專利名稱：一個長鏈非編碼rna基因在制備干擾和抑制劑上的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一個新克隆的長鏈非編碼RNA基因序列的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是亞洲與部分非洲地區(qū)的高發(fā)腫瘤，其病死率居我國惡性腫瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其發(fā)病機制研究一直是我國醫(yī)學科學研究中的重要課題。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌的一種主要類型,盡管目前在肝細胞癌的診斷和治療方面有了新的進展，但是對于其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的確切機制仍然存在大量未知的問題。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)很多IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要調(diào)節(jié)作用，它具有抑制腫瘤生長和促進腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學作用。IncRNA根據(jù)其基因位置可分為五種類型:正義 IncRNA(sense IncRNA)、反義 IncRNA(antisense IncRNA)、雙向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因內(nèi) IncRNA(intronic IncRNA)及基因間 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被認為是轉(zhuǎn)錄“噪音”的IncRNA，因在基因調(diào)節(jié)中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領(lǐng)域又一研究熱點。近年的研究已表明，IncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。IncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后新的標志物，同時也為腫瘤的治療提供了新的靶點。新一代測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術(shù)的迅猛發(fā)展將基因組水平的研究帶入了一個新的階段，許多基于全基因組的研究成為可能，RNA測序(RNA-Sequencing, RNA-Seq)就是利用新一代測序技術(shù)對生物樣品轉(zhuǎn)錄的全部RNA進行高通量測序，以獲得被測樣品轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)數(shù)據(jù)的一種重要新技術(shù)。最近我們利用新一代測序技術(shù)對肝細胞癌患者活檢標本及正常對照肝組織樣品進行RNA-Seq，在肝癌樣品中檢測到染色體llql3.1區(qū)域存在相鄰的幾個明顯RNA-Seq信號峰，而在正常對照組織中卻沒有，且該染色體區(qū)域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個或多個未知的新基因。我們以此為線索，證實這幾個RNA-Seq峰來自同一個新基因，并克隆了該基因全長序列。該基因全長序列為3526bp，可轉(zhuǎn)錄成多個轉(zhuǎn)錄本，將該基因全長的序列輸入ORF finder軟件進行開放閱讀框預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)明顯的開放閱讀框，說明該基因編碼一個長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。我們從肝癌及正常對照組織中抽提RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR，檢測了該IncRNA的表達情況，結(jié)果顯示該IncRNA在肝癌組織中表達上調(diào)(P〈0.001)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進一步在大樣本中驗證了該IncRNA在肝癌中表達顯著上調(diào)(P〈0.001)。因此針對該IncRNA的檢測制劑可用于肝癌的輔助診斷。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)該IncRNA表達高的患者其生存時間短于該IncRNA表達低的患者(P=0.024)。因此針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于肝癌的預(yù)后判斷。我們還針對該IncRNA基因的序列設(shè)計了用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體，利用該載體在肝癌細胞系中抑制了該IncRNA的表達，且發(fā)現(xiàn)抑制該IncRNA表達可抑制肝癌細胞系的生長。因此針對該IncRNA的抑制制劑也具有肝癌基因治療的潛在用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個新克隆IncRNA基因的應(yīng)用方法，具體是該長鏈非編碼RNA基因在制備干擾和抑制劑上的應(yīng)用方法；根據(jù)該基因序列，設(shè)計并合成了用于RNA干擾封閉該長鏈非編碼RNA表達的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA真核表達載體，利用該載體成功地在肝癌細胞系中抑制了該長鏈非編碼RNA的表達。一個長鏈非編碼RNA基因在制備干擾和抑制劑上的應(yīng)用方法，根據(jù)該長鏈非編碼RNA基因制備了用于干擾其表達，并導致抑制肝癌細胞生長的制劑；該基因轉(zhuǎn)錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所不的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的 序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。所述的制劑是針對新克隆的長鏈非編碼RNA基因設(shè)計的用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體。所述的用于制備用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體所需的4條干擾靶點序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4: GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。針對4條干擾靶點序列，以及載體，設(shè)計可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點粘性末端的DNA雙鏈；具體序列如下:shRNA-ι:5’ -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC TTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-3’3 ' -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’ -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-3’3’ -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5’ -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:
5’ -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3，-GGGCGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCTTGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5，。所述的用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體的制備方法具體如下:I) shRNA 的設(shè)計首先根據(jù)新克隆的長鏈非編碼RNA基因，尋找shRNA祀點，4條靶點序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4: GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT ；以廣泛使用的在人類基因組中沒有任何靶點的Scramble序列作為陰性對照，其序列如下:Scramble:GACACGCGACTTGTACCAC2)針對這4條祀點序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER載體，設(shè)計可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點BglII和HindIII粘性末端的DNA雙鏈；具體需合成的各條寡核苷酸序列及它們配對退回后形成的DNA雙鏈如下:shRNA-Ι:5 ' -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTACTTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-313’ -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5 ' -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-313’ -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:`
5 ' -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5’ -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCT TGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5， Scramble5， -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTCTTTTTA-313’ -GGGCTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’3) shRNA 載體構(gòu)建
化學合成上述4個shRNA和對照的10條單鏈oligo序列，將合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ Μ,互補單鏈各取10 μ I混合；然后將oligo混合物在PCR儀中95°C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段；用BglII和Hind III雙酶切pSUPER質(zhì)粒，回收3.1kb的載體片段，將退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的載體按照3:1的物質(zhì)的量的比例混合，用T4連接酶，16°C連接過夜；轉(zhuǎn)化E.coil感受態(tài)，挑選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR以及測序鑒定，再用Cla I和EcoR I酶切構(gòu)建好的PSUPER質(zhì)粒，2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳，以空白pSUPER為空白對照，判斷插入了目的片段的陽性克隆。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一個新克隆的長鏈非編碼RNA基因序列，并通過原位雜交、熒光實時定量PCR等方法證明該基因在肝癌組織中的特異性表達，為肝癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測提供了強有力的分子生物學工具。也提供了一個具有肝癌潛基因治療潛力和前景的RNA干擾載體，具有深遠的意義和推廣性。


圖1為肝細胞癌和正常對照樣品RNA-Seq結(jié)果及其在染色體上的位置圖，表明通過RNA-seq我們發(fā)現(xiàn)了一個新基因；其中A =RNA-Seq發(fā)現(xiàn)的信號峰位于染色體llql3.1區(qū)段；B =RNA-Seq信號峰與鄰近基因的位置關(guān)系；C:肝細胞癌(HCC)和正常對照(Normal)樣品中RNA-Seq結(jié)果的對比，及克隆擴增該新基因全長序列所用引物設(shè)計示意圖；圖2為RT-PCR證實染色體llql3.1區(qū)段的RNA-Seq峰轉(zhuǎn)錄自同一個基因且剪接成多個轉(zhuǎn)錄本；

A:以肝癌組織cDNA為模板用引物IF和2R及IF和3R進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；B:引物IF和2R及IF和3R擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)TA_clone、測序后發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄本剪接方式；C:引物3F和4R及4F和5R進行RT-PCR擴增的結(jié)果；D:引物3F和4R及4F和5R擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)TA-clone、測序發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄本剪接方式；圖3為GeneRacer克隆新基因5’和3’全長序列；A:GeneRacer實驗策略草圖；B:3’ GeneRacer PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；C:5’和3’ GeneRacer測序結(jié)果得到的該基因5’端和3’端不同的剪接形式；圖4為新克隆的基因及12種不同轉(zhuǎn)錄本，開放閱讀框預(yù)測結(jié)果顯示為長鏈非編碼RNA ；A:通過測序獲得的新克隆基因12種代表性轉(zhuǎn)錄本剪接形式；B:0RF Finder預(yù)測該新基因，未發(fā)現(xiàn)明顯的開放閱讀框，表明該基因編碼長鏈非編碼RNA ；圖5為實時定量PCR檢測該IncRNA在10例正常肝組織和36例肝癌組織中表達的結(jié)果；其中:N代表正常組織，T代表肝癌組織；圖6為原位雜交檢測新克隆IncRNA在正常肝組織(左)及肝癌組織中的表達(右)；表明該IncRNA在正常肝組織中不表達，而在肝癌組織中高表達；圖7為新克隆的IncRNA生存曲線分析結(jié)果；根據(jù)新克隆IncRNA的表達水平將51例肝癌患者分組，IncRNA高表達患者組(28例患者，細虛線)生存時間短于IncRNA低表達患者(23例患者，粗實線)，表明新克隆的IncRNA可用于肝癌患者預(yù)后判斷；圖8為針對該新克隆的IncRNA設(shè)計并構(gòu)建shRNA表達載體，干擾肝癌細胞系HepG2中該IncRNA的表達；表明設(shè)計的4個shRNA載體均可干擾H印G2細胞內(nèi)該IncRNA的表達，四個shRNA載體混合轉(zhuǎn)染細胞，效果更佳；圖9為shRNAs干擾肝癌細胞H印G2中新克隆IncRNA的表達后細胞的生長曲線，表明干擾細胞內(nèi)新克隆IncRNA的表達可以抑制HepG2細胞的生長。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施方式
進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。一、新的IncRNA基因克隆與分析1.材料與方法:1.1試劑及試劑盒瓊脂糖(agrose)等常用生化試劑、膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，lkbladder DNA 分子量 Marker 購自 Invitrogen 公司 j[^RNeasy Mini Kit (Qiagen)抽提試劑盒抽提高質(zhì)量的RNA, SuperScript III (Invitrogen)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。1.2新一代測序技 術(shù)進行RNA測序人肝癌組織樣品和正常肝組織樣品提取總RNA后，過柱純化，保留200nt以上的RNA ；然后富集mRNA，并用二價陽離子高溫加熱的方法將mRNA片斷化；以mRNA短片段為模板；用六堿基隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)純化、末端修復、加堿基A、加測序接頭的步驟，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收片段，并進行PCR擴增完成測序文庫的制備；構(gòu)建好的文庫經(jīng)cBot擴增，用i I lumina soIexa進行測序；對illumina solexa進行RNA測序的結(jié)果進行分析:包括去除低質(zhì)量、污染、接頭的序列，將RNA測序結(jié)果與人類基因組參考序列進行比對和映射，在肝癌樣品中檢測到染色體llql3.1區(qū)域存在相鄰的幾個明顯RNA-Seq信號峰，而在正常對照組織中卻沒有，且該染色體區(qū)域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個或多個未知的新基因。1.3克隆新基因序列 為了驗證在11號染色體所檢測到的各個RNA-Seq峰是否來自同一個RNA序列，我們針對各個RNA-Seq峰分別設(shè)計了正向(Forward, F)引物和反向(Revise, R)引物,利用相鄰峰對應(yīng)引物組合進行PCR擴增.各引物所在的大致位置和方向見圖1C，對應(yīng)的序列如下:IF: 5，-CCCTTGTTTAGCCTCTGCTG-3，，2F: 5，-CCTCTGTCACTGCCACAAAA-3，，2R: 5，-CATGTGGTGAGTGGCTGTG-3，，3F: 5，-TCACTTACCCCTGCGACTCT-3，，3R: 5 ’ -CATCACAGGGTGTGTTTTGC-3’，4F: 5 ’ -GCCCTGCTCTATCAGCAAAC-3，，4R: 5 ’ -GCCTGCTGAGTTTGCTGATA-3’，5R: 5 ’ -CCCAAACCAAGCTGACAAAT-3，。依次對應(yīng)序列表中SEQ ID NO: 13-20。
利用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)擴增未知RNA的5’端及3’端全長序列,針對本項目RNA序列用于GeneRacer反應(yīng)的基因特異性引物(Gene Specific Primer, GSP)大致位置和方向見圖1C，序列如下:Racer Rl:5’ -GCAGAGGCTAAACAAGGGGGTCCTG-3，，序列表中 SEQ ID NO:21 ；Racer F5:5’ -CACTGAATGCCCCACGTCAAAGAAA-3，；序列表中 SEQ ID NO:22 ；RT-PCR 或者 GeneRacer PCR 的產(chǎn)物均用 TA clone 試劑盒(Invitrogen)進行連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆用Sanger法測序，以獲得插入片段的序列。1.4序列分析及生物信息學預(yù)測所用軟件新一代測序技術(shù)進行RNA-Seq發(fā)現(xiàn)的新基因，我們用傳統(tǒng)的Sanger法測序進行了驗證，并用Sanger法測序克隆了該基因的全長序列，Sanger法測序所獲得的序列用DNAStar軟件(DNASTAR Inc.)進行組裝和校對；新克隆基因潛在開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)米用美國國立生物信息研究所(National Center forBiotechnology Information, NCBI)開發(fā)的在線分析軟件 ORF Finder(www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行預(yù)測；潛在開放閱讀框編碼的多肽序列輸入Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)數(shù)據(jù)庫與已知蛋白結(jié)構(gòu)域是否有同源性。2 結(jié)果

2.1RNA-Seq在染色體llql3.1區(qū)域發(fā)現(xiàn)多個相鄰的RNA信號峰通過新一代測序技術(shù)對肝細胞癌活檢組織及正常對照樣品中的RNA進行高通量測序(RNA-Seq)，并以人類基因組參考序列(Build37.3，Hgl9)為模版對RNA-Seq序列進行組裝，我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織中在染色體llql3.1區(qū)域(圖1A)距11號染色體短臂末端物理距離65.6Mb附近(圖1B)存在6個相鄰的較明顯的RNA信號峰(圖1C)，除第5個峰只有50個左右測序讀長(reads)支持外,其余每個峰都有超過100個reads支持,最高達到近400個reads支持(圖1C下半部分)，而同一染色體區(qū)域正常對照樣品中則沒有或僅有痕量的reads (圖1C上半部分)，表明在所檢測的肝癌組織中這一染色體區(qū)段轉(zhuǎn)錄出了一條或多條RNA序列，且轉(zhuǎn)錄水平較高；這些RNA信號峰所在的染色體部位沒有已知基因登錄(圖1B)。為了驗證這幾個RNA-Seq峰到底是來自幾個獨立的RNA序列還是來自同一條RNA序列，我們針對各個RNA-Seq峰分別設(shè)計了正向和反向引物(圖1C)，然后以肝癌組織cDNA為模板，用相鄰峰對應(yīng)的引物配對進行PCR擴增。2.2RT-PCR證實llql3.1區(qū)域多個RNA-Seq峰轉(zhuǎn)錄自同一個基因以肝癌組織cDNA為模版，用引物IF和2R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)擴增出多條目的帶，引物IF和3R也同樣得到了多條帶(圖2A).將目的條帶分別割膠純化、TA克隆，挑選陽性克隆進行測序，發(fā)現(xiàn)引物IF和2R獲得的PCR產(chǎn)物覆蓋了第1、2和3個RNA-Seq峰，且存在至少2種轉(zhuǎn)錄后剪接形式，同樣的，引物IF和3R擴增的PCR產(chǎn)物覆蓋了第廣4個RNA-Seq峰，存在至少3種轉(zhuǎn)錄后剪接形式(圖2B).
用引物3F和4R、4F和5R等組合PCR擴增也得到了類似的結(jié)果(圖2C和圖2D)，證實染色體llql3.1區(qū)段測得的這幾個相鄰的RNA-Seq峰實際上轉(zhuǎn)錄自同一個基因，它們對應(yīng)的DNA片段為同一個基因的不同外顯子，且由PCR和測序結(jié)果可知該基因轉(zhuǎn)錄的RNA存在多種剪接方式.利用引物IF和5R我們擴增了該基因更多種類型的轉(zhuǎn)錄本。由于PCR擴增得到的是DNA雙鏈，僅從測序結(jié)果我們還無法判斷該RNA的實際方向，也還沒得到該RNA5’和3’端全長序列，因此我們進一步利用GeneRacer試劑盒擴增該RNA的5’和3’端全長。2.3GeneRacer 克隆 RNA 全長序列GeneRacer所用引物GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供見圖3A,首先用煙草酸性焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase,TAP)去除RNA5’端帽子(cap)結(jié)構(gòu)，然后在去除帽子結(jié)構(gòu)的RNA5’端用RNA連接酶(RNA Iigase)連接一段特異性RNA接頭序列(該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供圖3A中左端黑色粗線條部分)，接下來用5’端增加了另一段特異性接頭的oligo-dT為引物該接頭序列由GeneRacer試劑盒(Invitrogen)提供,對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA的第一條鏈,此時cDNA就在兩頭都分別加上了兩段特異性的接頭序列。針對這兩端的接頭序列，GeneRacer試劑盒(Invitrogen)分別提供了 5’和3’端的GeneRacer公共引物，再在我們感興趣的目的基因序列中設(shè)計基因特異性引物(gene specific primer, GSP,即前述的Racer Rl和Racer F5)與公共的5’或3’ GeneRacer引物組合進行PCR擴增就可以得到我們感興趣的基因5’和3’端全長序列。將肝癌組織RNA用GeneRacer試劑盒逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(兩頭已加接頭)為模板，利用圖1C中設(shè)計的2條基因特異性GeneRacer引物Racer Rl和Racer F5與試劑盒中的GeneRacer3’公共引物進行PCR擴增(圖3B)，結(jié)果Racer Rl與GeneRacer3’公共引物未能擴出目的條帶，而Racer F5與GeneRacer3’引物則擴出了非常清楚的目的條帶,表明RacerF5靠近目的基因的3’末端，其對應(yīng)的圖1C中第6個RNA-Seq峰就是該新基因的第6號外顯子.利用GeneRacer試劑盒中提供的Hela細胞cDNA為模板，Racer F5與GeneRacer3’引物也未擴出特異性條帶，表明該基因在Hela細胞中不表達或者表達很弱。圖3B中RacerF5與GeneRacerf’公共引物擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果除了有一條很強的目的條帶外，在該條帶上方還有兩條較弱的條帶(圖中 箭頭所示)，表明該基因3’末端可能同樣存在可變剪接。將PCR產(chǎn)物TA clone，Sanger法測序，我們獲得了該新基因3’端三種不同轉(zhuǎn)錄本的序列(圖3C右邊部分).我們接下來用Racer Rl與GeneRacerf’公共引物進行擴增，獲得了該新基因5’端6種不同轉(zhuǎn)錄本的序列(圖3C左邊部分).
2.4新克隆的基因有多個轉(zhuǎn)錄本且沒有明顯的開放閱讀框我們在其他肝癌組織樣本中進一步大量PCR，TA克隆和測序分析，得到了該基因更多的轉(zhuǎn)錄本序列，圖4A是在肝癌組織中表達頻率比較高的12種轉(zhuǎn)錄本剪接模式。將該基因不同的轉(zhuǎn)錄本序列輸入NCBI的ORF finder軟件進行開放閱讀框預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因沒有明顯的開放閱讀框(所有潛在的開放閱讀框均小于500bp)。將所有潛在ORF編碼翻譯為多肽序列與Pfam數(shù)據(jù)庫中已知的蛋白或者結(jié)構(gòu)域進行比對，也未發(fā)現(xiàn)有同源性，表明該基因可能編碼一個長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。二、熒光實時定量PCR1.材料與方法:10例正常肝臟組織和36例肝癌組織抽提總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行熒光實時定量PCR。新克隆IncRNA引物為5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQIDNO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)。用于對照的18S 引物為 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),熒光實時定量PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一個長鏈非編碼RNA基因在制備干擾和抑制劑上的應(yīng)用方法，其特征在于，根據(jù)該長鏈非編碼RNA基因制備了用于干擾其表達，并導致抑制肝癌細胞生長的制劑；該基因轉(zhuǎn)錄本序列為序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ ID NO:1-12任一條所示的序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的制劑是針對該長鏈非編碼RNA基因設(shè)計的用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于制備用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體所需的4條 干擾靶點序列如下:shRNA-1: GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3:GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 針對4條干擾靶點序列，以及載體，設(shè)計可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點粘性末端的DNA雙鏈；具體序列如下:shRNA-Ι:5’-GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC TTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCC TTTTTA-3，3’ -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’-GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGC TTTTTA-3’3 ' -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5’-GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGC TTTTTA-3，3’ -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5’-GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGC TTTTTA-3’3’ -GGGCGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCTT GTTTAGAGT GT GTCTCGACGAAAAATTCGA-5，。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達載體的制備方法具體如下: I) shRNA的設(shè)計 首先根據(jù)新克隆的長鏈非編碼RNA基因，尋找shRNA靶點，4條靶點序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2:GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3:GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT ； 以廣泛使用的在人類基因組中沒有任何靶點的Scramble序列作為陰性對照，其序列如下:Scramble:GACACGCGACTTGTACCAC 2)針對這4條祀點序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER載體,設(shè)計可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩端分別帶限制性酶切位點BglII和HindIII粘性末端的DNA雙鏈；具體需合成的各條寡核苷酸序列及它們配對退回后形成的DNA雙鏈如下:
6.一種制備權(quán)利要求2所述的載體的干擾靶點序列，其特征在于，序列如下: shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。
7.一種制備權(quán)利要求2所述的載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補序列，其特征在于，序列如下:shRNA-Ι:
全文摘要
本發(fā)明涉及一個新克隆的長鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法，具體是該長鏈非編碼RNA基因在制備干擾和抑制劑上的應(yīng)用方法；根據(jù)該基因序列，設(shè)計并合成了用于RNA干擾封閉該長鏈非編碼RNA表達的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA真核表達載體，利用該載體成功地在肝癌細胞系中抑制了該長鏈非編碼RNA的表達。
文檔編號C12N15/11GK103160537SQ20131005980
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者李桂源, 熊煒, 曾朝陽, 李小玲, 向波, 李夏雨, 黃宏斌, 廖前進, 張文玲, 范松青, 石磊, 周鳴, 馬健, 向娟娟, 彭淑平, 周艷宏 申請人:中南大學