77.74%;合成TNFR1封閉肽拮抗率為69.75%。提示兩種封閉肽均可競爭性抑制抗TNFR1抗體與TNFR1的結(jié)合，從而使熒光陽性細(xì)胞率下降。5.3細(xì)胞毒抑制實驗檢測融合蛋白對TNF-a胞毒效應(yīng)的抑制作用以L929為靶細(xì)胞，先分別加入融合蛋白、合成TNFR1封閉肽及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清37t:作用2h，再加入sTNF，并設(shè)一組只加sTNF標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。sTNF標(biāo)準(zhǔn)品的含量為15u/孔，細(xì)胞數(shù)為2X104/孔/100ii1DMEM培養(yǎng)基，10yg/yl放線菌素D(ACT-D)10y1/孔，每個樣品設(shè)3復(fù)孔。5%C02，37。C培養(yǎng)24h后，加5mg/mlMTT10y1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔100ylDMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測0D570nm值。結(jié)果如圖13所示融合蛋白、合成TNFR1封閉肽均可抑制TNF-a的胞毒效應(yīng)，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。其中，合成TNFR1封閉肽的胞毒抑制率可達(dá)62.63%(圖13a)，在50X抑制率時的濃度為約liig/ml(圖13c);而融合蛋白的抑制率最高為73.51%(圖13c)，在50%抑制率時的濃度為0.47iig/ml(圖13c)。5.4融合蛋白對TNF-a誘導(dǎo)人單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子mRNA水平的影響采用TR-PCR方法檢測促炎細(xì)胞因子IL-113、IL-8mRNA水平，具體方法同實施例2.2。IL_8的引物Pl:5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAA-3，，P2:5'-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA_3，，擴增片段長約250bp。結(jié)果如圖14a所示TNF-a剌激的單核細(xì)胞可見一條強的IL_1PcDNA特異性條帶(600bp)(泳道2);而靜止單核細(xì)胞則有少量IL-113mRNA表達(dá)(泳道2)，應(yīng)用融合蛋白(泳道3)、合成封閉肽(泳道4)所出現(xiàn)的IL-iPcDNA條帶明顯減弱，加入轉(zhuǎn)染空載體上清的單核細(xì)胞IL-113PCR產(chǎn)物條帶的亮度與TNF剌激組相似(泳道5)。通過密度掃描進(jìn)行相對定量(圖13b)，證實融合蛋白的抑制率為70.9%;合成封閉肽的抑制率為59.26%。提示兩種封閉肽均可有效阻斷TNF誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)IL-113mRNA。與IL_1PRT-PCR結(jié)果相似，各組封閉肽作用后，IL-8RT-PCR電泳條帶與陽性對照(TNF-a剌激組，圖15a泳道1)相比明顯減弱，通過密度掃描進(jìn)行相對定量(圖15b);融合蛋白的抑制率為68.67%;合成封閉肽的抑制率為58.47%。提示兩種封閉肽也可有效抑制TNF誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)IL_8mRNA。5.5激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對TNF-a誘導(dǎo)人單核細(xì)胞NF_kB核轉(zhuǎn)位的影響分離人單核細(xì)胞分別加入融合蛋白(8.6iig/ml)、合成封閉肽(8.6iig/ml)、于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)作用2h;加入TNF-a(150u/ml)繼續(xù)作用30min;70%冰乙醇-2(TC固定24h，加入100ill含2iig的兔抗人NF-kB抗體，室溫孵育2h，加入100y1羊抗兔FITC標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育30min;加入10illPI(50yg/ml)，室溫避光孵育30min;置于載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。PI將胞核染為紅色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗體可將NF-kB染為綠色。結(jié)果見圖16所示TNF-a可誘導(dǎo)單核細(xì)胞NF-kB從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核，因為胞核區(qū)出現(xiàn)黃色斑點(圖16a)，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清組亦見明顯NF-kB轉(zhuǎn)位(圖16d);合成短肽(圖16b)和TNFRlBP/hlgFc融合蛋白(圖16c)處理的單核細(xì)胞胞漿呈綠色，而胞核呈紅色，胞核邊緣有少量黃色斑點，提示兩種封閉肽可有效抑制TNF誘導(dǎo)的NF-kB核轉(zhuǎn)位。實施例6融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc對高脂高糖誘導(dǎo)的大鼠II型糖尿病的治療作用6.1大鼠肥胖和胰島素抵抗模型的制備和、實驗分組和樣品的采集雄性Wistar大鼠，4周齡，體重110130g，首先隨機分為正常飲食(normaldiet,ND)組和高脂高糖飲食(highfatandsucrose,HFS)組。HFS中含而20%重量/重量的豬油(33%的能量)，24.5%重量/重量的蔗糖(20%的能量)。飼養(yǎng)16周后，將HFS組再隨機分為3組，共4組，在繼續(xù)給予原來的飼料基礎(chǔ)上，每組8只，分別經(jīng)尾靜脈給予0.lml的生理鹽水或O.lml的生理鹽水中含500iig的融合蛋白或含500iig的Fc蛋白，即ND組、HFS組、HFS+融合蛋白組和HFS+Fc蛋白組等共4組。每周給藥2次，連續(xù)4周?？傮w重、空腹血糖和胰島素的檢測均在禁食16h后進(jìn)行。實驗結(jié)束后(共飼養(yǎng)20周)，在麻醉下經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，并收集肝臟、腎臟、胰腺、股四頭肌和附睪的脂肪墊等，所有器官和組織分裝后凍存于液氮中。6.2高脂高糖誘導(dǎo)大鼠肥胖和胰島素抵抗糖耐量和胰島素耐量試驗都在大鼠禁食24h后清醒狀態(tài)下進(jìn)行。經(jīng)腹腔注射3.Og/kg體重的糖或1IU/kg豬胰島素(Sigma)后，在不同時間點剪尾巴采血，用One-TouchProfile血糖計測血糖(Lifescan，Inc.，Milpitas，CA);血清的胰島素和C反應(yīng)蛋白水平采用雙抗體包被試管RIA試劑盒檢測(chemclin，Inc.，Beijing,China)。其具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行?？谷说囊葝u素抗體和C反應(yīng)蛋白抗體都與大鼠有交叉反應(yīng)。胰島素抵抗采用穩(wěn)態(tài)模型指數(shù)(HomoeostasisModel12Assessmentlndex，HOMA-IR)進(jìn)行評價，其計算公式為HOMA-IR=空腹胰島素(PIU/ml)X空腹血糖(mrno1/1)/22.5。血漿甘油三酯和總膽固醇采用commerciallyavailablecolorenzymaticassays檢測(SigmaandWakoPureChemicalindustriesLtd.，Richmond,VA)。結(jié)果顯示HFS喂養(yǎng)4周后大鼠體重開始以每月增長1.4倍的速度增加，與同期的生理鹽水組比較體重增加18%(如圖17A)(P<0.05)，同時，血漿的胰島素水平顯著增加，并且隨HFS喂養(yǎng)的時間延長而增加(如圖17C)以便維持正常的血糖水平(如圖17B)，然而，HOMA-IR在給予HFS喂養(yǎng)8周后就顯著高于AD組(如圖17D)，提示HFS能誘導(dǎo)大鼠肥胖相關(guān)的胰島素抵抗。6.3融合蛋白能抑制高糖和高脂誘導(dǎo)的大鼠肥胖給HFS喂養(yǎng)的大鼠經(jīng)尾靜脈注射融合蛋白TNFR1-Fc治療4周后，可使其體重較NS處理的大鼠(HFS組)下降26X，而Fc蛋白處理并不影響其體重(如圖18A);HFS+融合蛋白組的附睪脂肪墊重量較HFS組顯著減少(P<0.05)(圖18B)，但HFS組的附睪脂肪墊重量較HFS+Fc組低；同樣地，脂肪組織HE染色也顯示HFS+融合蛋白組的脂肪細(xì)胞大小明顯小于HFS組，HFS組和HFS+Fc組的脂肪細(xì)胞大小顯著大于正常組(圖18C);另外，其他組織如肝臟、腎臟和胰腺等器官的重量無改變(結(jié)果未顯示)。提示融合蛋白能減少脂肪的沉積、減輕體重。采用commerciallyavailablecolorenzymaticassays(SigmaandWakoPureChemicalindustriesLtd.,Richmond,VA)檢測大鼠血漿甘油三酯和總膽固醇，結(jié)果顯示HFS+融合蛋白組的甘油三酯顯著低于HFS組和HFS+Fc組(圖18D)，但血漿總膽固醇水平在各組之間無顯著差異(結(jié)果未顯示)。6.4融合蛋白能提高外周胰島素敏感性因為肥胖與胰島素抵抗密切相關(guān)，而脂肪組織中的TNF-a是影響胰島素活性的主要因素，因此我們進(jìn)一步研究了在肥胖狀態(tài)下TNF-a對糖耐量和全身胰島素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個實驗過程中各實驗組大鼠空腹血糖在均基本保持在正常水平(圖19A)。相反，HFS組和HFS+Fc組的空腹胰島素水平(圖19B)和C反應(yīng)蛋白(圖19C)在HFS飲食喂養(yǎng)20周后較正常ND組增加達(dá)2倍(p<0.01)，胰島也代償性肥大(圖19E);而融合蛋白能抑制HFS飲食誘導(dǎo)的空腹胰島素水平和C反應(yīng)蛋白增高，其抑制率達(dá)50%(p〈0.05)，也能使胰島保持在中等大小。這種在血糖水平正常的情況下血清胰島素水平升高的現(xiàn)象是因為肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的一個代償性反應(yīng)，因此，HFS+融合蛋白的HOMA-IR較HFS組和HFS+Fc組的顯著降低(圖19D)，提示融合蛋白能有效抑制肥胖相關(guān)的胰島素抵抗。為了檢測融合蛋白是否直接抑制胰島素抵抗，我們進(jìn)行了腹膜內(nèi)糖耐受和胰島素耐受試驗。結(jié)果各組大鼠的血糖在注射30min后能達(dá)到最高水平，然后緩慢下降。其中，HFS組在30-120min之間的血糖水平較ND組顯著增高(圖20A)，同樣地，對胰島素的低血糖反應(yīng)較ND組顯著降低(圖20B)，但與Fc蛋白相比，融合蛋白在給予胰島素后能顯著加強低血糖對胰島素的反應(yīng)(P<0.05)，注射葡萄糖后能較快地降低血糖水平(p<0.05)，提示融合蛋白能增加胰島素的敏感性。6.5融合蛋白對局部和全身TNF-a產(chǎn)生的影響為了進(jìn)一步研究融合蛋白對TNF-a的影響，我們首先采用ELISA方法檢測了大鼠血液中的TNF-a，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFS飼養(yǎng)的大鼠血清中TNF-a的含量較較ND組高2.4倍，但融合蛋白能逆轉(zhuǎn)血清中TNF-a水平，使之接近于正常ND組水平(圖21D)。有趣的是在脂肪組織局部TNF-a的含量顯著高于全身。采用免疫組織化學(xué)檢測附睪的脂肪組織和胰腺組織里TNF-a的表達(dá)情況，其具體步驟為將上述組織用4%的多聚甲醛固定后行石蠟切，然后將石蠟切片脫蠟至水后與1:200兔抗大鼠TNF-a多克隆抗體(一抗)(北京中山生物技術(shù)公司)在室溫孵育lh，用PBS洗滌5次，然后與生物素標(biāo)記的二抗(1:200)在室溫孵育lh，再用PBS洗3次后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素孵育0.5h，洗滌，然后加底物DAB顯色5min，洗滌鏡檢。結(jié)果顯示棕色顆粒主要分布在胰腺的胰島(圖21A)和脂肪組織的脂肪細(xì)胞膜上(圖21B)，其中HFS組大鼠的胰島和脂肪細(xì)胞中TNF-a的表達(dá)量顯著高于ND組；另外，HFS組的附睪脂肪組織墊的組織勻漿上清中的TNF-a也顯著高于ND組(圖21C)，與Fc蛋白相比，融合蛋白處理后幾乎可以完全抑制胰島和脂肪組織中TNF-a的表達(dá)。6.6融合蛋白對IRS酪氨酸磷酸化的影響IRS-1的酪氨酸磷酸化是其激活下游信號通路的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而TNF-a就是通過干擾胰島素受體的信號參與胰島素抵的。為了研究融合蛋白增加胰島素敏感性的機制，我們采用免疫共沉淀-Westernblotting方法檢測了IRS-1中酪氨酸的磷酸化水平。其簡單步驟為禁食一晚上后，腹腔注射1IU/kg豬胰島素或等體積的生理鹽水，30min后，麻醉大鼠，取其股四頭肌、肝臟、附睪脂肪組織，在4。C條件下用組織勻漿緩沖液(1%TritonX_100，10mMEDTA，lOOmMsodiumfluoride,10mMsodiumvanadate，lOOmMsodiumpyrophosphate,50mMH印es，pH7.4，ImMphenylmethylsulfonylfluoride，0.Olmg/mlleup印tinand0.Olmg/ml即rotinin)制成組織勻漿，12，000g離心15min，收集上清，測定其蛋白質(zhì)含量。取lmg的抽提蛋白與lmg/ml的兔抗鼠胰島素受體底物_1(i固linrec印torsubstrate1，IRS-l)抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz.CA)在4"C孵育過夜，然后再向此免疫復(fù)合物中加入50蛋白A-瓊脂糖凝膠CL-4B珠子(AmershamPharmaciaBiotech)，繼續(xù)在4。C孵育lh后，用RIPA緩沖液(0.15MNaCl/10mMphosphatebuffer,pH7.0，1%NonidetP_40，l%sodiumdeoxycholate，O.1%SDS)洗35次，加上上樣緩沖液，煮沸后上樣進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將此膜用TBS(20mMTris-Hcl，pH8.00.15MNacl)配制的5%無脂奶粉于4。C封閉過夜后，用1:1000稀釋的抗磷酸化酪氨酸激酶p-Tyr單抗(PY99)(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz.CA)，或用l:1000稀釋的抗IRS-1的多克隆抗體于4t:與膜孵育過夜，TBST(TBSwith0.05%Tween-20)洗滌3次，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:10000)(北京中山生物技術(shù)公司)孵育30min后，用增強化學(xué)發(fā)光劑現(xiàn)示測定蛋白質(zhì)的條，并用激光密度測定儀進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶的定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有用胰島素剌激時，各實驗組所有組織中都檢測不到IRS-1的酪氨酸的磷酸化，一旦用胰島素剌激后30min，正常ND組的肌肉、脂肪和肝臟組織中的IRS-1的酪氨酸磷酸化水平迅速而明顯升高(圖22A)，而HFS組和HFS+Fc組的酪氨酸磷酸化水平顯著被抑制，與ND相比，其抑制率在脂肪組織中約為80%、肌肉組織中約68%、肝臟中約為32%(圖22B)。用融合蛋白阻斷TNF-a和TNFR1的作用后能顯著促進(jìn)胰島素剌激的IRS-1酪氨酸的磷酸化，與ND相比，肌肉組織的磷酸化水平可提高了84.7%，在脂肪組織中提高了92.7%，但在肝臟組織的變化不明顯。二、TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)與TNFR1封閉肽(環(huán)9肽)實施例7TNF結(jié)合肽和TNFR1封閉肽的篩選及其特異性鑒定7.1噬菌體肽庫的篩選:參照NewEnglandBiolandBiolabs說明書，分別以0.1MNaHC03(pH8.6)包被液稀釋人重組TNF-a和人重組TNFR1I蛋白為誘餌包被30X15mm塑料培養(yǎng)皿，同時設(shè)空白對照，4°C過夜，0.5%BSA封閉，4°C2h，加肽庫(2.0X1011個噬菌體克隆/10iU)，室溫作用lh，洗去未結(jié)合的噬菌體(此噬菌體稱為無關(guān)噬菌體，作為后續(xù)實驗的陰性對照)，用0.2M甘氨酸-鹽酸洗脫液解離已經(jīng)與誘餌蛋白結(jié)合的噬菌體，侵染ER2738菌，擴增并用PEG提取噬菌體，用于下一輪篩選。共進(jìn)行三輪篩選，逐輪降低誘餌蛋白的濃度及其與肽庫作用時間，增加洗滌緩沖液中Tween-20濃度，以便得到親和力高、特異性強的噬菌體克隆。經(jīng)三輪篩選后隨機挑選噬菌體單斑擴增，PEG/NaCl沉淀，最后用200ii1TE溶解噬菌體，分別得到能與TNF-a結(jié)合的"TNF-a結(jié)合噬菌體"和能與TNFR1I結(jié)合的"TNF受體封閉噬菌體"。結(jié)果，經(jīng)三輪篩選后，噬菌體的回收率均能逐步上升，說明篩選所得到的特異性噬菌體克隆有較高程度的富集，最后第三輪洗脫下的噬菌體比第一輪篩選得到的產(chǎn)量均高出100多倍(表略)。7.2細(xì)胞毒抑制實驗取上述三輪篩選后隨機挑選并擴增的噬菌體克隆，借助其能否抑制S-TNF-a殺傷L929細(xì)胞或/和U937細(xì)胞的"細(xì)胞毒抑制實驗"進(jìn)行篩選。基本方法取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞或U937細(xì)胞(5X104)為靶細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板中，同時加入噬菌體克隆，每孔終體積均為100iil，置37t:、5^C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1618h后，每孔加入MTT10ul(終濃度為0.5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心1000rpm，10min，棄上清，每孔加入100iilDMSO，待甲月替完全溶解(室溫放置15min)后，用酶標(biāo)儀測其OD570nm值(630nm校準(zhǔn))。實驗分組①TNF結(jié)合噬菌體組TNF結(jié)合噬菌體(終濃度為106pfu/10ul)預(yù)先與TNF-a(終濃度為50U/ml)混合，37。C孵育30min后加入到靶細(xì)胞懸液中；②TNFR1封閉噬菌體組TNFR1封閉噬菌體(終濃度為1012pfu/10ul)預(yù)先與U937細(xì)胞混合，37t:孵育30min后加入TNF-a(終濃度為50U/ml)。③聯(lián)合噬菌體組將上述兩種噬菌體各減半量，分別與TNF-a和耙細(xì)胞孵育30min后再混合培養(yǎng)；同時，設(shè)空白組、TNF-a組(陽性對照組)及無關(guān)噬菌體組作陰性對照。細(xì)胞死亡率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)X100%細(xì)胞毒抑制率=[1-噬菌體/TNF組細(xì)胞殺傷率/TNF組細(xì)胞殺傷率]X100%結(jié)果以TNF-a為靶蛋白，從第三輪篩選的洗脫物中隨機挑選并擴增39個克隆，以小鼠成纖維細(xì)胞株L929為TNF-a的靶細(xì)胞，并設(shè)無關(guān)噬菌體克隆為陰性對照，根據(jù)噬菌體是否能抑制TNF-a細(xì)胞毒效應(yīng)(即細(xì)胞毒抑制實驗)，粗步篩選到5個具有拮抗TNF-a作用的噬菌體克隆(其編號為5、6、7、32及38)，并稱之為"TNF結(jié)合噬菌體";用細(xì)胞毒效應(yīng)篩選TNFR1封閉噬菌體以TNFR1為耙蛋白，從第三輪篩選的洗脫物中隨機挑選并擴增37個噬菌體克隆，分別觀察它們對TNF-a細(xì)胞毒效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示有2個克隆不僅對靶細(xì)胞無細(xì)胞毒作用，而且能明顯抑制TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，即為"TNFR1封閉噬菌體"，其編號為X2、X4(圖23)。然后，以同樣的方法選擇人單核細(xì)胞株U937作為TNF-a的靶細(xì)胞，進(jìn)一步觀察上述各TNF結(jié)合噬菌體和各TNFR1封閉噬菌體對不同濃度TNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，滴度為106pfu/ii1的TNF結(jié)合噬菌體和滴度為1012pfu/1y1的TNFR1封閉噬菌體幾乎可完全阻斷50U/ml的TNF-a(殺傷率約為20%)對U937的胞毒效應(yīng)；當(dāng)TNF-a濃度增加到100U/ml(殺傷率約為30%)時，各個噬菌體克隆的細(xì)胞毒抑制率雖然較前者顯著下降(P<0.01)，但仍然有50%左右的抑制率；當(dāng)TNF-a濃度增加到200U/ml(殺傷率約55X)時，各個噬菌體克隆的細(xì)胞毒抑制率進(jìn)一步顯著下降(P<0.01)，只有6、7、32、38及X4號還有10%左右的抑制率。提示TNF結(jié)合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體的競爭性抑制效果隨著TNF-a濃度的增高而減弱(圖24)為了進(jìn)一步觀察TNF結(jié)合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體是否具有協(xié)同作用，將其滴度減半，觀察兩種噬菌體聯(lián)用對100U/ml的TNF-a(殺傷率約為30%)的影響。結(jié)果顯示X4與32號、X4號與38號聯(lián)用的細(xì)胞毒抑制效應(yīng)均較其單獨作用的效果好，但其中X4與38號聯(lián)用的抑制率達(dá)85.3%，顯著高于各自單獨的抑制作用(P〈0.01)，也顯著高于X4與32號噬菌體聯(lián)用的抑制率(P<0.01)。提示TNF結(jié)合噬菌體(38號)和TNFR1封閉噬菌體(X4號)聯(lián)用具有協(xié)同抑制作用。7.3ELISA鑒定噬菌體克隆的特異性。分別取含50yg/ml人重組TNF-a蛋白和TNFR11蛋白的包被液包板，0.5%BSA封閉，分別加入上述TNF結(jié)合噬菌體和TNF受體封閉噬菌體(4倍倍比稀釋噬菌體10122X105)，室溫孵育2h;加入HRP標(biāo)記的抗-M13抗體(1:5000)室溫孵育lh后用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，在波長405-415nm下讀取0D值。用無關(guān)噬菌體做陰性對照。結(jié)果5個TNF結(jié)合噬菌體克隆和2個TNFR1封閉噬菌體克隆分別能與hrTNF重組蛋白和hrTNFRl重組蛋白特異性結(jié)合而顯色，而無關(guān)噬菌體克隆(陰性對照)與空白對照則不顯色，提示TNF結(jié)合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體分別具有結(jié)合TNF-a和TNFR1的特異性(圖25)7.4RT-PCR檢測TNFR1封閉噬菌體對TNF-a誘導(dǎo)U937細(xì)胞IL-1PmRNA水平的影響，具體方法同實施例2.2。結(jié)果顯示X2、X4本身不能促進(jìn)IL-iPmRNA轉(zhuǎn)錄，但能抑制TNF-a誘導(dǎo)IL-1PmRNA的轉(zhuǎn)錄，其中X4的抑制率達(dá)50%。提示TNFR1封閉噬菌體與U937細(xì)胞膜表面的TNFR1結(jié)合后，本身無受體激活作用，但能有效阻止TNF-a與TNFR1結(jié)合，從而阻斷其生物學(xué)效應(yīng)。因此，TNFR1封閉噬菌體展示的環(huán)肽可能為較理想的TNFR1拮抗劑。(圖26)7.5DNA序列分析和多肽合成根據(jù)上述實驗結(jié)果，挑取TNF結(jié)合噬菌體克隆5、6、7、32、38號和TNFR1封閉噬菌體克隆X2、X4號及無關(guān)噬菌體克隆進(jìn)行DNA測序。結(jié)果顯示5個TNF結(jié)合噬菌體展示肽和2個TNFR1封閉噬菌體展示肽的氨基酸序列與天然的TNF-a和TNFR1的氨基酸序列均無同源性。選擇對TNF-a生物學(xué)功能具有較強抑制效應(yīng)的32、38和X4號噬菌體克隆，根據(jù)其展示肽的序列合成環(huán)肽實施例8TNF結(jié)合肽和TNFR1封閉肽的生物學(xué)特性及功能檢測以下TNF結(jié)合肽(TBP)與TNFR1封閉肽(TRBP)均由西安美聯(lián)合成并環(huán)化(即環(huán)9肽)。8.1GFP-TNF融合蛋白競爭結(jié)合實驗檢測TBP和TRBP的特異性取無菌蓋玻片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入1X106/ml對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，置37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，制作細(xì)胞爬片，用1%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗細(xì)胞；同時加入GFP-TNF融合蛋白(3yg/ml)和TBP或TRBP(3yg/ml)，置4°C過夜；用PBS沖洗玻片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。另外，取lX106/ml對數(shù)生長期的U937細(xì)胞用1%多聚甲醛固定后，加入GFP-TNF蛋白和合成環(huán)肽(3iig/ml)，置4t:過夜上流式細(xì)胞儀檢測熒光。結(jié)果顯示合成多肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細(xì)胞膜上TNFR1結(jié)合。其中，TBP(P印.38)與TRBP(p印.X4)聯(lián)用的抑制效果最好，能使U937細(xì)胞結(jié)合GFP-TNF熒光蛋白的陽性細(xì)胞率降低50%，也能顯著減少L929細(xì)胞膜上的熒光強度(圖27)。提示人工合成的TBP和TRBP仍具有結(jié)合TNF-a和TNFR1的特異性。8.2非變性聚丙烯凝膠電泳檢測TBP與TRBP二者的互補結(jié)合性質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示TBP(p印.38)與TRBP(p印.X4)的分子量分別為1102.21和1203.96。理論上，如果二者能互補結(jié)合，其分子量應(yīng)為2300以上，在20%的非變性聚丙烯凝膠中其蛋白條帶應(yīng)在二者單獨電泳的條帶之后。非變性聚丙烯凝膠電泳與變性的聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)的過程完全相同，所不同的是上樣緩沖液中不加巰基乙醇、其他工作液中均不加十二烷基磺酸鈉(SDS)。本實驗使用的是20%分離膠和3.75%濃縮膠。取細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640溶解TBP(p印.38)與TRBP(p印.X4)(2mg/ml)，將p印.38和p印.X4等體積混合后，置37。C溫箱中孵育3045min后取出，加入等體積的2X上樣緩沖液，混勻，取15ul上樣電泳，同時設(shè)p印.38和p印.X4對照。電泳完畢后取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色4h，再用脫色液脫色2h，脫色過程中隨時觀察蛋白條帶顏色深淺的變化，并拍照。結(jié)果顯示無論p印.38和p印.X4單獨電泳還是二者混合孵育后電泳，三者條帶均在同一直線上，并無任何滯后條帶出現(xiàn)，提示二者混合不會發(fā)生互補結(jié)合。(圖28)8.3TBP與TRBP對TNF-a胞毒效應(yīng)的抑制作用為了檢測人工合成環(huán)肽是否象噬菌體展示環(huán)肽一樣有效，故觀察TBP和TRBP能否抑制TNF-a對U937細(xì)胞的胞毒效應(yīng)。方法同實施例7.2。實驗分組①TBP組各種濃度的TBP預(yù)先與TNF-a(終濃度為50U/ml)混合，37t:孵育30min后加入到靶細(xì)胞懸液中；②TRBP組各種濃度的TRBP預(yù)先與U937細(xì)胞混合，37t:孵育30min后加入TNF-a(終濃度為50U/ml)。③聯(lián)合多肽組將上述兩種多肽各減半量，分別與TNF-a和靶細(xì)胞孵育30min后再混合培養(yǎng)；同時，設(shè)空白組、TNF-a組(陽性對照組)及無關(guān)多肽組作陰性對照。結(jié)果顯示為了檢測人工合成環(huán)肽是否象噬菌體展示環(huán)肽一樣有效，故觀察TBP和TRBP能否抑制TNF-a對U937細(xì)胞的胞毒效應(yīng)(圖3)。結(jié)果顯示TBP與TRBP對TNF-a的細(xì)胞毒效應(yīng)均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，當(dāng)劑量增加到10yg/ml時，抑制效果最好。此外，將TBP與TRBP聯(lián)用(即p印.38+X4)，其各個劑量的細(xì)胞毒抑制率均顯著高于各自單獨作用的抑制率(P<0.01)。(圖29)8.4NBT還原法檢測TBP與TRBP對外周血單核細(xì)胞的影響方法同實施例2.1。TNF-a由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，又能參與巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞對IFN-y的敏感性，增強其呼吸爆發(fā)，促進(jìn)其吞噬功能，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如IL-l、IL-8等產(chǎn)生。故本發(fā)明首先觀察TBP和TRBP在體外對TNF-a誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時給予外源性IFN-y和TNF-a(各5ng/ml，5U/ml)較之二者單獨作用更能明顯激活單核細(xì)胞，表現(xiàn)為呼吸爆發(fā)功能顯著增強。TBP和TRBP聯(lián)用能有效抑制TNF-a和IFN-y誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)強度，使反應(yīng)體系中NBT還原能力減弱，OD值顯著降低(其抑制率為56.25%)(圖30)。8.5RT-PCR檢測TBP和TRBP對TNF-a誘導(dǎo)U937細(xì)胞IL-1PmRNA水平的影響，具體方法同實施例2。RT-PCR產(chǎn)物條帶掃描顯示其對IL-IP和IL-8mRNA轉(zhuǎn)錄抑制率為55.10%和52.53%。這些結(jié)果表明TBP和TRBP可通過競爭性抑制TNF-a與TNFR1的結(jié)合，降低單核細(xì)胞對IFN-y的敏感性，從而抑制單核細(xì)胞的活化(圖31)。實施例9TBP和TRBP對TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用9.l大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型制備、動物分組及取材取wistar大鼠，術(shù)前禁食24h，自由飲水，乙醚輕微麻醉后，用硬膜外麻醉導(dǎo)管經(jīng)肛門輕緩地插入8cm，深達(dá)結(jié)腸，然后注射TNBS(50mg/kg體重)乙醇溶液(5%TNBS溶液與等體積無水乙醇混合)。本實驗36只大鼠隨機分為6組，各實驗組TNBS乙醇溶液灌腸后12h內(nèi)經(jīng)灌胃給藥，1ml/只/天，連續(xù)6天。具體分組①正常對照組，僅生理鹽水處理；②模型組(非用藥組)組；③無關(guān)多肽組，取無關(guān)環(huán)肽(2.5mg/kg/次)對照處理；④聯(lián)合多肽治療組，取等量混合的TNF結(jié)合環(huán)肽和TNFR1封閉環(huán)肽(總劑量2.5mg/kg/次)治療；⑤抗TNF抗體治療組取抗TNF多克隆抗體(10mg/kg/次)治療；5-氨基水楊酸治療組TNBS取Pentasa(100mg/kg/次)治療。實驗前后稱量大鼠體重，處理6天后，摘眼球取血，隨后解剖，取肛門至盲腸腸管(約8-10cm)，沿腸系膜縱軸剪開，用冷生理鹽水沖洗干凈后進(jìn)行肉眼大體形態(tài)學(xué)評分，然后，一部分結(jié)腸標(biāo)本放入10%的甲醛溶液中固定24h進(jìn)行常規(guī)石蠟組織切片、HE染色、顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察評分；另一部分標(biāo)本置-8(TC凍存，用以檢測生化指標(biāo)及促炎細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果，SD雄性大鼠經(jīng)肛門灌腸給藥12h后，大鼠出現(xiàn)腹瀉、吶差、飲水量增加、毛發(fā)粗造等癥狀，一周后大鼠體重明顯下降，大體解剖可見距肛門810cm處結(jié)腸粘膜充血水腫、潰瘍形成，粘膜增厚、腸腔狹窄，結(jié)腸組織與周圍組織粘連。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)大鼠的結(jié)腸組織病變累及腸壁全層，以黏膜和黏膜下層為重，淋巴管、血管擴張，腸壁水腫，并見大量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，有兩處或多處黏膜上皮壞死脫落，形成潰瘍，有的潰瘍深達(dá)黏膜肌層(如圖32)。此結(jié)果與文獻(xiàn)報導(dǎo)的一致，說明大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型制備成功。9.2聯(lián)合多肽對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重、結(jié)腸組織病理損傷的影響結(jié)腸組織損傷大體形態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)為無潰瘍，無炎癥計O分；無潰瘍，局部水腫計1分；有潰瘍，無水腫計2分；僅一處有潰瘍與炎癥計3分；兩處或更多地方有潰瘍與炎癥計4分；潰瘍大于2cm計5分。結(jié)腸組織切片的病理損傷評分標(biāo)準(zhǔn)為無淋巴細(xì)胞浸潤，計O分；低水平的淋巴細(xì)胞浸潤計1分；中等水平的淋巴細(xì)胞浸潤計2分；高密度血管，腸壁增厚計3分；全層淋巴細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞消失，腸壁增厚計4分。本發(fā)明的結(jié)果顯示聯(lián)合多肽對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重、結(jié)腸組織病理損傷的影響各實驗組大鼠實驗前后稱量體重，結(jié)果(表3)顯示正常對照組實驗后較實驗前顯著增加(p<0.01);模型組體重實驗后較實驗前顯著下降，但多肽治療組和抗體治療、5-氨基水楊酸組一樣，其體重雖然較正常組實驗后低(P<O.Ol)，但是顯著高于模型組實驗后的體重(p<0.01)。由于TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的主要癥狀是腹瀉，脫水，導(dǎo)致大鼠體重下降，因此，此結(jié)果表明聯(lián)合多肽能改善潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。各組大鼠實驗前后的體重變化情況見表4，它顯示正常對照組大鼠的體重較實驗前顯著增長(P<0.05)，模型組和無關(guān)肽對照組實驗后的體重均有所下降，而聯(lián)合多肽治療組與抗體治療組、水楊酸組的結(jié)果一致，未見下降，其體重顯著高于模型組及無關(guān)肽對照組(P<0.05)。由于此模型為急性結(jié)腸炎，其主要癥狀為嚴(yán)重的腹瀉，多肽治療組實驗后的體重較模型組和無關(guān)肽組的高，提示其腹瀉癥狀較輕，炎癥損傷較輕。大體解剖結(jié)果顯示大鼠大體解剖結(jié)果模型組和無關(guān)肽組的大鼠結(jié)腸表現(xiàn)為粘膜充血水腫、潰瘍形成、粘膜增厚、腸腔狹窄、可見近端腸腔擴張。聯(lián)合給予TNF結(jié)合肽和TNFR1封閉肽與用抗TNF抗體及5-氨基水楊酸一樣能明顯改善大鼠結(jié)腸炎癥狀，使結(jié)腸黏膜水腫和潰瘍明顯減輕。病理學(xué)檢查的結(jié)果(見圖33)顯示大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組和無關(guān)肽組大鼠的結(jié)腸組織病變累及腸壁全層，淋巴管、血管擴張，腸壁水腫，大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，局部黏膜上皮壞死脫落，形成潰瘍，而聯(lián)合應(yīng)用TNF結(jié)合肽和TNFR1封閉肽與用抗TNF抗體及5-氨基水楊酸一樣能顯著18減輕大鼠結(jié)腸組織病理損傷，潰瘍較輕，炎性細(xì)胞浸潤較少。根據(jù)文獻(xiàn)報道的潰瘍性結(jié)腸炎病理損傷程度評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大體標(biāo)本形態(tài)學(xué)評分及組織學(xué)評分，結(jié)果(見表3)上述三個治療組的大體標(biāo)本形態(tài)學(xué)評分及組織學(xué)評分均顯著低于無關(guān)肽組和潰瘍性結(jié)腸炎對照組(P<0.05)，而三個治療組之間無顯著性差異(P>0.01)。表2.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重變化的影響(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3.各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學(xué)損傷評分(X±SD)分組大體形態(tài)評;組織學(xué)評分<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中NO活性及活性氧的影響分組NO活性(uM)抗活性氧(u/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>aP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組和無關(guān)肽組；eP<0.01VS生理鹽水表5.各種治療對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中MPO活性、NO含量及活性氧的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>aP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組和無關(guān)肽組；eP<0.01VS生理鹽水9.3聯(lián)合多肽對結(jié)腸炎大鼠血清及結(jié)腸組織中N0、活性氧和MP0的影響為了進(jìn)一步研究聯(lián)合多肽減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織病例損傷的機制，本發(fā)明檢測了各組大鼠血清和結(jié)腸組織NO含量、活性氧和結(jié)腸組織中MP0活性(檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。表4和表5顯示潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清和結(jié)腸組織NO含量和結(jié)腸組織中MPO活性均明顯升高，多肽治療組與抗體治療組、水楊酸治療組一樣，可有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠產(chǎn)生N0，因為其血清和結(jié)腸組織中NO的含量雖然仍高于正常對照組但較模型組和無關(guān)肽顯著下降(P<0.01);此外，三種治療也可明顯抑制潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中MPO的活性(P<0.01)，但對活性氧的產(chǎn)生卻無明顯影響(P>0.05)。9.4聯(lián)合多肽對結(jié)腸炎大鼠腹腔M小中TNF-a、IL_1P及IL_8的影響借助RT-PCR技術(shù)檢測聯(lián)合多肽對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腹腔M小中mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，方法同實施例？。結(jié)果見圖34。IL-IP約為600bp，IL-8約250bp，內(nèi)參照P-actin約400bp。生理鹽水對照組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的IL-IP及IL-8RT-PCR產(chǎn)物條帶(泳道1)，潰瘍性結(jié)腸炎組的IL-113及IL-8條帶明顯增粗和增亮(泳道2)，多肽治療組(泳道4)、抗體治療組(泳道5)和水楊酸組(泳道6)—樣可顯著抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-113及IL-8mRNA的水平，因為三種治療組的細(xì)胞因子RT-PCR產(chǎn)物條帶灰度掃描值都明顯減弱，與模型組和無關(guān)肽組比較具有顯著差異(P<0.01)。借助免疫組化方法檢測各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-a蛋白質(zhì)表達(dá)水平。取石蠟切片(4um)常規(guī)脫蠟、水化，置0.051檸檬酸緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，涼至室溫；3%11202孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加10%正常血清封閉非特異性抗原；傾去血清，滴加l:100稀釋的TNF-a抗體；4t:放置過夜，PBS沖洗3X5min，滴加生物素化二抗；37t:孵育10min，PBS沖洗3X5min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，37。C孵育15min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。采用圖象分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細(xì)胞，并進(jìn)行灰度掃描，每張切片隨機選取5個高倍視野(400倍)計數(shù)200個細(xì)胞。結(jié)果(圖35)顯示生理鹽水組大鼠結(jié)腸組織基本無TNF-a表達(dá)，而模型組及無關(guān)肽組可見結(jié)腸組織有明顯褐色著色，TNF-a主要表達(dá)于炎癥部位浸潤的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的胞漿和胞膜上。圖象分析結(jié)果(表6)表明，模型組大鼠結(jié)腸組織TNF-a表達(dá)的陽性密度和陽性細(xì)胞率比對照組明顯增加，多肽治療組與抗體治療組和水楊酸組一樣可使?jié)冃越Y(jié)腸炎結(jié)腸組織TNF-a表達(dá)明顯下降(P<0.01)。提示合成多肽不但能拮抗TNF-a的致炎作用，20還能抑制TNF-a本身的表達(dá)。表6.各種治療對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TNF-a蛋白表達(dá)的影響分組TNF-a表達(dá)的陽性密度TNF-cx表達(dá)的陽性細(xì)胞率生理鹽水組0.0561±0.03875.58±5.19模型組0.2252±0.0399a39.43±5.29a多肽治療組0.1491±0.0543b27.54±9.03無關(guān)肽對照組0.2682±0,048944.61±5.94b抗體治療組0.1129±0.0356b21.87±6.40b5-氨基水楊酸治療組0.1386±0.0445b26.14±7.55baP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組。序列表〈110〉華中科技大學(xué)〈120>TNF_a結(jié)合肽和TNFRl封閉肽及其在治療TNF相關(guān)疾病中的應(yīng)用〈130>1〈160>11〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>12〈212>PRT〈213>人工序列〈400>1AspHisArgProLeuTrpGlyGluSerMetValTrp1510〈210>2〈211>9〈212>PRT〈213>人工序列〈400>2CysLysHisGinTrpHisLysHisCys15〈210>3〈211>9〈212>PRT〈213>人工序列〈400>3CysLysHisAlaLeuHisArgHisCys1521〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4gataacctgctggtgtgtga<210〉5〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5cttgtgaggtgctgatgtac〈210〉6〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉6gcggatcatggtcagatcatcttctcgaa〈210〉7〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7cccaagcttcagggcaatgatcccaaagta<210〉8〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8aacggctccggcatgtgcaa〈210〉9〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9cttctgacccatgcccacca〈210〉10〈211>21〈212〉DNA20/21頁202029302020〈213〉人工序列〈400>10attt.ctgcag'ctctgtgtgaa〈210>11〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈400>11tgaattctcagccctcttcaa權(quán)利要求一種人腫瘤壞死因子TNF-α受體1封閉肽，該TNF-α受體1封閉肽為12線肽，其氨基酸序列為Asp-His-Arg-Pro-leu-Trp-Gly-Glu-Ser-Met-Val-Trp。2.—種融合蛋白，包含權(quán)利要求l所述的人TNF-a受體l封閉肽和人Fc段。3.—種編碼權(quán)利要求l所述的人TNF-a受體l封閉肽核酸分子，包含其簡并的核苷酸序列。4.一種編碼權(quán)利要求2所述的融合蛋白的核酸分子。5.—種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述序列和與之操作性連接的表達(dá)調(diào)控序列。6.—種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于它是C0S7。8.權(quán)利要求l所述的TNF-a受體l封閉肽在制備用于治療關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求2所述的融合蛋白在制備用于治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。10.—種TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)，其氨基酸序列為Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys。11.一種編碼權(quán)利要求10所述的TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。12.—種TNFRl封閉肽(環(huán)9肽)，其氨基酸序列為Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys。13.—種編碼權(quán)利要求12所述的TNF結(jié)合肽(環(huán)9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。14.權(quán)利要求10所述的TNF結(jié)合肽或/和權(quán)利要求12所述的TNFRl封閉肽在制備用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一條TNFR1封閉肽及其與人IgG1Fc段基因重組后形成的TNFR1-Fc融合蛋白。該TNFR1封閉肽為12線肽；本發(fā)明還涉及一條TNF結(jié)合環(huán)肽和一條TNFR1封閉環(huán)肽，二者均為環(huán)9肽(即C7C)；該TNFR1封閉肽、TNFR1-Fc融合蛋白、TNF結(jié)合環(huán)肽和TNFR1封閉環(huán)肽等無論在體內(nèi)還是在體外均能競爭性抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合，從而拮抗TNF-α的生物學(xué)功能，并分別在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型、高脂高糖誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型及TNBS誘導(dǎo)的實驗性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中取得較好的療效。文檔編號C07K7/00GK101747414SQ20081023689公開日2010年6月23日申請日期2008年12月19日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者何亞萍,尹丙姣,李卓婭,梁慧芳,王晶,黃麗霞申請人:華中科技大學(xué)