專利名稱：微生物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，本發(fā)明涉及微生物及其用途。更具體的，本發(fā)明涉及微生物，用于轉(zhuǎn)化為生物的系統(tǒng)，用于生產(chǎn)脂肪酸酯的方法，脂肪酸酯產(chǎn)品以及用于生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)。
背景技術：
為緩解能源危機的壓力，各國正積極地尋代可再生的替代能源。并先后開發(fā)出水能、風能、潮汐能、太陽能和生物質(zhì)能等諸多的可再生能源。但由于受環(huán)境、氣候、地理因素以及前期開發(fā)投入巨大等因素的限制，水能、風能、潮汐能、太陽能等均只能在特定的區(qū)域內(nèi)利用，難以推廣普及。生物質(zhì)能是一類以生物質(zhì)為原料，通過相應生物技術加工而成的一類清潔、環(huán)保、可再生的能源的總稱。主要包括生物乙醇、生物柴油、生物制氫以及沼氣等形式。開發(fā)生物質(zhì)能不受環(huán)境、地理因素等條件是的限制，適于工廠化生產(chǎn)、易于普及等特點。因此對生物能的開發(fā)正成為能源研究的熱點領域，競爭日趨激烈。然而，目前對于生物質(zhì)能的研究仍有待深入。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的目的在于提出一種能夠有效用于生產(chǎn)脂肪酸酯的微生物及其用途。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種微生物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼下列:?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當采用該微生物時，通過表達該微生物的基因組中所包含的外源基因，可以使該微生物過表達?；D(zhuǎn)移酶xr，從而可以利用所表達的酶催化脂酰輔酶a和外加醇類化合物兩個底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該微生物還可以具有下列附加技術特征:
在本發(fā)明的一個實施例，進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼下列的至少之一:2_酮酸脫羧酶基因或其功能等同體；乙醇脫氫酶或其功能等同體；以及脂?；o酶A還原酶/ / 基因。由此，可以有效地將在相應基因表達產(chǎn)物的作用下，將單糖轉(zhuǎn)化為醇類化合物，從而可以實現(xiàn)將單糖例如葡萄糖作為碳源，微生物依靠自身產(chǎn)生的醇類化合物和脂肪酰輔酶A合成脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異戍酷和臘酷。 在本發(fā)明的一個實施 例，進一步包括第三核酸序列以及任選的第四核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼下列:內(nèi)切葡聚糖酶基因萬67/或其功能等同體；以及β-葡糖苷酶基因或其功能等同體，所述第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。由此，可以能夠有效地利用基因所編碼的產(chǎn)物，將多糖轉(zhuǎn)化為醇類化合物，從而可以實現(xiàn)將多糖例如纖維素作為碳源，微生物依靠自身產(chǎn)生的醇類化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異戊酯和蠟酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述?；D(zhuǎn)移酶基因編碼SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提聞酸基轉(zhuǎn)移酶J/1基因表達廣物的酶活性，從而進一步提聞利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述?；D(zhuǎn)移酶基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提聞酸基轉(zhuǎn)移酶J/1基因編碼表達廣物的效率，從而進一步提聞利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述2-酮酸脫羧酶基因編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高2-酮酸脫羧酶基因表達產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述2-酮酸脫羧酶基因具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高2-酮酸脫羧酶基因編碼表達產(chǎn)物的效率，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述乙醇脫氫酶4/ 編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高乙醇脫氫酶4^/￡ 基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述乙醇脫氫酶4/ 具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提聞乙醇脫氣酶基因編碼表達廣物的效率，從而進一步提聞利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提聞內(nèi)切匍聚糖酶基因編碼廣物的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從具有SEQ ID NO:10所示的核昔酸序列。由此，可以進一步提聞內(nèi)切匍聚糖酶基因EGII表達廣物的效率，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述β -葡糖苷酶基因沒-ffi編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高葡糖苷酶基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高葡糖苷酶基因編碼產(chǎn)物的效率，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。
在本發(fā)明的一個實施例，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。

在本發(fā)明的一個實施例，所述脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼產(chǎn)物的效率從而進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。由此，可以進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。由此，可以進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為酵母。由此，可以進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為畢赤酵母。由此，可以進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個 實施例，所述微生物為大腸桿菌。由此，可以進一步提高利用該微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼下列:?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體。由此，利用該系統(tǒng)可以有效地將外源基因?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體引入微生物細胞中，從而獲得前面所述的微生物，進而可以利用該系統(tǒng)獲得的微生物，通過表達該微生物的基因組中所包含的外源基因，可以使該微生物過表達?；D(zhuǎn)移酶Jr基因，利用所表達的酶催化脂酰輔酶A和外加醇類化合物兩個底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)還可以具有下列附加技術特征:
在本發(fā)明的一個實施例，進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼下列的至少之一:2_酮酸脫羧酶基因或其功能等同體；乙醇脫氫酶或其功能等同體；以及脂?；o酶A還原酶/ / 基因。由此，可以有效地將在相應基因表達產(chǎn)物的作用下，將單糖轉(zhuǎn)化為醇類化合物，從而可以實現(xiàn)將單糖例如葡萄糖作為碳源，微生物依靠自身產(chǎn)生的醇類化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異戊酯和蠟酯。在本發(fā)明的一個實施例，進一步包括第三核酸序列以及任選的第四核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼下列:內(nèi)切葡聚糖酶基因萬67/或其功能等同體；以及葡糖苷酶基因或其功能等同體，所述第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。由此，可以能夠有效地利用基因所編碼的產(chǎn)物，將多糖轉(zhuǎn)化為醇類化合物，從而可以實現(xiàn)將多糖例如纖維素作為碳源，微生物依靠自身產(chǎn)生的醇類化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異戊酯和蠟酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述?；D(zhuǎn)移酶基因編碼SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提聞酸基轉(zhuǎn)移酶J/1基因表達廣物的酶活性，從而進一步提聞利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述?；D(zhuǎn)移酶基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提聞酸基轉(zhuǎn)移酶J/1基因編碼表達廣物的效率，從而進一步提聞利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述2-酮酸脫羧酶基因編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高2-酮酸脫羧酶基因表達產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述2-酮酸脫羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高2-酮酸脫羧酶基因編碼表達產(chǎn)物的效率，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述乙醇脫氫酶4/ 編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高乙醇脫氫酶4^/￡ 基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述乙醇脫氫酶4/ 具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提聞乙醇脫氣酶基因編碼表達廣物的效率，從而進一步提聞利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從’JJ編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提聞內(nèi)切匍聚糖酶基因編碼廣物的酶活性，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從具有SEQ ID NO:10所示的核昔酸序列。由此，可以進一步提聞內(nèi)切匍聚糖酶基因EGII表達廣物的效率，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述β -葡糖苷酶基因沒編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高葡糖苷酶基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述β -葡糖苷酶基因沒-ffi具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高葡糖苷酶基因編碼產(chǎn)物的效率，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。
在本發(fā)明的一個實施例，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。由此，可以進一步提高脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼產(chǎn)物的酶活性，從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，可以進一步提高脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼產(chǎn)物的效率從而進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。由此，可以進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。由此，可以進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為酵母。由此，可以進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的一個實 施例，所述微生物為畢赤酵母。由此，可以進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。由此，可以進一步提高利用該系統(tǒng)獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被設置在同一個載體或相互不同的載體上。由此，可以進一步提高采用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物的效率。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種制備重組微生物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括使用前面所述的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物，以便獲得所述重組微生物。由此，通過該方法能夠有效獲得重組微生物，進而可以利用該方法獲得的微生物，通過表達該微生物的基因組中所包含的外源基因，可以使該微生物過表達酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因，利用所表達的Jr酶催化脂酰輔酶A和醇類化合物兩個底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異戊酯和蠟酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法還可以具有下列附加技術特征:
在本發(fā)明的一個所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。由此，可以進一步提高利用該方法獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。由此，可以進一步提高利用該方法獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為酵母。由此，可以進一步提高利用該方法獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物為畢赤酵母。由此，可以進一步提高利用該方法獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率。在本發(fā)明的 一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。由此，可以進一步提高利用該方法獲得的重組微生物制備脂肪酸酯的效率，降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種生產(chǎn)脂肪酸酯的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括下列步驟:培養(yǎng)前面所述的微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分離所述脂肪酸酯。由此，利用該方法可以借助本發(fā)明實施例的微生物合成脂肪酸酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法還可以具有下例附加技術特征:
在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，可催化脂肪酰輔酶A和醇類化合物生產(chǎn)脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述醇類化合物為碳源子數(shù)目不超過24的一元醇，優(yōu)選為選自甲醇、乙醇、異丁醇、異戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇的至少一種由此可以有效地利用醇類化合物作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及?；D(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。在本發(fā)明的一個實施例，所述單糖為葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此可以有效地利用單糖作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因八β -葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。由此可以有效地利用纖維素作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。在本發(fā)明的一個實施例，所述單糖為葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此，可以有效地利用單糖作為原材料制備臘酷O在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼酰基輔酶A還原酶/ / 基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。由此，可以有效地利用纖維素作為原材料制備蠟酯。在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種脂肪酸酯產(chǎn)品，其是通過前面所述的方法制備的。由此，生產(chǎn)方式綠色環(huán)保，擺脫對石油資源的依賴，不“與民爭糧、爭地”，得到的產(chǎn)品純度高，有害廢物少，對環(huán)境友好。在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種用于生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括:生物反應器，所述生物反應器中設置有前面所述的微生物以及培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)所述微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分離裝置，所述分離裝置與所述生物反應器相連，用于分離所述脂肪酸酯。由此，利用本發(fā)明的實施例的生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)，可以有效地實施前面所述的生產(chǎn)脂肪酸酯的方法，從而可以有效地用于制備脂肪酸酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)還可以具有下列附加技術特征:
在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，可催化脂肪酰輔酶A和醇類化合物生產(chǎn)脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述醇類化合物為碳原子數(shù)目不超過24的一元醇，優(yōu)選為選自甲醇、乙醇、異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇、脂肪醇的至少一種由此可以有效地利用醇類化合物作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及?；D(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。在本發(fā)明的一個實施例，所述單糖為葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油，由此可以有效地利用單糖作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因八β -葡糖苷酶基因以及酰基轉(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。由此可以有效地利用纖維素作為原材料獲得脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物。在本發(fā)明的一個實施例，所述單糖為葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此，可以有效地利用單糖作為原材料制備臘酷O在本發(fā)明的一個實施例，所述微生物包含編碼?；o酶A還原酶/ / 基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。由此，可以有效地利用纖維素作為原材料制備蠟酯。本發(fā)明的優(yōu)點是在微生物中引入外源基因構(gòu)建一條合成肪酸酯的代謝途徑，最終實現(xiàn)以單糖或纖維素為原料合成脂肪酸酯的目的，不需要通過過多的化學合成反應，減少了環(huán)境的污染，也減少了對石油儲量的消耗。 同時，由于微生物生長速度快，便于進行遺傳操作，其抗污染性能優(yōu)異，且人工可以調(diào)節(jié)其生長速度和防止其肆意生長破壞環(huán)境，種種因素表明改造微生物進行工業(yè)生產(chǎn)脂肪酸酯是切實可行的。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
圖1.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG整合載體。圖2.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDGlOl整合載體示意圖，將基因克隆到PDG整合載體上。圖3.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG104整合載體示意圖，將AROlO和燦似基因克隆到pDG整合載體上。圖4.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG105整合載體示意圖，將AT,AROlO和也》似基因克隆到pDG整合載體上。圖5.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG108整合載體示意圖，將EGII和及X基因克隆到pDG整合載體上。圖6.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG109整合載體示意圖，將EG,BGL,AT,AROlO和燦似基因克隆到pDG整合載體上。圖7.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDGllO整合載體示意圖，將/ / 基因克隆到pDG整合載體上。圖8.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的pDGlll整合載體示意圖，將FAR和基因克隆到pDG整合載體上。圖9.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG112整合載體示意圖，將EGI1、BGUFAR和基因克隆到pDG整合載體上。圖10.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例設計構(gòu)建的PDG113整合載體示意圖，將AT, AROlO和燦似基因克隆到pET28a ( + )載體上。圖11.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DGl工程菌在外加甲醇發(fā)酵條件下，合成脂肪酸甲酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰內(nèi)標碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoicacid methyl ester), 2 號峰碳十六脂肪酸甲酯(Hexadecanoic acid methyl ester),3號峰Δ 9_碳十六稀脂肪酸甲酷(9-Hexadecenoic acid methyl ester), 4號峰碳十八脂肪酸甲酯(Octadecanoic acid methyl ester), 5號峰Δ 9_碳十八烯脂肪酸甲酯(9-Octadecenoic acid methyl ester)。圖12.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DGl工程菌在與產(chǎn)乙醇酵母共發(fā)酵條件下，合成脂肪酸乙酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰內(nèi)標碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoicacid methyl ester), 2 號峰碳十六脂肪酸乙酯(Hexadecanoic acid ethyl ester), 3 號峰Δ 9-碳十六烯脂肪酸乙酯(9-Hexadecenoic acid ethyl ester), 4號峰碳十八脂肪酸乙酯(Octadecanoic acid ethyl ester), 5 號峰 Δ 9_ 碳十八烯脂肪酸乙酯(9_ Octadecenoicacid ethyl ester)。
圖13.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG2工程菌以葡萄糖為碳源合成短鏈醇的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰乙醇(ethanol), 2號峰異丁醇(isobutnol), 3號峰異戍醇(isopentanol)。圖14.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG3工程菌以葡萄糖為碳源合成脂肪酸短鏈酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰內(nèi)標碳十五脂肪酸乙酯(Pentadecanoic acid ethylester) , 2號峰碳十六脂肪酸乙酷(Hexadecanoic acid ethyl ester), 3號峰碳十六脂肪酸異丁酯(Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester), 4號峰碳十八脂肪酸乙酯(Octadecanoic acid ethyl ester), 5 號峰碳十六脂肪酸異戍酯(Hexadecanoic acid2-methylbutyl ester),6 號峰碳十八脂肪酸異丁酯(Octadecanoic acid 2-methypropylester), 7 號峰碳十八脂肪酸異戍酯(Octadecanoic acid 2-methybutyl ester)。圖15.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG4工程菌以纖維素為碳源合成脂肪酸短鏈酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰內(nèi)標碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoic acid methylester), 2 號峰碳十六脂肪酸異丁酯(Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester), 3 號峰碳十六脂肪酸異戍酯(Hexadecanoic acid 2-methylbutyl ester),4號峰碳十八脂肪酸異丁酯(Octadecanoic acid 2-methypropyl ester), 5號峰碳十八脂肪酸異戍酯(Octadecanoic acid 2-methybutyl ester)。圖16.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG5工程菌以葡萄糖為碳源合成脂肪醇的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰內(nèi)標碳十五脂肪醇(pentadecanol), 2號峰碳十六脂肪醇(hexadecanol), 3 號峰碳十八脂肪醇(Octadecanol )。圖17.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG6工程菌以葡萄糖為碳源合成蠟酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰碳十八脂肪酸碳十六酯(C18:C16), 2號峰碳十八脂肪酸碳十八酯(C18:C18)。圖18.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG7工程菌以纖維素為碳源合成蠟酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰碳十八脂肪酸碳十六酯(C18:C16), 2號峰碳十八脂肪酸碳十八酯(C18:C18)。圖19.顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例DG8工程菌以葡萄糖為碳源合成脂肪酸短鏈酯的GC-MS檢測結(jié)果圖。I號峰代表內(nèi)標碳十五脂肪酸乙酯(Pentadecanoicacid ethyl ester), 2 號峰代表碳十四脂肪酸異丁酯(Myristic acid isobutylester), 3號峰代表碳十六脂肪酸乙酯(Hexadecanoic acid ethyl ester), 4號峰代表碳十六脂肪酸 _3_ 甲基-丁酯(Hexadecanoic acid 3-methybutyl ester), 5 號峰代表碳十六脂肪酸異丁酯(Hexadecanoic acid isobutyl ester), 6號峰代表Δ 9_碳十六烯脂肪酸丁酯(Butyl 9-hexadecenoaie), 7號峰代表碳十八脂肪酸_3_甲基-丁酯(Octadecanoic acid 3-methybutyl ester), 8號峰代表Δ 9_碳十六烯脂肪酸丙酯(propyl 9-hexadecenoaie)，9 號峰代表 Δ9-碳十八烯脂肪酸丙酯(9_ Octadecanoicacid (Z) - propyl ester), 10 號峰代表碳十八脂肪酸異丁酯(9_ Octadecanoic acid (Z)-1sobutyl ester)。
具體實施例方式下面詳細描 述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制?？s寫及術語
提供下列關于術語和方法的解釋一遍更好的描述本發(fā)明，并指導本領域普通技術人員實施本發(fā)明。本文使用的“包括”表示“包含”，單數(shù)形式的“一個”，除非上下明確的另外指出。例如，“包括一個細胞”指包含一個或者多個這類細胞，“包括硫酯酶”指包含一種或者多種硫酯酶肽以及本領域普通技術人員已知的其同等物，等等。術語“或者”是指陳述的可選擇要素或者兩個或更多個要素組合中的單個要素，除非上下文明確的另外指出。例如短語“生物燃料或者其中間體”是指生物燃料、生物燃料中間體或者生物燃料和生物燃料中間體兩者的組合。除非另外解釋，所有本文使用的技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常的理解具有相同的含義。盡管與本文描述的類似或者等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實施或者實驗，但下文描述了適合的方法和材料。所述材料、方法和實施例子只是說明性的，而不是用于限制。根據(jù)下面的詳細說明和權利要求，本發(fā)明的其他特征將是明顯。登錄號:貫穿本說明書的登錄號來源于美國國立衛(wèi)生研究院維護的NCBI數(shù)據(jù)庫(國立生物技術信息中心)。所述登錄號是2011年3月I日由該數(shù)據(jù)庫提供的。酶分類號(EC):貫穿本說明書提供的EC編號來自京都基因與基因百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)維護的 KEGG Ligand 數(shù)據(jù)庫，這由東京大學部分資助。所述EC編號是2011年3月I日由該數(shù)據(jù)庫提供的。碳源:通常指適合作為原核生物或者簡單真核生物細胞生長的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各種形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。這些包括，例如，各種單糖諸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纖維素質(zhì)、木糖和阿拉伯糖，二糖，諸如蔗糖、飽和或者不飽和的脂肪酸、琥珀酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇，等等，或者其混合物。此夕卜，碳源還可以是光合作用產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。

可檢測的:能夠確定出現(xiàn)或者存在。例如，使用下面實施例子提供的方法，從發(fā)酵液中產(chǎn)物是可檢測的。:脫氧核糖核酸。DNA是長鏈聚合物，其包括大部分的有機體(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遺傳物質(zhì)。DNA聚合物中的重復單位是4種不同的核苷酸，其包括4中堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種，所述堿基上結(jié)合有脫氧核糖，而磷酸基與所述脫氧核糖連接。DNA分子中被稱為密碼子的是核苷酸三聯(lián)體編碼肽的氨基酸。術語密碼子還指mRNA中3核苷酸的對應(和互補)序列，所述DNA序列被轉(zhuǎn)錄成所述mRNA。內(nèi)源的:當在本文中對核酸分子和特定的細胞或者微生物使用時，是指位于細胞內(nèi)的核酸序列或者肽，其不是利用重組工程技術導入細胞的。例如，當細胞最初從自然界分離時，已經(jīng)存在于所述細胞中的基因。即使調(diào)控序列諸如激活轉(zhuǎn)錄或者翻譯的啟動子或者增強子序列已經(jīng)通過重組技術被改變，基因仍被認為是內(nèi)源的。外源的:本文中對核酸分子和特定的細胞使用時，是指不是來源于自然界發(fā)現(xiàn)的特定細胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入細胞，則其被認為是外源的。對特定細胞來說，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦從細胞X分離的完整編碼序列被引入細胞Y，則該編碼序列對細胞Y來說是外源核酸，即使X和Y是相同的細胞類型。
表達:基因的編碼信息被轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎慕Y(jié)構(gòu)與功能諸如蛋白、轉(zhuǎn)移RNA或者核糖體RNA的過程。表達的基因包括那些被轉(zhuǎn)錄為mRNA然后被翻譯為蛋白的基因，以及那些被轉(zhuǎn)錄為RNA但不被翻譯為蛋白的基因(例如，轉(zhuǎn)移和核糖體RNAs)。
發(fā)酵肉湯:包括任意支持微生物生命(即主動代謝碳的微生物)的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。分離的:“分離的”生物學組分(諸如核酸分子、蛋白或者細胞)已經(jīng)基本上從該組分天然存在的其他生物學組分中分離或者純化，諸如其他染色體的和染色體外的DNA和RNA,以及蛋白。已經(jīng)被“分離的”核酸分子和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術語還包括在宿主細胞中利用重組表達制備的核酸分子和蛋白，以及化學合成的核酸分子和蛋白。微生物:包括來自古細菌域、真細菌域和真核生物域的原核和真核微生物種，后者包括酵母和絲狀酵母、原生動物、藻類或者更高等的原生生物。術語“微生物細胞”可以與“微生物”互換使用。核酸分子:包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因組DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化學合成或者重組產(chǎn)生的核酸分子。核酸分子可以是雙鏈或者單鏈的。單鏈時，核酸分子可以是正義鏈或者反義鏈。此外，核酸分子可以是環(huán)狀或者線性的。可操作的連接:當?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列具有功能關系時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作的連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或者表達，則所述啟動子與所述編碼序列為可操作的連接。通常，可操作連接的DNA序列是連接的，并且必要時在相同閱讀框內(nèi)連接兩個蛋白編碼區(qū)域。作為單個信使RNA串聯(lián)轉(zhuǎn)錄的分離基因的結(jié)構(gòu)被稱為操縱子。因此將基因緊密相鄰置于單個啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下，例如在質(zhì)粒載體中，則構(gòu)成合成操縱子。(開放閱讀框):不含任何終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通?？梢员环g為肽。過表達:當基因的轉(zhuǎn)錄速率與其內(nèi)源轉(zhuǎn)錄速率相比提高的時候。在一些實例中，過表達還包括基因的翻譯速率高于該基因的內(nèi)源翻譯速率。檢測過表達的方法是本領域公知的。例如可以利用RT-PCR評價轉(zhuǎn)錄的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝膠分析評價蛋白水平。純化的:術語“純化的”并不需要絕對的純度；它只是一個相對術語。因此，例如，純化的生物燃料或其中間體是指比位于其細胞環(huán)境內(nèi)的產(chǎn)物濃度更高的產(chǎn)物。重組:重組核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工組合序列的兩個另外分離的序列片段制備的序列，或者以上兩者。例如可以通過化學合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分離片段，諸如遺傳工程技術，實現(xiàn)這種人工組合。重組還用于描述以下核酸分子，它們已經(jīng)被人工處理，但包含的調(diào)控序列和編碼區(qū)與分離所述核酸的生物體中發(fā)現(xiàn)的相同。重組細胞或者微生物是包含外源核酸分子諸如重組核酸分子的細胞或者微生物。轉(zhuǎn)化或者重組細胞:例如通過分子生物學技術，已經(jīng)被引入核酸分子(諸如編碼酰基輔酶A合酶的核酸分子)的細胞。轉(zhuǎn)化包括能夠?qū)⒑怂岱肿右脒@類細胞的所有技術，包括但不限于，利用病毒載體轉(zhuǎn)染、接合作用、利用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、通過電穿孔的裸DNA引入、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和顆粒槍加速。在允許產(chǎn)物生成的條件下:任何允許微生物產(chǎn)生所需產(chǎn)物(諸如烷烴、烯烴等)的發(fā)酵條件。發(fā)酵條件通常包括溫度范圍、通氣水平和培養(yǎng)基選擇，將上述條件組合時允許微生物生長。示例性培養(yǎng)基包括肉湯或者凝膠。通常，培養(yǎng)基包括碳源諸如葡萄糖、果糖、纖維素或者可以被微生物直接代謝的類似物，或者可以在培養(yǎng)基中使用促進代謝碳源的酶。為了確定培養(yǎng)條件是否允許產(chǎn)物生成，將微生物培養(yǎng)8、16或者24小時，收集并分析樣品。例如，可以檢測樣品或者培養(yǎng)基(細胞在其中生長)的細胞中所需產(chǎn)物存在。當分析產(chǎn)物的存在時，可以使用下面實例提供的那些方法。載體:作為引入細胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞的核酸分子。載體可以包括允許其在細胞中復制的核酸序列，諸如復制原點。載體還可以包括一種或者多種選擇性標志物基因和本領域已知的其他遺傳成分。單糖:單糖應做廣義理解，可以包括葡萄糖、果糖、半乳糖，還可以包括甘油。纖維素:文章中“纖維素”做廣義理解，經(jīng)處理可產(chǎn)生可被微生物作為碳源利用的纖維素物質(zhì)都被稱為纖維素。術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個或兩個以上，除非另有明確具體的限定。在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術語“相連”、“連接””等術語應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內(nèi)部的連通。對于本領域的普通技術人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術語在本發(fā)明中的具體含義。微生物
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種微生物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，該微生物包括第一核酸序列，該第一核酸序列編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當采用該微生物時，通過表達該微生物的基因組中所包含的外源基因，可以使該微生物過表達?；D(zhuǎn)移酶xr，從而可以利用所表達的酶催化脂酰輔酶A和外加醇類化合物兩個底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。利用該微生物，可以通過在微生物細胞內(nèi)過表達?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體，從而發(fā)揮酰基轉(zhuǎn)移酶的生物活性，進而?；D(zhuǎn)移酶可以與宿主微生物體內(nèi)的固有基因相互作用，從可再生碳源產(chǎn)生脂肪酸酯類化合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該微生物所得到的脂肪酸酯類化合物可以作為生物燃料或者其中間體。在本文中所使用的術語“功能等同體”是指這樣的一種基因，其能夠在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮例如與^相同的功能，但在序列上與例如^有所區(qū)別的基因，從而利用該功能等同體也能夠有效地生產(chǎn)脂肪酸酯類化合物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例dr基因的功能等同體可絮^Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798^Rhodococcus opacus PD630^Mus musculus QSH/Psychrobacter ar cticus 273-4 的至少一種。上述 JT1 基因的功能等同體與AT基因同樣具有合成WS/DGAT的功能。通過在微生物中弓丨入外源DNA序列，可以在微生物細胞內(nèi)表達具有生物活性的蛋白，這些蛋白能夠代謝可再生碳源以產(chǎn)生脂肪酸酯類化合物作為生物燃料或其中間體。因此，可以將這些微生物用于生產(chǎn)脂肪酸酯類化合物，以便得到可以作為生物燃料或者生物燃料中間體的脂肪酸酯類化合物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該微生物包括的第一核酸序列能夠編碼酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因，在外加甲醇的條件下，?；D(zhuǎn)移酶基因表達催化脂酰輔酶A和甲醇兩個底物合成脂肪酸甲酯。在與釀酒酵母共培養(yǎng)的條件下，酰基轉(zhuǎn)移酶基因表達催化脂酰輔酶A和釀酒酵母產(chǎn)生的乙醇兩個底物合成脂肪酸乙酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，酰基轉(zhuǎn)移酶基因優(yōu)選具有下列所示的核苷酸序列:
ATGAGACCATTACACCCTATTGATTTCATTTTCTTGTCTTTGGAAAAGAGACAACAACCAATGCATGTTGGT
GGTTTGTTTTTATTCCAAATCCCAGATAATGCACCTGACACTTTTATTCAAGATTTGGTCAACGACATAAGAATCTC
AAAGTCCATTCCTGTTCCACCTTTCAATAACAAGTTGAACGGTTTATTTTGGGATGAAGACGAAGAATTTGATTTGG
ACCATCACTTTAGACATATAGCTTTACCACACCCTGGTAGAATCAGAGAATTGTTGATCTATATCTCCCAAGAACAT
AGTACTTTGTTGGATAGAGCAAAGCCATTGTGGACATGTAACATCATCGAAGGTATCGAGGGTAACAGATTTGCCAT
GTACTTCAAGATACATCACGCAATGGTAGATGGTGTCGCCGGTATGAGATTGATCGAAAAATCTTTGTCTCACGACG
TTACCGAAAAGTCTATTGTCCCACCTTGGTGCGTTGAAGGTAAAAGAGCTAAGAGATTAAGAGAACCAAAGACTGGT
AAAATTAAGAAAATTATGT CTGGTATCAAATCACAATTGCAAGCAACTCCTACAGTAATTCAAGAATTGTCACAAAC
AGTCTTCAAGGATATAGGTAGAAATCCAGACCATGTTTCTTCATTTCAAGCACCTTGTTCTATTTTGAACCAAAGAG
TATCCAGTTCTAGAAGATTTGCTGCACAATCCTTCGATTTGGACAGATTCAGAAACATCGCCAAGAGTTTGAACGTT
ACCATAAACGATGTTGTATTAGCTGTATGCTCTGGTGCCTTGAGAGCTTATTTGATGTCACATAATTCCTTGCCTAG
TAAGCCTTTAATCGCTATGGTACCAGCATCAATTAGAAATGATGACTCTGATGTCTCAAACAGAATCACAATGATCT
TGGCAAATTTGGCCACCCACAAAGATGACCCTTTGCAAAGATTAGAAATCATCAGAAGATCCGTTCAAAACAGTAAG
CAAAGATTCAAGAGAATGACTTCTGATCAAATATTGAACTACTCAGCTGTCGTTTACGGTCCAGCAGGTTTAAACAT
AATCTCTGGTATGATGCCTAAGAGACAAGCCTTTAATTTGGTTATTTCAAACGTACCAGGTCCTAGAGAACCATTAT
ATTGGAATGGTGCCAAGTTGGATGCTTTATACCCTGCATCCATAGTTTTGGACGGTCAAGCTTTAAACATCACCATG
ACTTCTTACTTGGATAAGTTAGAAGTTGGTTTGATTGCCTGTAGAAATGCTTTACCA
AGAATGCAAAACTTGTTAACACATTTGGAAGAAGAAATCCAATTGTTTGAAGGTGTTATCGCCAAGCAAGAAGACATTAAGACTGCCAACTAA (SEQ ID NO:8),
其編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
MRPLHPIDFIFLSLEKRQQPMHVGGLFLFQIPDNAPDTFIQDLVNDIRISKSIPVPPFNNKLNGLFWDEDEEFDLDHHFRHIALPHPGRIRELLIYISQEHSTLLDRAKPLWTCNIIEGIEGNRFAMYFKIHHAMVDGVAGMRLIEKSLS-HDVTEKSIVPPWCVEGKRAKRLREPKTGKIKKIMSGIKSQLQATPTVIQELSQTVFKDIGRNPDHVSSFQAPCSILNQRVSSSRRFAAQSFDLDRFRNIAKSLNVTINDVVLAVCSGALRAYLMSHNSLPSKPLIAMVPASIRNDDSDVSNRITMILANLATHKDDPLQRLEIIRRSVQNSKQRFKRMTSDQILNYSAVVYGPAGLNIISGMMPKRQAFNLVISNVPGPREPLYWNGAKLDALYPASIVLDGQALNITMTSYLDKLEVGLIACRNALPRMQNLLTHLEEEIQLFEGVIAKQEDIKTAN(SEQ ID NO:7),
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當采用該核苷酸序列時，?；D(zhuǎn)移酶Jr基因在微生物細胞尤其是在酵母細胞中的表達效率可以得到顯著地提高，進而可以進一步提高生產(chǎn)脂肪酸酯類化合物的效率。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在微生物中，還可以進一步包含編碼其他基因的核酸序列，從而賦予微生物額外的功能。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在微生物中進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列可以編碼2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體、乙醇脫氫酶^^^基因或其功能等同體。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，第二核酸序列可以編碼2-酮酸脫羧酶基因，2-酮酸脫羧酶基因表達翻譯得到酶，AROlO酶能夠催化氨基酸代謝中間產(chǎn)物2-酮酸進行脫羧轉(zhuǎn)化為醛，同時第二核酸序列還可以編碼乙醇脫氫酶4/ 基因或其功能等同體，乙醇脫氫酶4/ 基因表達翻譯得到4/ 酶，4/ 酶可以催化醛還原為短鏈醇，因此，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該微生物包括的第二核酸序列可以間接的制備得到醇。進一步地，該微生物包括的第一核酸序列編碼酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體，該基因經(jīng)過翻譯表達得到Jr酶，酶進一步催化脂?；o酶A和經(jīng)過酶和酶催化得到的短鏈醇兩個底物最終形成脂肪酸短鏈酯。由此，該微生物能夠?qū)崿F(xiàn)利用單糖直接得到脂肪酸酯，進一步提高了微生物制備脂肪酸酯的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，基因的功能等同體可以為來自SeiccheiromycGS cerevisiae的 pyruvate decarboxylase 6 (PDC6) IMM Lactococcus lactis 的 a—ketoisovaleratedecarboxylase (Kivd)的至少一種；乙醇脫氫酶ADH2或其功能等同體可以為來自Saccharomyces cerevisiae 白勺 alcohol dehydrogenase I (ADHl) 、Lachancea kluyveri的 alcohol dehydrogenase 2 (ADH2)、以及LacAaflcea kluyveri ^ alcohol dehydrogenaseI (ADHl);脂酰輔酶A還原酶FAR基因的功能等同體可以為來自Acinetobactercalcoaceticus 的 Acr1、Crjza saiira 的 DPW、以及可以為來自elongates
PCC 7942的AAR的至少一種。由此利用上述基因的功能等同體同樣可以達到相同的功能，因此能夠?qū)崿F(xiàn)利用單糖直接得到脂肪酸酯，進一步提高了微生物制備脂肪酸酯的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，2-酮酸脫羧酶 基因具有下列所示的核苷酸序列:
ATGGCACCTGTTACAATTGAAAAGTTCGTAAATCAAGAAGAACGACACCTTGTTTCCAACCGATCAGCAACA
ATTCCGTTTGGTGAATACATATTTAAAAGATTGTTGTCCATCGATACGAAATCAGTTTTCGGTGTTCCTGGTGACTT
CAACTTATCTCTATTAGAATATCTCTATTCACCTAGTGTTGAATCAGCTGGCCTAAGATGGGTCGGCACGTGTAATG
AACTGAACGCCGCTTATGCGGCCGACGGATATTCCCGTTACTCTAATAAGATTGGCTGTTTAATAACCACGTATGGC
GTTGGTGAATTAAGCGCCTTGAACGGTATAGCCGGTTCGTTCGCTGAAAATGTCAAAGTTTTGCACATTGTTGGTGT
GGCCAAGTCCATAGATTCGCGTTCAAGTAACTTTAGTGATCGGAACCTACATCATTTGGTCCCACAGCTACATGATT
CAAATTTTAAAGGGCCAAATCATAAAGTATATCATGATATGGTAAAAGATAGAGTCGCTTGCTCGGTAGCCTACTTG
GAGGATATTGAAACTGCATGTGACCAAGTCGATAATGTTATCCGCGATATTTACAAGTATTCTAAACCTGGTTATAT
TTTTGTTCCTGCAGATTTTGCGGATATGTCTGTTACATGTGATAATTTGGTTAATGTTCCACGTATATCTCAACAAG
ATTGTATAGTATACCCTTCTGAAAACCAATTGTCTGACATAATCAACAAGATTACTAGTTGGATATATTCCAGTAAA
ACACCTGCGATCCTTGGAGACGTACTGACTGATAGGTATGGTGTGAGTAACTTTTTGAACAAGCTTATCTGCAAAAC
TGGGATTTGGAATTTTTCCACTGTTATGGGAAAATCTGTAATTGATGAGTCAAACCCAACTTATATGGGTCAATATA
ATGGTAAAGAAGGTTTAAAACAAGTCTATGAACATTTTGAACTGTGCGACTTGGTCTTGCATTTTGGAGTCGACATC
AATGAAATTAATAATGGGCATTATACTTTTACTTATAAACCAAATGCTAAAATCATTCAATTTCATCCGAATTATAT
TCGCCTTGTGGACACTAGGCAGGGCAATGAGCAAATGTTCAAAGGAATCAATTTTGCCCCTATTTTAAAAGAACTAT
ACAAGCGCATTGACGTTTCTAAACTTTCTTTGCAATATGATTCAAATGTAACTCAATATACGAACGAAACAATGCGG
TTAGAAGATCCTACCAATGGACAATCAAGCATTATTACACAAGTTCACTTACAAAAGACGATGCCTAAATTTTTGAA
CCCTGGTGATGTTGTCGTTTGTGAAACAGGCTCTTTTCAATTCTCTGTTCGTGATTTCGCGTTTCCTTCGCAATTAA
AATATATATCGCAAGGATTTTTCCTTTCCATTGGCATGGCCCTTCCTGCCGCCCTAGGTGTTGGAATTGCCATGCAAGACCACTCAAACGCTCACATCAATGGTGGCAACGTAAAAGAGGACTATAAGCCAAGATTAATTTTGTTTGAAGGTGACGGTGCAGCACAGATGACAATCCAAGAACTGAGCACCATTCTGAAGTGCAATATTCCACTAGAAGTTATCATTTGGAACAATAACGGCTACACTATTGAAAGAGCCATCATGGGCCCTACCAGGTCGTATAACGACGTTATGTCTTGGAAATGGACCAAACTATTTGAAGCATTCGGAGACTTCGACGGAAAGTATACTAATAGCACTCTCATTCAATGTCCCTCTAAATTAGCACTGAAATTGGAGGAGCTTAAGAATTCAAACAAAAGAAGCGGGATAGAACTTTTAGAAGTCAAATTAGGCGAATTGGATTTCCCCGAACAGCTAAAGTGCATGGTTGAAGCAGCGGCACTTAAAAGAAATAAAAAATAG (SEQ ID NO:1),
其編碼的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
MAPVTIEKFVNQEERHLVSNRSATIPFGEYIFKRLLSIDTKSVFGVP⑶FNLSLLEYLYSPSVESAGLRWVGTCNELNAAYAADGYSRYSNKIGCLITTYGVGELSALNGIAGSFAENVKVLHIVGVAKSIDSRSSNFSDRNLHHLVPQLHDSNFKGPNHKVYHDMVKDRVACSVAYLEDIETACDQVDNVIRDIYKYSKPGYIFVPADFADMSVTCDNLVNVPRISQQDCIVYPSENQLSDIINKITSWIYSSKTPAILGDVLTDRYGVSNFLNKLICKTGIWNFSTVMGKSVIDESNPTYMGQYNGKEGLKQVYEHFELC DLVLHFGVDINEINNGHYTFTYKPNAKIIQFHPNYIRLVDTRQGNEQMFKGINFAPILKELYKRIDVSKLSLQYDSNVTQYTNETMRLEDPTNGQSSIITQVHLQKTMPKFLNP⑶VVVCETGSFQFSVRDFAFPSQLKYISQGFFLSIGMALPAALGVGIAMQDHSNAHINGGNVKEDYKPRLILFE⑶GAAQMTIQELSTILKCNIPLEVIIWNNNGYTIERAMGPTRSYNDVMSWKWTKLFEAFOTFDGKYTNSTLIQCPSKLALKLEELKNSNKRSGIELLEVKLGELDFPEQLKCMVEAAALKRNKK (SEQ ID NO:2)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，2-酮酸脫羧酶基因具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當采用該核苷酸序列時，2-酮酸脫羧酶基因在微生物細胞尤其是在酵母細胞中的表達效率可以得到顯著地提高，進而可以進一步提高生產(chǎn)脂肪酸酯類化合物的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，乙醇脫氫酶4/ 能夠編碼下列所示的氨基酸序列: MSIPETQKAIIFYESNGKLEHKDIPVPKPKPNELLINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPTKLPLVGGHEGAGV
WGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQEYATADAVQAAHIPQGTDLAEVAPILCAGITVYKALKSANLRAGHffAAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGPGKEELFTSLGGEVFIDFTKEKDIVSAVVKATNGGAHGIINVSVSEAAIEASTRYCRANGTVVLVGLPAGAKCSSDVFNHVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSSLPEIYEKMEKGQIAGRYVVDTSKCSEQ ID NO:3),以及乙醇脫氫酶也1/ 具有下列所示的核苷酸序列:
ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGCCATTATCTTCTACGAATCCAACGGCAAGTTGGAGCATAAGGATATC
CCAGTTCCAAAGCCAAAGCCCAACGAATTGTTAATCAACGTCAAGTACTCTGGTGTCTGCCACACCGATTTGCACGC
TTGGCATGGTGACTGGCCATTGCCAACTAAGTTACCATTAGTTGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCA
TGGGTGAAAACGTTAAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTTCTTGTATGGCCTGT
GAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTTGTCTGGTTACACCCACGACGGTTCTTTCCA
AGAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGCCGCTCACATTCCTCAAGGTACTGACTTGGCTGAAGTCGCGCCAATCT
TGTGTGCTGGTATCACCGTATACAAGGCTTTGAAGTCTGCCAACTTGAGAGCAGGCCACTGGGCGGCCATTTCTGGT
GCTGCTGGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATATGCTAAGGCGATGGGTTACAGAGTCTTAGGTATTGATGGTGG
TCCAGGAAAGGAAGAATTGTTTACCTCGCTCGGTGGTGAAGTATTCATCGACTTCACCAAAGAGAAGGACATTGTTA
GCGCAGTCGTTAAGGCTACCAACGGCGGTGCCCACGGTATCATCAATGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATCGAAGCT
TCTACCAGATACTGTAGGGCGAACGGTACTGTTGTCTTGGTTGGTTTGCCAGCCGGTGCAAAGTGCTCCTCTGATGTCTTCAACCACGTTGTCAAGTCTATCTCCATTGTCGGCTCTTACGTGGGGAACAGAGCTGATACCAGAGAAGCCTTAGATTTCTTTGCCAGAGGTCTAGTCAAGTCTCCAATAAAGGTAGTTGGCTTATCCAGTTTACCAGAAATTTACGAAAAGATGGAGAAGGGCCAAATTGCTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA (SEQ ID NO:4)。由此可以進
一步提高微生物合成脂肪酸酯類化合物的效率。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在該微生物中，可以進一步包含第三核酸序列以及任選的第四核酸序列，其中，第三核酸序列編碼內(nèi)切葡聚糖酶基因萬67/或其功能等同體；以及葡糖苷酶基因或其功能等同體，第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。由此，該可以進一步提高微生物合成脂肪酸酯效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該微生物合成脂肪酸酯的是通過下列反應路徑完成的:第三核酸序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶基因M7/或其功能等同體和β -葡糖苷酶基因或其功能等同體能夠翻譯表達得到纖維素酶，該纖維素酶可以水解纖維素產(chǎn)生單糖，最終實現(xiàn)了在微生物中直接從纖維素合成脂肪酸酯，由此可以將微生物體內(nèi)自身的代謝途徑合并兩條或者多條代謝途徑生產(chǎn)脂肪酸酯，以便進一步提高利用微生物合成脂肪酸酯的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，第三核酸序列并不受特別限制，具有下列所述的核苷酸序列即可:
ATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCTTTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCTGCTCAACAAACTGTATGGGGTCAATGTGGTGGTATCGGTTGGTCTGGTCCTACTAACTGTGCCCCTGGTTCTGCCTGCTCTACCTTAAATCCATATTACGCTCAATGTATACCTGGTGCAACTACAATCACCACTTCTACTAGACCACCTTCAGGTCCAACAACCACTACAAGAGCAACCTCTACTTCTTCATCCACTCCTCCAACTTCTTCTGGTGTTAGATTTGCCGGTGTAAATATTGCTGGTTTTGATTTCG GTTGTACCACTGACGGTACATGCGTAACCTCTAAAGTTTATCCACCTTTGAAGAACTTCACTGGTTCAAATAACTACCCAGATGGTATAGGTCAAATGCAACATTTCGTTAACGAAGACGGTATGACAATATTCAGATTGCCTGTAGGTTGGCAATATTTGGTTAACAACAATTTGGGTGGTAATTTGGATTCAACATCCATTAGTAAGTACGACCAATTAGTTCAAGGTTGTTTGTCATTAGGTGCCTATTGCATCGTCGATATTCATAACTACGCTAGATGGAATGGTGGTATTATAGGTCAAGGTGGTCCAACCAACGCACAATTCACTTCTTTGTGGAGTCAATTAGCTTCTAAGTATGCATCTCAATCAAGAGTTTGGTTCGGTATCATGAATGAACCTCACGATGTCAACATTAATACTTGGGCTGCAACAGTACAAGAAGTTGTCACAGCTATAAGAAACGCCGGTGCTACCTCCCAATTCATTTCTTTGCCAGGTAATGATTGGCAATCTGCAGGTGCCTTCATATCTGACGGTTCAGCCGCTGCATTATCCCAAGTAACTAACCCTGATGGTAGTACAACCAATTTGATATTCGACGTTCATAAGTACTTAGATTCCGACAACAGTGGTACTCACGCAGAATGTACTACAAACAATATCGATGGTGCATTCTCACCATTGGCCACATGGTTAAGACAAAACAATAGACAAGCCATTTTGACAGAAACCGGTGGTGGTAATGTCCAATCCTGTATACAAGATATGTGCCAACAAATCCAATATTTGAACCAAAATTCTGACGTTTATTTGGGTTACGTCGGTTGGGGTGCTGGTTCTTTTGATTCAACATACGTTTTGACTGAAACACCTACTGGTTCCGGTAACTCCTGGACTGACACTTCCTTAGTATCATCCTGTTTAGCAAGAAAATAA (SEQ ID NO: 10)和
ATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCTTTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCT
GCTGATGAATTAGCCTTCTCCCCTCCATTTTATCCTAGTCCTTGGGCCAACGGTCAAGGTGAATGGGCCGAAGCCTA
TCAAAGAGCCGTCGCTATAGTATCACAAATGACTTTGGATGAAAAGGTTAACTTAACTACAGGTACAGGTTGGGAAT
TGGAAAAATGTGTCGGTCAAACCGGTGGTGTACCAAGATTAAATATAGGTGGCATGTGCTTGCAAGATTCTCCTTTA
GGTATCAGAGATTCTGACTATAATTCAGCCTTTCCAGCTGGTGTTAACGTCGCTGCAACATGGGATAAAAATTTGGC
ATACTTAAGAGGTCAAGCCATGGGTCAAGAATTTTCTGATAAGGGTATTGACGTTCAATTGGGTCCAGCCGCTGGTC
CTTTAGGTAGATCCCCTGACGGTGGTAGAAATTGGGAAGGTTTTAGTCCAGATCCTGCATTGACCGGTGTTTTATTCGCCGAAACTATTAAAGGTATACAAGATGCAGGTGTTGTCGCTACTGCAAAGCATTACATCTTGAACGAACAAGAACACTTCAGACAAGTTGCTGAAGCAGCCGGTTACGGTTTCAACATATCAGACACTATCTCTTCAAATGTTGATGACAAGACAATCCATGAAATGTATTTGTGGCCATTTGCCGATGCTGTAAGAGCTGGTGTTGGTGCAATCATGTGTTCTTACAACCAAATTAATAACTCTTATGGTTGCCAAAATTCATACACATTGAACAAATTGTTGAAGGCCGAATTAGGTTTTCAAGGTTTCGTCATGTCTGACTGGGGTGCTCATCACTCCGGTGTAGGTAGTGCATTGGCCGGTTTAGATATGTCAATGCCAGGTGACATTACTTTTGACTCTGCCACATCATTCTGGGGTACTAATTTGACAATCGCTGTCTTAAACGGTACAGTACCACAATGGAGAGTTGATGACATGGCTGTCAGAATTATGGCTGCATATTACAAAGTTGGTAGAGACAGATTGTATCAACCACCTAATTTTTCCAGTTGGACTAGAGATGAATACGGTTTTAAATACTTCTACCCACAAGAAGGTCCTTACGAAAAGGTTAACCATTTCGTAAACGTTCAAAGAAACCACTCTGAAGTAATCAGAAAATTAGGTGCAGATTCAACTGTTTTGTTAAAGAATAACAACGCCTTGCCATTAACTGGTAAAGAAAGAAAGGTTGCTATTTTGGGTGAAGATGCAGGTTCTAATTCATACGGTGCAAACGGTTGTTCCGATAGAGGTTGCGACAATGGTACATTAGCTATGGCATGGGGTAGTGGTACAGCTGAATTTCCATATTTGGTTACCCCTGAACAAGCAATCCAAGCCGAAGTCTTAAAACATAAGGGTTCTGTATACGCCATTACAGATAATTGGGCTTTGTCACAAGTCGAAACCTTAGCTAAACAAGCATCCGTAAGTTTGGTCTTTGTAAACTCTGATGCTGGTGAAGGTTATATTTCAGTTGATGGTAATGAAGGTGACAGAAACAATTTGACATTGTGGAAGAACGGTGACAATTTGATAAAGGCCGCTGCAAACAACTGTAACAACACCATCGTAGTTATTCATTCTGTTGGTCCAGTTTTAGTCGATGAATGGTATGACCACCCTAATGTCACTGCCATTTTGTGGGCTGGTTTACCAGGTCAAGAATCCGGTAACAGTTTGGCTGATGTATTATACGGTAGAGTTAATCCAGGTGCAAAATCTCCTTTTACCTGGGGTAAAACTAGAGAAGCCTATGGTGACTACTTGGTTAGAGAATTAAACAACGGTAACGGTGCTCCTCAAGATGACTTCTCTGAAGGTGTTTTCATTGATTATAGAGGTTTCGACAAGAGAAACGAAACACCAATATACGAATTTGGTCATGGTTTGTCCTATACCACTTTCAATTACAGTGGTTTGCACATTCAAGTTTTAAATGCATCTTCAAACGCCCAAGTCGCTACAGAAACCGGTGCCGCTCCAACTTTTGGTCAAGTTGGTAACGCTTCTGACTATGTCTACCCAGAAGGTTTGACCAGAATTTCCAAATTCATATATCCTTGGTTGAATAGTACTGATTTGAAGGCATCCAGTGGTGACCCATATTACGGTGTTGATACCGCTGAACATGTCCCTGAAGGTGCAACTGATGGTTCCCCACAACCTGTTTTACCAGCTGGTGGTGGTAGTGGTGGTAACCCTAGATTGTACGACGAATTAATCAGAGTATCCGTTACAGTCAAAAATACCGGTAGAGTCGCAGGTGACGCCGTACCTCAATTGTACGTTTCATTAGGTGGTCCAAACGAACCTAAGGTCGTATTAAGAAAGTTCGATAGATTGACATTGAAGCCATCTGAAGAAACCGTTTGGACAACCACTTTGACTAGAAGAGATTTGTCTAATTGGGACGTAGCAGCCCAAGATTGGGTTATAACTTCATATCCAAAGAAAGTTCACGTCGGTTCCTCATCCAGACAATTACCATTACACGCAGCATTACCTAAAGTCCAATAA (SEQ ID NO:12)， 其分別編碼下列所示的氨基酸序列:MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSAQQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTITTSTRPPSGPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNEDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVffFGIMNEPHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTNNIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK (SEQ ID N0:9)和MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSADELAFSPPFYPSPWANGQGEWAEAYQRAVAIVSQMTLDEKVNLTTGTGWELEKCVGQTGGVPRLNIGGMCLQDSPLGIRDSDYNSAFPAGVNVAATWDKNLAYLRGQAMGQEFSDKGIDVQLGPAAGPLGRSPDGGRNWEGFSPDPALTGVLFAETIKGIQDAGWATAKHYILNEQEHFRQVAEAAGYGFNISDTISSNVDDKTIHEMYLWPFADAVRAGVGAIMCSYNQINNSYGCQNSYTLNKLLKAELGFQGFVMSDWGAHHSGVGSALAGLDMSMP⑶ITFDSATSFWGTNLTIAVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLYQPPNFSSWTRDEYGFKYFYPQEGPYEKVNHFVNVQRNHSEVIRKLGADSTVLLKNNNALPLTGKERKVAILGEDAGSNSYGANGCSDRGCDNGTLAMAWGSGTAEFPYLVTPEQAIQAEVLKHKGSVYAITDNWALSQVETLAKQASVSLVFVNSDAGEGYISVDGNE⑶RNNLTLWKNGDNLIKAAANNCNNTIVVIHSVGPVLVDEWYDHPNVTAILWAGLPGQESGNSLADVLYGRVNPGAKSPFTWGKTREAYGDYLVRELNNGNGAPQDDFSEGVFIDYRGFDKRNETPIYEFGHGLSYTTFNYSGLHIQVLNASSNAQVATETGAAPTFGQVGNASDYVYPEGLTRISKFIYPWLNSTDLKASS⑶PYYGVDTAEHVPEGATDGSPQPVLPAGGGSGGNPRLYDELIRVSVTVKNTGRVAGDAVPQLYVSLGGPNEPKVVLRKFDRLTLKPSEETVWTTTLTRRDLSNWDVAAQDWVITSYPKKVHVGSSSRQLPLHAALPKVQ (SEQ ID NO: 11)。
內(nèi)切葡聚糖酶基因從’JJ能夠編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，β -葡糖苷酶基因沒能夠編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，內(nèi)切葡聚糖酶基因從’//具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，β-葡糖苷酶基因沒-ffi具有SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列。由此可以進一步提高內(nèi)切葡聚糖酶基因從和β-葡糖苷酶基因沒的表達效率，以便進一步提高在微生物中直接從纖維素合成脂肪酸酯的效率。
根據(jù)本發(fā)明的另一個具體實施例，第四核酸序列可以編碼脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。因此可以利用脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體表達得到FAR酶，/ / 酶能夠催化脂?；o酶A還原為脂肪醇。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該微生物包含的第一核酸序列編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體表達得到酶酶催化脂酰基輔酶A和脂肪醇兩個底物形成蠟酯。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，第四核酸序列并不受特別限制，只要能夠編碼下列所示的氨基酸序列即可:MEEMGSILEFLDNKAILVTGATGSLAKIFVEKVLRSQPNVKKLYLLLRATDDETAALRLQNEVFGKELFKVLKQNLGANFYSFVSEKVTWP ⑶ ITGEDLCLKDVNLKEEMWREIDWVNLAATINFIERYDVSLLINTYGAKYVLDFAKKCNKLKIFVHVSTAYVSGEKNGLILEKPYYMGESLNGRLGLDINVEKKLVEAKINELQAAGATEKSIKSTMKDMGIERARHWGffPNVYVFTKALGEMLLMQYKGDIPLTIIRPTIITSTFKEPFPGffVEGVRTIDNVPVYYGKGRLRCMLCGPSTIIDLIPADMVVNATIVAMVAHANQRYVEPVTYHVGSSAANPMKLSALPEMAHRYFTKNPWINPDRNPVHVGRAMVFSSFSTFHLYLTLNFLLPLKVLEIANTIFCQWFKGKYMDLKRKTRLLLRLVDIYKPYLFFQGIFDDMNTEKLRIAAKESIVEADMFYFDPRAINWEDYFLKTHFPGVVEHVLN (SEQ ID NO:5)。
根據(jù)本發(fā)明的具體示例，脂?；o酶A還原酶/ / 基因具有下列所示的核苷酸序列:ATGGAAGAAATGGGTTCAATCTTGGAA`TTTTTGGATAATAAGGCTATCTTGGTTACCGGTGCCACTGGTTCCTTGGCTAAGATTTTTGTTGAAAAGGTATTGAGAAGTCAACCTAACGTTAAAAAGTTGTATTTGTTGTTGAGAGCTACAGATGACGAAACCGCTGCATTGAGATTGCAAAACGAAGTTTTCGGTAAAGAATTGTTTAAAGTATTGAAGCAAAATTTGGGTGCAAACTTTTACTCTTTCGTCTCAGAAAAGGTTACAGTTGTTCCAGGTGACATTACCGGTGAAGACTTGTGTTTGAAGGATGTTAATTTGAAGGAAGAAATGTGGAGAGAAATAGATGTCGTTGTAAACTTAGCCGCTACAATTAATTTCATCGAAAGATACGACGTCTCATTGTTGATTAACACCTACGGTGCTAAGTACGTTTTGGATTTCGCTAAGAAATGCAATAAGTTGAAGATATTTGTACATGTCTCTACTGCTTACGTTTCAGGTGAAAAGAATGGTTTGATCTTAGAAAAGCCTTATTACATGGGTGAATCTTTGAACGGTAGATTGGGTTTGGATATAAACGTAGAAAAGAAATTGGTTGAAGCAAAGATTAATGAATTGCAAGCAGCCGGTGCCACTGAAAAATCCATTAAGAGTACAATGAAGGATATGGGTATAGAAAGAGCTAGACACTGGGGTTGGCCAAACGTTTACGTTTTTACTAAGGCATTGGGTGAAATGTTGTTGATGCAATACAAGGGTGACATTCCTTTGACTATAATCAGACCAACAATCATAACTTCCACATTCAAAGAACCATTTCCTGGTTGGGTCGAAGGTGTTAGAACAATTGATAACGTCCCTGTTTATTACGGTAAAGGTAGATTGAGATGTATGTTATGCGGTCCTTCTACCATAATCGACTTAATCCCAGCTGATATGGTCGTTAACGCTACTATTGTAGCAATGGTCGCACATGCCAATCAAAGATATGTTGAACCAGTAACCTACCACGTTGGTTCTTCAGCTGCAAATCCTATGAAATTATCTGCATTGCCAGAAATGGCCCATAGATACTTCACAAAGAATCCATGGATAAACCCTGATAGAAATCCAGTACATGTCGGTAGAGCCATGGTATTTTCCAGTTTCTCAACCTTCCACTTGTATTTGACTTTGAACTTTTTATTGCCATTGAAGGTTTTGGAAATCGCAAACACTATTTTCTGTCAATGGTTCAAGGGTAAATACATGGACTTGAAGAGAAAGACAAGATTGTTGTTGAGATTGGTTGATATCTATAAACCTTACTTATTTTTCCAAGGTATCTTCGATGACATGAACACAGAAAAGTTGAGAATAGCCGCTAAGGAATCTATCGTTGAAGCCGACATGTTTTATTTCGATCCAAGAGCTATTAATTGGGAAGACTACTTTTTGAAGACTCATTTTCCTGGTGTCGTTGAACATGTATTGAACTAA (SEQ ID NO:6)。由此可以進一步提高脂?；o酶A還原酶/ / 基因的表達效率，提1 / / 酶催化脂酸基輔酶A還原為脂肪醇的效率，以便進一步提聞在微生物中直接從纖維素合成脂肪酸酯的效率。
在本發(fā)明中，所使用的術語“微生物”可以為真核微生物，也可以為原核微生物。其類型并不受特別限制。例如，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母，可以為上述微生物的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物優(yōu)選采用酵母，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述微生物優(yōu)選畢赤酵母作為生產(chǎn)生物燃料的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述核酸序列可以來自微生物自身，也可以是外源核苷酸，由此可以利用該微生物體內(nèi)自身代謝途徑完成脂肪酸酯的合成。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述乙醇可以通過外加也可以是微生物自身產(chǎn)生的，例如采用的微生物為產(chǎn)乙醇酵母。由此可以進一步提高利用微生物直接從纖維素合成脂肪酸酯的效率。
適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)、制備重組微生物的方法 根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過常規(guī)的分子生物學方法獲得上述微生物。由此，本發(fā)明還提出了一種適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)可以通過常規(guī)的方法，將目的基因引入微生物細胞中，從而得到前面所述的適于制備脂肪酸酯化合物的微生物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括第一核酸序列，該第一核酸序列編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體。由此，可以通過常規(guī)的分子生物學手段，將第一核酸序列引入到微生物中，從而可以在微生物細胞中過表達酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體。進一步可以通過在微生物細胞內(nèi)過表達?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體，從而發(fā)揮酶的生物活性，進而酶催化脂酰輔酶A和甲醇兩個底物 合成脂肪酸甲酯。
另外，為了在微生物細胞中引入其他的核酸序列，從而為所得到的重組微生物賦予額外的生物學功能。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)中，還可以具有其他的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)中可以進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列編碼2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體；乙醇脫氫酶4/ 或其功能等同體；以及脂酰輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。從而可以借助該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)，在微生物中引入2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體、乙醇脫氫酶4/ 或其功能等同體以及脂酰輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。由此，通過2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體、乙醇脫氫酶其功能等同體以及脂酰輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體的生物學功能，可以便于所合成的脂肪酸酯成為游離狀態(tài)，從而便于最終分離回收脂肪酸酯，從而可以顯著地提高將這些微生物應用于制備脂肪酸酯時的生產(chǎn)效率。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)中，可以進一步包含第三核酸序列，該第三核酸序列編碼內(nèi)切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同體、β -葡糖苷酶基因沒-ffi或其功能等同體。由此，可以通過借助該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)，在微生物細胞中引入內(nèi)切葡聚糖酶基因M7/或其功能等同體；以及葡糖苷酶基因或其功能等同體，從而借助內(nèi)切葡聚糖酶基因萬67/或其功能等同體以及β-葡糖苷酶基因或其功能等同體的生物學功能，可以顯著提高利用該微生物生產(chǎn)脂肪酸酯的生產(chǎn)效率。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)中，還可以進一步包括第四核酸序列，該第四核酸序列編碼脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。借助該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)，能夠有效地將適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)引入到微生物細胞中。通過在該微生物的細胞中過表達脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體，產(chǎn)生/ / 酶，/ / 酶催化脂?；o酶A還原為脂肪醇，由此，脂酰基輔酶A和脂肪醇反應得到蠟酯，以便進一步提高合成脂肪酸酯的效率。
借助上述適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物的方法，并不受特別限制，可以為諸如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、接合作用、轉(zhuǎn)導等等，可以將異源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)穩(wěn)定地或者瞬時引入宿主細胞，所述異源DNA序列參與產(chǎn)生生物燃料或其中間物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，異源DNA序列還包括選擇性標志物，諸如，抗生素抗性，例如新霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素的抗性，彌補營養(yǎng)缺陷型的基因等等。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明還提供了一種獲得重組微生物的方法，該方法包括使用前面適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物，以便獲得所述重組微生物。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例，所得到的重組微生物中可以包含異源核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。關于這些核酸序列，前面已經(jīng)進行了詳細描述，在此不再贅述。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，將上述異源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)引入宿主細胞的順序并不受特別限制。既可以是同時引入到微生物細胞中，也可以是依次引入到微生物細胞中。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以將各個異源DNA序列設置在同一個載體上，也可以設置在不同的載體上，例如各個核酸序列包含在不同的載體上。這些載體可以是本領域中任何已知的表達載體。合適的表達載體包括，但不限于，病毒載體，諸如桿狀病毒載體，噬菌體載體，諸如噬菌體載體，質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，cosmids，細菌人工染色體，病毒載體(例如，基于以下病毒的病毒載體:牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、腺相關病毒、SV40、單純皰疹病毒，等等)，基于Pl的人工染色體，酵母質(zhì)粒，酵母人工染色體，和任意對目的特定宿主具有特異性的其他載體(諸如大腸桿菌、Pseudomonas pi sum和釀酒酵母)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，表達載體上可以進一步包括一種或者多種選擇標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化宿主細胞的表型性狀。所述選擇標記基因編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化宿主細胞存活或者生長必需的蛋白。沒有轉(zhuǎn)化包含選擇標記基因的載體的宿主細胞將不會在培養(yǎng)基中存活。通常的選擇標記基因編碼以下蛋白:(a)提供對抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨芐青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四環(huán)素，(b)彌補營養(yǎng)缺陷型缺陷，或者(c)提供復合培養(yǎng)基沒 有的重要營養(yǎng)物，例如，編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可選的實施方式中，選擇標記基因是提供氨芐青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主細胞，諸如大腸桿菌)的基因。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)可以進一步包括表達調(diào)控序列(啟動子，增強子，等等)，以指導所編碼基因產(chǎn)物的合成，優(yōu)選啟動子，更優(yōu)選IPTG-誘導型啟動子。所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被設置在所述IPTG-誘導型啟動子的控制之下。由此，可以通過在IPTG-誘導型啟動子的控制下，由此容易通過啟動子的調(diào)控，表達目的蛋白，從而實現(xiàn)脂肪酸酯的合成。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以用于本發(fā)明的啟動子可以來源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根據(jù)使用的宿主/載體系統(tǒng)，表達載體可以使用大量合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件中的任意一種，包括組成型和誘導型啟動子，轉(zhuǎn)錄增強子元件，轉(zhuǎn)錄終止子，等等(參見例如，Bitter et al., Methods in Enzymology,153:156-544,1987，通過參照并入本文)。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，用于原核宿主細胞的合適啟動子包括，但不限于能夠識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子，噬菌體λ的PR和PL啟動子，大腸桿菌的trp、recA、熱休克和IacZ啟動子，枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶和Σ特異性啟動子，桿菌噬菌體啟動子，鏈霉菌啟動子，噬菌體λ的 int啟動子，pBR322 β -內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子。關于原核啟動子的綜述可參見Glick，J.1nd.Microbiol.1:277,1987 ；ffaison et al., Benjamin Cummins (1987);和 Sambrook et al.，上文，通過參照并入本文。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，用于真核宿主內(nèi)使用的合適真核啟動子的非限制性實例來源于病毒，包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子；皰疹病毒的TK啟動子；SV40早期啟動子；Rous肉瘤病毒啟動子；巨細胞病毒啟動子；酵母gal4基因啟動子；和IgG啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，合適的誘導型啟動子包括不限于:受體蛋白、代謝物或者化學制品影響的啟動子。具體地，包括:牛白血病病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP pol III啟動子、四環(huán)素誘導型CMV啟動子以及來自trp和Iac操縱子的啟動子。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，前述的核酸序列可以被連接到組成型啟動子上。因而利用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物所得到的重組微生物能夠持續(xù)地表達外源基因，從而代謝合成脂肪酸酯。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)，可以轉(zhuǎn)化的微生物的類型并不受特別限制?？梢詾檎婧宋⑸铮部梢詾樵宋⑸?。其類型并不受特別限制。例如，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母?？梢詾樯鲜鑫⑸锏闹辽僖环N。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物優(yōu)選采用酵母和大腸桿菌，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，上述微生物優(yōu)選畢赤酵母和大腸桿菌作為生產(chǎn)生物燃料的微生物。
脂肪酸酯及其生產(chǎn)方法和系統(tǒng) 在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明還提出了一種生產(chǎn)脂肪酸酯的方法。該方法包括下列步驟:培養(yǎng)微生物，以便生產(chǎn)該脂肪酸酯；以及分離該脂肪酸酯，其中，上述微生物包括第一核酸序列，其中，第一核酸序列編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列。通過在合適的條件下對根據(jù)本發(fā)明實施例的微生物進行培養(yǎng)，在微生物細胞中表達Jr酶或其功能等同體的作用下，微生物細胞通過對底物的代謝，可以合成脂肪酸酯。本領域技術人員可以通過對微生物以及所采用的外源核酸的載體進行分析，能夠獲得最適合的培養(yǎng)條件。
另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，微生物中還可以包含額外的核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。關于這些核酸序列，前面已經(jīng)進行了詳細描述，在此不再贅述。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所采用的微生物的類型不受特別限制?？梢詾檎婧宋⑸?，也可以為原核微生物。例如，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的微生物包括但不限于細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母。可以為上述微生物的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選采用畢赤酵母，以便用于生產(chǎn)生物燃料。這是因為對于酵母而言，易于遺傳修飾，易于控制生長、產(chǎn)生以及減少或者消除降低生物合成途徑效率的副反應。此外，這種修飾的微生物可以直接利用可再生能源以生產(chǎn)可直接用做生物燃料的燃料，不需要專門的儲存或運輸方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，醇類化合物并不受特別限制，可以為碳數(shù)目不超過24的一元醇，優(yōu)選為選自甲醇、乙醇、異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇和脂肪醇的至少一種，由此利用該醇作為底物與脂酰輔酶A合成反應得到脂肪酸酯。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述碳源可以是外加的，也可以是微生物自身生產(chǎn)的，例如采用產(chǎn)碳酵母自身生產(chǎn)的醇可以作為制備脂肪酸酯的底物。由此可以進一步提高利用微生物制備脂肪酸酯的效率。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物可以包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)微生物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述單糖可以為葡萄糖，半乳糖，果糖，甘油，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，利用上述包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列的微生物可以表達得到AWio酶、J服酶和酶。由此他wo酶催化氨基酸代謝中間產(chǎn)物2-酮酸進行脫羧轉(zhuǎn)化為醛，^^^酶催化醛還原為短鏈醇dr酶催化脂酰輔酶A和短鏈醇合成脂肪酸酯，由此利用該方法可以有效地制備得到脂肪酸酯。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物可以包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因沒 /八β-葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，由于該微生物中包含了內(nèi)切葡聚糖酶基因從7八β -葡糖苷酶沒-ffi基因，因此該微生物可以翻譯表達得到兩種纖維素酶，該纖維素酶可以水解纖維素產(chǎn)生單糖，由此進一步利用?；D(zhuǎn)移酶Jr基因表達的基因催化合成脂肪酸酯。由此利用該方法不僅能夠有效地制備得到脂肪酸酯，并且可以直接利用纖維素制備脂肪酸酯。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物可以包含編碼脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)該微生物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述包含編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因可以翻譯表達得到FAR酶，/ / 酶可以催化脂?；o酶A還原為脂肪醇，由此，AT酶催化脂肪醇和脂酰輔酶A合成蠟酯，因此，利用該方法可以進一步提高制備脂肪酸酯的效率。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述 單糖可以為葡萄糖，半乳糖，果糖，甘油。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述微生物可以包含編碼酰基輔酶A還原酶/ / 基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)該微生物。由此利用該方法可以直接利用纖維素制備得到脂肪酸酯。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了一種脂肪酸酯，該脂肪酸酯通過前述的制備脂肪酸酯的方法所得到。
在本發(fā)明的再一個方面，本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括:生物反應器和分離裝置。生物反應器中設置有上述的微生物以及培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)該微生物，以便使該微生物合成脂肪酸酯。分離裝置與生物反應器相連，用于分離生產(chǎn)的脂肪酸酯。由此，利用本發(fā)明的實施例的生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)，可以有效地實施前面所述的生產(chǎn)脂肪酸酯的方法，從而可以有效地用于制備脂肪酸酯。
本發(fā)明的優(yōu)點是在微生物中引入外源基因構(gòu)建一條合成肪酸酯的代謝途徑，最終實現(xiàn)以單糖或纖維素為原料合成脂肪酸酯的目的，不需要通過過多的化學合成反應，減少了環(huán)境的污染，也減少了對石油儲量的消耗。同時，由于微生物生長速度快，便于進行遺傳操作，其抗污染性能優(yōu)異，且人工可以調(diào)節(jié)其生長速度和防止其肆意生長破壞環(huán)境，種種因素表明改造微生物進行工業(yè)生產(chǎn)脂肪酸酯是切實可行的。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用上述微生物表達酰基轉(zhuǎn)移酶基因，以多糖(纖維素等)或單糖(甘油或葡萄糖等)為原料將微生物體內(nèi)來自脂肪酸合成路徑的脂酰輔酶A與不同來源的醇類合成脂肪酸酯。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人經(jīng)過艱苦卓絕的努力完成了微生物體內(nèi)自身的代謝途徑合并兩條或多條代謝途徑生產(chǎn)脂肪酸酯的方法。例如，將來自氨基酸代謝途徑短鏈醇和脂肪酸代謝途徑共同催化合成了脂肪酸短鏈酯，如脂肪酸異戊酯。將來自脂肪酸代謝途徑的脂肪酰輔酶A和脂肪醇共同催化合成了蠟酯。
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
—般方法 下面對本發(fā)明實施例中所采用制備脂肪酸酯的一般方法進行描述，其中，圖f 10中提供了實施例中所涉及的主要載體的示意圖。
、畢赤酵母中合成脂肪酸酯 (O構(gòu)建產(chǎn)脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯工程菌 構(gòu)建了一個可分別以zesion和His為選擇標記的畢赤酵母整合載體pDG。以pPIC3.5k載體為模板PCR擴增His選擇標記表達框。在該片段兩段分別引入了/^挪^和II酶切位點。將該片段通過和欲7 II克隆到經(jīng)feMlI酶切的pGAPZa載體上得到載體pDG。將經(jīng)密碼子優(yōu)化的JcifleioAacier baylyi菌JT1基因通過SfizI和AcoRI克隆到載體pDG上，得到重組載體PDG101。將重組載體pDGlOl導入畢赤酵母菌株GSl 15中，得到DGl工程菌。該工程菌實現(xiàn)了基因的高表達。
將30攝氏度過夜培養(yǎng)的酵母菌工程菌DGl，接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中(每升發(fā)酵培養(yǎng)基含:10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，5g甲醇)。培養(yǎng)24小時后收集菌體，高壓勻漿破細胞，利用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解產(chǎn)物。GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測經(jīng)正己烷溶解的樣品。實驗結(jié)果如圖11所示:酵母工程菌DGl可有效的利用葡萄糖和培養(yǎng)基中外加的甲醇合成C16和C18脂肪酸甲酯。
將30攝氏度過夜培養(yǎng)的酵母菌工程菌DGl和釀酒酵母YPH499，以4:1的比例接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中(每升發(fā)酵培養(yǎng)基含:10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖)。培養(yǎng)24小時后收集菌體，高壓勻漿破細胞，利用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解產(chǎn)物。GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測經(jīng)正己烷溶解的樣品。實驗結(jié)果如圖12所示:在共發(fā)酵的條件下，酵母工程菌DGl可有效的利用葡萄糖合成C16和C18脂肪酸乙酯。
(2)構(gòu)建產(chǎn)脂肪酸短鏈酯工程菌 ①將來自釀酒酵母的2-酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，重組到畢赤酵母整合載體PDG上，得到載體pDG104。將該載體線性化后整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)上述兩個基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母工程菌株DG2。表達基因用于催化2-酮酸脫羧形成醛，表達4/ 基因基因用于催化醛還原形成短鏈醇。上述構(gòu)建的DG2工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇等短鏈醇。
②進一步將經(jīng)密碼子優(yōu)化的JcifleioAacier baylyi菌酰基轉(zhuǎn)移酶JT1基因，重組到畢赤酵母整合載體PDG104上得到載體PDG105.將該載體線性化后整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)切，4/ 和基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母工程菌株DG3。表達基因在于引入短鏈醇合成途徑，可有效地合成異丁醇和異戊醇等短鏈醇。表達基因Jr用于催化脂酰輔酶A與上述合成的短鏈醇發(fā)生酯化反應，形成對應的脂肪酸短鏈酯。上述構(gòu)建的DG3工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸短鏈酯。
③進一步將經(jīng)密碼子優(yōu)化的Hypocrea Jecorina菌內(nèi)切葡聚糖酶基因(endoglucanase II, EG II)和 Aspergillus aculeatus 舊的 β 葡糖苷酶基因(beta-glucosidase, B-GL),重組到載體pDG105上,得到載體pDG109.將該載體線性化后，整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)ADH2、AT、Y￡ II和B-GL基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母工程菌株DG4。表達EG II和B-GL基因用于催化水解纖維素產(chǎn)生單糖。上述構(gòu)建的DG4工程菌實現(xiàn)了以纖維素為唯一碳源合成脂肪短鏈酯。
(3)構(gòu)建產(chǎn)蠟酯工程菌 ①將來自jojoba植物的脂?；o酶A還原酶/ / 基因，重組到畢赤酵母整合載體pDG上得到載體PDG110.將該載體線性化后整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)/ / 基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母 工程菌株DG5。表達/ / 基因用于催化脂酰輔酶A還原形成脂肪醇。上述構(gòu)建的DG5工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為脂肪醇。
②進一步將經(jīng)密碼子優(yōu)化的JcifleioAacier baylyi菌酰基轉(zhuǎn)移酶JT1基因，重組到畢赤酵母整合載體PDGllO上得到載體pDGlll.將該載體線性化后整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)/ / 和基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母工程菌株DG6。表達/ / 基因用于催化脂酰輔酶A還原形成脂肪醇。表達基因用于基因用于催化脂酰輔酶A與脂肪醇發(fā)生酯化反應，形成蠟酯。上述構(gòu)建的DG6工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為蠟酯。
③進一步將經(jīng)密碼子優(yōu)化的Hypocrea Jecorina菌內(nèi)切葡聚糖酶基因(endoglucanase II, EG II)和 Aspergillus aculea tus 菌的 β 葡糖苷酶基因(beta-glucosidase, B -GL),重組到載體pDGlll,得到載體pDG112。將上述載體線性化后，整合到畢赤酵母染色體中，實現(xiàn)EG II和B-GL基因在酵母中的高量表達，得到畢赤酵母工程菌株DG7。表達EG II和B-GL基因用于催化水解纖維素產(chǎn)生單糖。上述構(gòu)建的DG7工程菌實現(xiàn)了以纖維素為唯一碳源合成脂肪短鏈，DG7工程菌實現(xiàn)了以纖維素為唯一碳源合成蠟酯。
、在大腸桿菌內(nèi)合成脂肪酸短鏈酯 將來自釀酒酵母的2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因和經(jīng)密碼子優(yōu)化Acinetobacter baylyi菌?；D(zhuǎn)移酶JT1基因重組到pET28a ( + )上,得到載體pDG113。將pDG113導入大腸桿菌中，得到工程菌DG8?？桝ROlO基因用于催化2-酮酸脫羧形成醛，表達基因基因用于催化醛還原形成短鏈醇。表達基因用于基因用于催化脂酰輔酶A與短鏈醇發(fā)生酯化反應，形成脂肪酸短鏈酯。上述構(gòu)建的DG8工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸短鏈酯。
分別PCR擴增來自釀酒酵母的2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因、經(jīng)密碼子優(yōu)化的^^/7￡^0&^(￡^ baylyi菌?；D(zhuǎn)移酶基因和pET28a ( + )載體上。PCR擴增得到的4個片段之間，通過PCR引物引人了 40-50bp的重疊堿基。4個片段通過one-step isothermal protocol方案組裝得到載體pDG113。將pDG113導入大腸桿菌中，得到工程菌DG8。表達基因用于催化2-酮酸脫羧形成醛，表達^^^基因用于催化醛還原形成短鏈醇。表達基因用于Jr基因用于催化脂酰輔酶A與短鏈醇發(fā)生酯化反應，形成脂肪酸短鏈酯。上述構(gòu)建的DG8工程菌可有效的將單糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸短鏈酯。
將30攝氏度過夜培養(yǎng)的大腸桿菌工程菌DG8，接種到50ml M9發(fā)酵培養(yǎng)基中(包含0.5%酵母提取物、2%葡萄糖)。培養(yǎng)24小時后收集菌體，超聲波破細胞，利用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解產(chǎn)物。GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)檢測經(jīng)正己烷溶解的樣品。實驗結(jié)果如圖19所示:該大腸桿菌工程菌可有效的利用葡萄糖合成各種C16和C18脂肪酸異丁酯、異戊酯等脂肪酸短鏈酯。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、 修改、替換和變型。
權利要求
1.一種微生物，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列編碼選自下列基因的至少一種: ?；D(zhuǎn)移酶Jr基因、或其功能等同體， 任選地，所述Jr基因的功能等同體為來自 Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798> Rhodococcus opacus PD630 、 Mus musculus C57BL/6、以及 Psychrobac ter arc ti cus 273-4 的至少一種。
2.根據(jù)權利要求1所述的微生物，其特征在于，進一步包括第二核酸序列，所述第二核酸序列編碼下列基因的至少之一: 2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體； 乙醇脫氫酶4/ 或其功能等 同體；以及 脂酰輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體， 其中， 任選地，所述2-酮酸脫羧酶基因的功能等同體為來自 Saccharomyces cerevisiae ^ pyruvate decarboxylase 6(PDC6)、以及 Lactococcus lactis 的 a—ketoisovalerate decarboxylase (Kivd)的至少一f中； 任選地，乙醇脫氫酶^^恐或其功能等同體為來自 Saccharomyces cerevisiae 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)、Lachancea kluyveri StJ alcohol dehydrogenase 2(ADH2)、以及Lachancea kluyveri 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)； 任選地，脂酰輔酶A還原酶/ / 基因的功能等同體為來自 Acinetobacter calcoaceticus 白勺 Acrl、 Oryza sa tiva 的 DPW、以及 來自 Synechococcus elongates PCC 7942 的 AAR 的至少一種。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的微生物，其特征在于，進一步包括第三核酸序列以及任選的第四核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列編碼下列: 內(nèi)切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同體；以及 β -葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同體， 所述第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體。
4.根據(jù)權利要求f3任一項所述的微生物，其特征在于， 任選地，所述?；D(zhuǎn)移酶Jr基因編碼SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述?；D(zhuǎn)移酶Jr基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任選地，所述2-酮酸脫羧酶基因編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述2-酮酸脫羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 任選地，所述乙醇脫氫酶4/ 編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述乙醇脫氫酶ADH2具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； 任選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從’//編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從7/具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； 任選地，所述β-葡糖苷酶基因沒-ffi編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列； 任選地，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列， 所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為酵母或大腸桿菌， 任選地，所述微生物為畢赤酵母。
5.一種適于轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列編碼下列: ?；D(zhuǎn)移酶Jr基因或其功能等同體， 任選地，所述Jr基因的功能等同體為來自 Marinobacter hydrocarbonoclas ti cus DSM 8798、Rhodococcus opacus PD630 、Mus musculus C57BL/6、以及Psychrobac ter arc ti cus 273-4 的至少一種， 任選地，所述轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)進一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列編碼下列的至少之一: 2-酮酸脫羧酶基因或其功能等同體； 乙醇脫氫酶4/ 或其功能等同體；以及 脂酰輔酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體， 任選地，所述2-酮酸脫羧酶基因的功能等同體為來自 Saccharomyces cerevisiae ^ pyruvate decarboxylase 6(PDC6)、以及 Lactococcus lactis 的 a—ketoisovalerate decarboxylase (Kivd)的至少一f中； 任選地，乙醇脫氫酶^^恐或其功能等同體為來自 Saccharomyces cerevisiae 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)、Lachancea kluyveri StJ alcohol dehydrogenase 2(ADH2)、以及Lachancea kluyveri 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)； 任選地，脂酰輔酶A還原酶/ / 基因的功能等同體為來自 Acinetobacter calcoaceticus 白勺 Acrl、Oryza sa ti va 的 DPW、以及來自 Synechococcus elongates PCC 7942 的 AAR 的至少一種， 任選地，所述轉(zhuǎn)化微生物的系統(tǒng)進一步包括第三核酸序列以及任選的第四核酸序列，其中， 所述第三核酸序列編碼下列: 內(nèi)切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同體；以及 β -葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同體， 任選地，所述第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶/ / 基因或其功能等同體， 任選地，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被設置在同一個載體或相互不同的載體上。
6.根據(jù)權利要求5任一項所述的系統(tǒng),其特征在于， 任選地，所述?；D(zhuǎn)移酶Jr基因編碼SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述?；D(zhuǎn)移酶Jr基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任選地，所述2-酮酸脫羧酶基因編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述2-酮酸脫羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 任選地，所述乙醇脫氫酶4/ 編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述乙醇脫氫酶ADH2具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； 任選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從’//編碼SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因從7/具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； 任選地，所述β-葡糖苷酶基因沒-ffi編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列； 任選地，所述脂?；o酶A還原酶/ / 基因編碼SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 任選地，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為酵母或大腸桿菌， 任選地，所述微生物為畢赤酵母。
7.一種制備重組微生物的方法，其特征在于，包括使用權利要求5-6任一項所述的系統(tǒng)轉(zhuǎn)化微生物，以便獲得所述重組微生物， 其中，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為酵母或大腸桿菌， 任選地，所述微生物為畢赤酵母。
8.—種生產(chǎn)脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括下列步驟: 培養(yǎng)廣4任一項所述的微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分離所述脂肪酸酯， 其中， 所述微生物包含編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列， 任選地，所述編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列可利用脂肪酰輔酶A和醇類化合物生成脂肪酸酯，任選地，所述醇類化合物為碳源子數(shù)目不超過24的一元醇，優(yōu)選為選自甲醇、乙醇、異丁醇、異戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇， 任選地，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及酰基轉(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物； 任選地，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物， 任選地，所述微生物包含編碼脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因以及?；D(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物； 任選地，所述單糖為葡萄糖，果糖，半乳糖，甘油， 任選地，所述微生物包含編碼酰基輔酶A還原酶/ / 基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因從八β-葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
9.一種脂肪酸酯產(chǎn)品，其是通過權利要求8任一項所述的方法制備的。
10.一種用于生產(chǎn)脂肪酸酯的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 生物反應器，所述生物反應器中設置有權利要求廣4任一項所述的微生物以及培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)所述微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及 分離裝置，所述分離裝置與所述生物反應器相連，用于分離所述脂肪酸酯， 其中， 任選地，所述微生物包含編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列， 任選地，所述編碼?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列可利用脂肪酰輔酶A和醇類化合物生成脂肪酸酯，所述醇類化合物為碳源子數(shù)目不超過24的一元醇，優(yōu)選為選自甲醇、乙醇、異丁醇、異戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇， 任選地，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶4/ 基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物， 任選地，所述微生物包含編碼2-酮酸脫羧酶基因、乙醇脫氫酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及?；D(zhuǎn)移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物； 任選地，所述微生物包含編碼脂酰基輔酶A還原酶/ / 基因以及?；D(zhuǎn)移酶基因的核酸序列，并且采用單糖作為碳源培養(yǎng)所述微生物； 任選地，所述單糖為葡萄糖，半乳糖，果糖或甘油， 任選地，所述微生物包含編碼?；o酶A還原酶/ / 基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因從八β-葡糖苷酶基因以及酰基轉(zhuǎn)移 酶Jr基因的核酸序列，并且采用纖維素作為碳源培養(yǎng)所述微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了微生物及用途，該微生物用于制備脂肪酸酯。該微生物包括第一、第二、第三和第四核酸序列，其中，第一核酸序列編碼?；D(zhuǎn)移酶AT基因或其功能等同體，第二核酸序列編碼2-酮酸脫羧酶ARO10基因或其功能等同體；乙醇脫氫酶ADH2基因或其功能等同體；以及脂酰輔酶A還原酶FAR基因或其功能等同體，第三核酸序列編碼內(nèi)切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同體；以及β-葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同體，第四核酸序列編碼脂?；o酶A還原酶FAR基因或其功能等同體。利用該微生物可以有效地提高制備脂肪酸酯的效率。
文檔編號C12M1/00GK103194419SQ20131011592
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權日2013年4月3日
發(fā)明者劉天罡, 郭道義 申請人:武漢大學