編碼來自黃麻木質(zhì)素生物合成途徑的酶的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含關(guān)于黃麻植物中的木質(zhì)素的生物合成途徑。本發(fā)明一般涉及植物木質(zhì)素生物合成基因、由此類基因編碼的多肽、和此類多核苷酸和多肽序列用于控制植物木質(zhì)素生產(chǎn)的用途的領(lǐng)域。還公開的是關(guān)于使用該多核苷酸和多肽影響由黃麻產(chǎn)生的纖維品質(zhì)和量的方法。
【專利說明】編碼來自黃麻木質(zhì)素生物合成途徑的酶的多核苷酸
[0001]相關(guān)申請
[0002]本專利申請要求于2011年4月29日提交的美國臨時專利申請系列號61/480，668的優(yōu)先權(quán)利益。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及黃麻木質(zhì)素生物合成途徑的多個部分的鑒定和表征。更具體而言，本發(fā)明涉及來自黃麻植物的編碼負(fù)責(zé)木質(zhì)素合成的酶的多核苷酸，和使用這些多核苷酸和酶以用于木質(zhì)素產(chǎn)生的基因調(diào)節(jié)和操縱的方法，以給出具有所需木質(zhì)素含量及其他特征的纖維。
【背景技術(shù)】
[0004]木質(zhì)素是通常在多步過程中源自苯丙氨酸的單木質(zhì)醇(monolignol)(羥基肉桂醇)的復(fù)雜芳香族雜聚物。(ffhetten, R.和 Sederoff, R., (1995)Lignin Biosynthesis,Plant Cell，7，第1001-1013頁)。主要沉積在細(xì)胞壁中的這些聚合物確保植物莖的必需機(jī)械強(qiáng)度和最重要地，確保植物維管組織的疏水性。(Vanholme，R.等人(2010)Ligninbiosynthesis and structure,Plant Physiol, 153,第 895-905 頁)。由于其疏水性質(zhì)，木質(zhì)素充當(dāng)維管組織的主要組分，并且在水轉(zhuǎn)運中起必需作用。除了其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運定向作用外，木質(zhì)素還是植物的防御系統(tǒng)的關(guān)鍵組分(Goujon, T.等人(2003)Genes involved inthe biosynthesis of lignin precursors in Arabidopsis thaliana,Plant Physiologyand Biochemis try, 41,第677-687頁)。并不令人驚訝地,環(huán)境條件影響沉積的木質(zhì)素的量。(Boer j an, W.等人(2003) Lignin biosynthesis, Annu Rev Plant Biol, 54,第 519-546頁)。例如，木質(zhì)素生物合成響應(yīng)多種應(yīng)激條件如創(chuàng)傷、非生物脅迫和病原體感染而誘導(dǎo)。木質(zhì)素限制病原體侵入且保護(hù)細(xì)胞壁多糖不受微生物降解作用(Vanholme等人，2010)。
[0005]我們目前對木質(zhì)素生物合成的了解大部分來自這個途徑在擬南芥(A.thaliana)和毛果楊(P.trichocarpa)中的完全了解。(Goujon,等人，2003 ;Shi,等人(2010) Towardsa systems approach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa:transcriptabundance and specificity of the monolignoI biosynthetic genes, Plant CellPhysiol，51，第144-163頁)。存在三種基本單木質(zhì)醇單體:對香豆醇、松柏醇和芥子醇。這些單木質(zhì)醇摻入三個木質(zhì)素單體或構(gòu)件塊內(nèi):對羥基苯基(H)、愈創(chuàng)木基(G)和紫丁香基
(5)。參見圖1。這些單木質(zhì)醇在甲氧基數(shù)目中不同。對羥基苯基(H)沒有甲氧基，愈創(chuàng)木基(G)具有一個甲氧基，而紫丁香基(S)具有兩個甲氧基。(Goujon等人，2003)。然而，除了這三種單木質(zhì)醇外，還可摻入少數(shù)其他類苯基丙烷，例如羥基肉桂醛、羥基肉桂酯和羥基肉桂乙酸酯。(Boerjan等人，2003)。
[0006]在這些基本木質(zhì)素構(gòu)件塊的生物合成后，它們轉(zhuǎn)運至木質(zhì)化區(qū)帶。在木質(zhì)化區(qū)帶中，聚合作用通過經(jīng)由過氧化物酶或漆酶的基于氧化自由基的偶聯(lián)發(fā)生，并且通過與纖維素和半纖維素交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(Boerjan等人,2003 ;Vanholme, R.等人(2008) Ligninengineering, Curr Opin Plant Biol, 11,第 278-285 頁)。當(dāng)多糖基質(zhì)形成完成時，木質(zhì)化在細(xì)胞壁的次生增厚過程中的不同時期中發(fā)生。木質(zhì)素沉積受多糖基質(zhì)的性質(zhì)影響。在初生細(xì)胞壁中，它作為球狀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)；而在次生細(xì)胞壁中，它形成薄片。(Boerjan等人，2003)。
[0007] 雖然木質(zhì)素在植物生命中的作用必不可少，但它是漿和生物燃料工業(yè)中植物材料的成本有效/高效使用中的主要限制因素。木質(zhì)素還限制生物量用于纖維、化學(xué)品和能量生產(chǎn)的用途。木質(zhì)素的去除是非常昂貴的過程，并且這些工業(yè)將獲益于對具有更少木質(zhì)素的生物量或容易降解的木質(zhì)素的接近。在過去幾十年中，已取得木質(zhì)素生物合成途徑的一些了解，盡管該過程的部分并未完全了解。
[0008]盡管木質(zhì)素合成對黃麻植物的總體福利很重要，并且它對纖維質(zhì)量的若干方面有影響，目前不存在詳述黃麻中的木質(zhì)素生物合成的可用信息。因此，存在鑒定、分離且利用來自黃麻植物的涉及木質(zhì)素生物合成的基因和酶的需要。本發(fā)明解決了這個需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個方面是與選自下述的核酸序列具有至少90%序列同一性的分離的核酸分子:SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20、22、24、25、26、28、29、31、33、35、37、39、40、42、44、45、47、49 和 51。
[0010]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15。
[0011]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID N0:16、18和20。
[0012]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:22、24、25、26、28和29。
[0013]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:310
[0014]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:330
[0015]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID N0:35、37和39。
[0016]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:40和42。
[0017]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:44,45和47。
[0018]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:490
[0019]在一個實施例中，分離的核酸分子選自:SEQ ID NO:510
[0020]本發(fā)明的一個方面是與選自下述的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的分離的多肽分子:SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、27、30、32、34、36、38、41、43、46、
48,50和 52。
[0021]在一個實施例中，對于cDNA擴(kuò)增有用的一對正向引物和反向引物選自:SEQ IDN053 和 SEQ ID N054 ；SEQ ID N055 和 SEQ ID N056 ；SEQ ID N057 和 SEQ ID N058 ；SEQ IDN059 和 SEQ ID N060 ;以及 SEQ ID N061 和 SEQ ID N062。
[0022]在某些實施例中，本發(fā)明涉及前述多核苷酸序列或多肽序列中的任何一個，其中所述序列與由SEQ ID NO鑒定的序列中的任一個具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。
[0023]本發(fā)明的一個方面是包含本發(fā)明的分離的核酸分子的表達(dá)載體。
[0024]本發(fā)明的一個方面是與本發(fā)明的多肽分子特異性結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。[0025]本發(fā)明的一個方面是通過本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明的一個方面是源自本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的材料。
[0027]本發(fā)明的一個方面是來自由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的植物的種子。
[0028]本發(fā)明的一個方面是用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染至少一種植物細(xì)胞和使至少一種植物細(xì)胞生長成植物的步驟。
[0029]本發(fā)明的一個方面是改善黃麻植物的生長、纖維產(chǎn)量、纖維強(qiáng)度、疾病抗性或水利用的方法，其包括將本發(fā)明的非天然核酸序列摻入黃麻植物內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:所提議的黃麻的單木質(zhì)醇生物合成途徑。
[0031]圖 2a 和 2b =ColCADK ColCAD2、ColCAD3、ColCAD4、ColCAD5、C0ICAD6 和 ColCAD7與植物CAD蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0032]圖3: Co I CCoAOMT K Co I CCoA0MT2 和 ColCCoA0MT3 與植物 CCoAOMT 蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0033]圖4:Col4CLUCol4CL4和Col4CL6與植物4CL蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0034]圖5:Col6HCTl與植物6HCT蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0035]圖6:ColC3H與植物C3H蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0036]圖7:ColC4Hl和ColC4H2與植物C4H蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0037]圖8 =CoIPALI和ColPAL2與植物PAL蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0038]圖9:ColCCR2與植物CCR蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0039]圖10:ColCCR3與植物CCR蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0040]圖11:ColF5H與植物F5H蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0041]圖12 =CoICOMT與植物COMT蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列比對。
[0042]圖13:ColCAD2 的 DNA 凝膠。
[0043]圖14: Co I CCoAOMT I 的 DNA 凝膠。
[0044]圖15:Col4CLl 的 DNA 凝膠。
[0045]圖16:ColCCR3 的 DNA 凝膠。
[0046]圖17:ColF5H 的 DNA 凝膠。
【具體實施方式】
[0047]十個已知酶家族與單木質(zhì)醇生物合成相關(guān)。(Goujon等人,2003)。該家族是PAL(苯丙氨酸氨裂合酶)、C4H(肉桂酸-4-羥化酶)、4CL(4-香豆酸:輔酶A連接酶)、HCT (對羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸對羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶)、C3H(4-香豆酸3-羥化酶)、CCoAOMT (咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶)、CCR(肉桂酰輔酶A還原酶)、F5H(阿魏酸5-羥化酶)、COMT (咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶)、和CAD (肉桂醇脫氫酶)。所提議的黃麻中的單木質(zhì)醇生物合成途徑的簡圖顯示于圖1中。
[0048]黃麻中的木質(zhì)素生物合成途徑將其復(fù)雜性部分歸因于若干多功能酶的存在，和跨越若干不同基因家族的組成成分酶。類苯基丙烷途徑的第一個酶是PAL (苯丙氨酸氨裂合酶)，其引起苯丙氨酸的脫氨基，產(chǎn)生肉桂酸。該途徑的第二個酶C4H(肉桂酸4-羥化酶)將肉桂酸轉(zhuǎn)換為4-羥基肉桂酸，其隨后為當(dāng)該途徑變得分支時的后續(xù)羥基化和甲基化步驟。酶4CL催化羥基肉桂酸的輔酶A連接，生成用于木質(zhì)素生物合成的活化酚前體。(Hu等人(1999)Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation andgrowth in transgenic trees, Nat Biotech, 17,第 808-812 頁)。
[0049]單木質(zhì)醇途徑中的下一個酶(HCT)催化其為C3H底物的對香豆酰莽草酸/奎尼酸酯的產(chǎn)生。HCT顯示將對香豆酰輔酶A的?；D(zhuǎn)移至莽草酸或奎尼酸。(Hoffman等人(2005) Plant Biosystems, H 139 卷，N0.1，第 50-53 頁)。在 C3 和 C5 處的羥基化步驟分別通過兩種細(xì)胞色素P450酶即4-香豆酸3-羥化酶(C3H)和阿魏酸5-羥化酶(F5H)執(zhí)行。甲基化步驟通過CCoAOMT (咖啡酰輔酶A (CoA) O-甲基轉(zhuǎn)移酶)和COMT (咖啡酸_0_甲基轉(zhuǎn)移酶)執(zhí)行。CCoAOMT是將咖啡酰輔酶A轉(zhuǎn)換為阿魏酰輔酶A(feruloyl-CoA)和將5-羥基阿魏酰輔酶A轉(zhuǎn)換為芥子酰輔酶A(sinapoyl-CoA)的雙功能酶,并且在阿魏酸化多糖的合成中起作用。(Inoue等人，1998)。CCoAOMT已顯示涉及百日菊(Zinnia elegans)的差異管狀兀件中的木質(zhì)素生物合成。(Ye, Z.H.和 Vamer J.E.(1995)Differential expressionof two 0-methyltransferases in lignin biosynthesis in Zinnia elegans, PlantPhysiol.108，第459-467頁)。CCoAOMT涉及植物細(xì)胞壁的強(qiáng)化，并且還涉及通過增加細(xì)胞壁結(jié)合的阿魏酸聚合物形成對創(chuàng)傷或病原體攻擊的應(yīng)答。
[0050]涉及單木質(zhì)醇生物合成途徑的另外的酶是肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)和肉桂醇脫氫酶(CAD)。CCR催化羥基肉桂酰輔酶A酯的還原，以產(chǎn)生肉桂醛，而CAD催化其至肉桂醇的還原。(Goujon等人,2003)。
[0051]涉及單木質(zhì)醇途徑的后期酶之一是肉桂醇脫氫酶(CAD)，其催化松柏醛、5-羥基-松柏醛和芥子醛至相應(yīng)醇的NADPH依賴性轉(zhuǎn)換。(Kim，S.J.等人(2004)Functionalreclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigenefamily in Arabidopsis,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 101,第 1455-60 頁)。在擬南芥屬中，發(fā)現(xiàn)CAD基因的單一突變型AtCAD-C和AtCAD-D具有更低的CAD活性，并且通過雜交兩個突變型獲得的雙重突變型具有莖木質(zhì)素含量的40%降低，從而證實這些是涉及莖木質(zhì)素合成的主要 CAD 基因。(Sibout, R.等人(2005)Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase-C and_Dare the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem ofArabidopsis, Plant Cell, 17,第 2059-76 頁)。
[0052]兩種酶對于單木質(zhì)醇生物合成途徑是特異性的。它們是咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)和肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)。COMT首先在被子植物中鑒定。COMT能夠?qū)⒖Х人徂D(zhuǎn)換為阿魏酸，以及將5-羥基阿魏酸轉(zhuǎn)換為芥子酸。(Dixon，R.A.，等人(2001)Thebiosynthesis of monolignoIs:a〃metabolic grid, " or independent pathways toguaiacyl and syringyl units ? Phytochemistry, 57,第 1069-1084 頁)。在玉米(玉蜀黍(Zea mays))中COMT基因的下調(diào)已顯示引起COMT活性的顯著減少(70_85%的下降)，導(dǎo)致木質(zhì)素含量和組成的改變，指示這種酶是用于木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶。
[0053]由COMT生成的阿魏酸可通過阿魏酸5-羥化酶(F5H)羥基化，以形成5_羥基-阿魏酸，所述阿魏酸5-羥化酶是細(xì)胞色素P450依賴性單加氧酶。F5H還能夠羥基化松柏醛和松柏醇，以分別形成5-羥基-松柏醛和5-羥基-松柏醇。(Meyer，K.等人(1996)Ferulate-5-hydroxylase from Arabidopsis thaliana defines a new family ofcytochrome P450-dependent monooxygenases, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,93,第 6869-74頁)。F5H被認(rèn)為是紫丁香基木質(zhì)素生物合成中的限速步驟，這一提議通過觀察到在F5H表達(dá)中缺陷的擬南芥屬突變型也在長角果和種子中的芥子酸酯累積水平上受到影響而得到支持。(Ruegger,M.等人(1999) Regulation of ferulate-5-hydroxylase expression inArabidopsis in the context of sinapate ester biosynthesis, Plant Physiol.,119,第 101-10 頁)。
[0054]特異性涉及木質(zhì)醇生物合成的第二個酶CCR，催化阿魏酰輔酶A和5-羥基-阿魏酰輔酶A分別轉(zhuǎn)換為松柏醛和5-羥基-松柏醛。這個步驟直接導(dǎo)致G (松柏醛)和S (5-羥基-松柏醛)木質(zhì)素單元的生物合成。(Ma等人，2005)。在煙草中，使用反義構(gòu)建體下調(diào)CCR基因產(chǎn)生具有異常發(fā)育和減少生長的植物，以及異常葉形態(tài)和維管坍塌。還存在G木質(zhì)素化合物水平的相關(guān)減少。(Ralph, J.等人(1998) NMR characterization of alteredlignins extracted from tobacco plants down-regulated for lignification enzymescinnamylalcohol dehydrogenase and cinnamoyl—CoA reductase, Proc.Natl.Acad.SciUSA，95，第 12803-8 頁)。
[0055]基因和轉(zhuǎn)錄物的計算鑒定
[0056]值得注意的是，我們已測定涉及木質(zhì)素生物合成的黃麻酶的序列。木質(zhì)素生物合成的途徑已得到充分表征，并且每種酶在大多數(shù)植物物種中由基因家族編碼。從NCBI和毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi_psfz.0rg/Poptrl_l/)中檢索到擬南芥和毛果楊的總共106個基因序列。(Goujon等人，2003 ；Shi等人，2010)。使用具有以le_20的e值截斷的程序BLASTN,由長蒴黃麻(Corchorus olitorius)基因組裝配的基因模型以及長蒴黃麻和圓果黃麻(C.capsuIaris)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定了黃麻單木質(zhì)醇生物合成基因。(Altschul, S.F. ,等人(1990)Basic local alignment search tool, JMol Biol, 215,第403-410頁)。使用軟件AUGUSTUS對所得的gDNA重疊群實施基因模型預(yù)測。(Stanke，Μ.等人(2004)AUGUSTUS:a web server for gene finding in eukaryotes,Nucleic AcidsResearch, 32, W309-W312)。來自長蒴黃麻和圓果黃麻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因模型和isotig針對NCBI nr (非冗余)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以用于進(jìn)一步證實。對于長蒴黃麻，使用GMAP(具有95%截斷值)在預(yù)測的基因模型上進(jìn)行isotig作圖。(Wu，T.D.和Watanabe，C.K.(2005)GMAP:a genomic mapping and alignment program for mRNA and ESTsequences,Bioinformatics, 21,第 1859-1875 頁)。
[0057]使用CLUSTAL W程序，由ColCAD基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他CAD蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖2a和2b中。下文是與推定的ColCAD蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:PtcCADL4(毛果楊肉桂醇脫氫酶樣蛋白質(zhì)，CADL4, gi224138226) ;RcoCAD(蓖麻(Ricinus communis)醇脫氫酶,推定的，gi25558709) ;FraCAD(草毒(Fragaria x ananassa),肉桂醇脫氧酶，gil3507210)(Chandler 等人(2002)Cloning, expression and immunolocalization pattern of acinnamyl alcohol dehydrogenase gene from strawberry(Fragaria x ananassa),J.Exp.Bot., 53 (375),第 1723-1734 頁)；GhiCAD5(陸地棉(Gossypium hirsatum),肉桂醇脫氫酶 5，gi268528129) ;PtcCAD(毛果楊，gil83585165) ((2010)Towards a systemsapproach for lignin biosynthesis in Populus trichocarpa:transcript abundanceand specificity of the monolignoI biosynthetic genes,Plant Cell Physiol.,51 (I),第144-163頁)；GhiCAD3(陸地棉，gi229368450)(在發(fā)育中的棉纖維中克隆和表達(dá)的類苯基丙烷途徑的基因(Genes of phenylpropanoid pathway cloning and expression indeveloping cotton fibre));和 GhiCAD(陸地棉，gil66865124) ((2009)Molecular andbiochemical evidence for phenylpropanoid synthesis and presence of wall-linkedphenolics in cotton fibers, JIntegr Plant Biol, 51 (7),第 626-637 頁)。
[0058] 使用CLUSTAL W程序，由ColCCoAOMT基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他CCoAOMT蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖3中。下文是與推定的ColCCoAOMT蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:PtrCCoAOMT(顫楊(Populustremuloides), gi3023436) ;GhiCCoA0MT2 (陸地棉，gi229368460);和 GhiCCoAOMTl (陸地棉，gi253509567)。
[0059]使用CLUSTAL W程序，由Col4CL基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他4CL蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖4中。下文是與推定的Col4CL蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:Ccap4CLl (圓果黃麻，gi294514718)；Rco4CL(蓖麻，gi255565415);和 Ptc4CL(毛果楊，gi224074401)。
[0060]使用CLUSTAL W程序，由Col6HCT基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他Col6HCT蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖5中。下文是與推定的Col6HCT蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:CycarHCT(刺荀菜薊(Cynaracardunculus), g1:73671233)((2007)Isolation and functional characterizationof a cDNA coding a hydroxycinnamoyItransferase involved in phenylpropanoidbiosynthesis in Cynara cardunculus, BMC Plant Biol.7,14)；和 PtcHCT(毛果楊，gil83585181)。
[0061]使用CLUSTAL W程序，由ColC3H基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他C3H蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖6中。下文是與推定的ColC3H蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:EglC3H(藍(lán)桉(Eucalyptus globulus),g1:295413824) ;PtcC3H(毛果楊，g1:224139664) jPPalxPgrC3H(銀中楊X大齒楊(Poplusalba XPopulus grandidentata), gi 166209291)。
[0062]使用CLUSTAL W程序，由ColC4H基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他C4H蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖7中。下文是與推定的ColC4H蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:GarC4H(亞洲棉(Gossypium arborium),gi9965897)和 GarC4H(亞洲棉，gi9965899)。
[0063]使用CLUSTAL W程序，由ColPAL基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他PAL蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖8中。下文是與推定的ColPAL蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:JcoPAL(麻瘋樹(Jatropha Curcas),gill3203757)和 PtrPAL(毛果楊，g1:183585195)。
[0064]使用CLUSTAL W程序，由ColCCR2基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他CCR蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖9中。下文是與推定的ColCCR2蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中=AthCCR(擬南芥，gi =15237678)；CofCCR(油茶(Camellia oleifera), gi228480464);和 AlyCCR(琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata), g1:297793385)。
[0065]使用CLUSTAL W程序，由ColCCR3基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他CCR蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖10中。下文是與推定的ColCCR3蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:RcoCCR(蓖麻，gi =255556687)和AthCCR(擬南芥，g1:15226955)。
[0066]使用CLUSTAL W程序，由ColF5H基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他F5H蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖11中。下文是與推定的ColF5H蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:EglF5H(藍(lán)桉，gi =255970299)和PtcF5H(毛果楊，gi =6688937)。
[0067]使用CLUSTAL W程序，由CoICOMT基因編碼的推定蛋白質(zhì)與在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得的其他COMT蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對顯示于圖12中。下文是與推定的CoICOMT蛋白質(zhì)比對的蛋白質(zhì)列表，其中GeneBank登記號在圓括號中:GhiC0MT(陸地棉，gi =253509569)和 EcaCOMT (赤按(Eucalyptus camaldulensis)，g1:262474806)。
[0068]啟動子區(qū)的基序分析
[0069]對于預(yù)測的基因模型中的每一個，提取2000bp的上游區(qū)的兩條鏈，并且針對PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics, psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索順式基序序列(Lescot,M.,等人(2002) PlantCARE, a database of plant cis-actingregulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promotersequences, Nucleic Acids Res, 30,第325-327頁)。如果發(fā)現(xiàn)所選序列的任何部分與附近基因重疊，則上 游區(qū)的該部分排除在進(jìn)一步分析外。匯集已知涉及響應(yīng)多個發(fā)育過程和脅迫的重要基序列表(表1)。
[0070]表1:在黃麻單木質(zhì)醇生物合成基因的啟動子區(qū)中發(fā)現(xiàn)的基序列表
[0071]
【權(quán)利要求】
1.一種與選自下述的核酸序列具有至少90%序列同一'性的分離的核酸分子:SEQ IDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、16、18、20、22、24、25、26、28、29、31、33、35、37、39、40、42、44、45、47,49和 51。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子與所述核酸序列具有至少95%序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子與所述核酸序列具有至少98%序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子與所述核酸序列具有至少99%序列同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子與所述核酸序列具有至少100%序列同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13 和 15。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13 和 15。
8.根據(jù)權(quán)利要求 3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13 和 15。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13 和 15。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13 和 15。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:16、18和20。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO: 16、18和20。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO: 16、18和20。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO: 16、18和20。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:16、18和20。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:22>24>25、26、28 和 29。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:22、24、25、26、28 和 29。
18.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:22、24、25、26、28 和 29。
19.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO:22>24>25、26、28 和 29。
20. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:22、24、25、26、28 和 29。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:31。
22.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:31。
23.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:31。
24.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO:31。
25.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:31。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:33ο
27.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:33。
28.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:33。
29.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO:33。
30.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:33。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:35、37和39。
32.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:35、37和39。
33.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:35、37和39。
34.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:35、37和39。
35.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:35、37和39。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:40和42。
37.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:40和42。
38.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:40和42。
39.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:40和42。
40.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:40和42。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:44、45和47。
42.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:44、45和47。
43.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:44、45和47。
44.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:44、45和47。
45.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:44、45和47。
46.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:49ο
47.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:49。
48.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:49。
49.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:49。
50.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID NO:49ο
51.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分尚的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID NO:51 ο
52.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:51。
53.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:51。
54.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分尚的核酸分子,其中所述分子選自:SEQID N0:51。
55.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述分子選自:SEQID N0:51。
56.—種與選自下述的氨基酸序列具有至少90%序列同一'丨生的分離的多肽分子:SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、17、19、21、23、27、30、32、34、36、38、41、43、46、48、50 和 52。
57.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分離的多肽分子，其中所述分子與所述氨基酸序列具有至少95%序列同一1丨生。
58.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分離的多肽分子，其中所述分子與所述氨基酸序列具有至少98%序列同一1丨生。
59.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分離的多肽分子，其中所述分子與所述氨基酸序列具有至少99%序列同一1丨生。
60.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分離的多肽分子，其中所述分子與所述氨基酸序列具有至少100%序列同一1丨生。
61.選自下述的對于cDNA擴(kuò)增有用的一對正向引物和反向引物:SEQID N053和SEQID N054 ；SEQ ID N055 和 SEQ ID N056 ； SEQID N057 和 SEQ ID N058 ；SEQ ID N059 和 SEQIDN060 ;以及 SEQ ID N061 和 SEQ ID N062。
62.—種包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子的表達(dá)載體。
63.一種與根據(jù)權(quán)利要求31所述的多肽分子特異性結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。
64.一種包含根據(jù)權(quán)利要求37所述的載體的經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞。
65.一種源自根據(jù)權(quán)利要求39所述的轉(zhuǎn)基因植物的材料。
66.一種來自根據(jù)權(quán)利要求39所述的轉(zhuǎn)染植物的種子。
67.一種用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括下述步驟: 用根據(jù)權(quán)利要求37所述的載體轉(zhuǎn)染至少一種植物細(xì)胞；和 使所述至少一種植物細(xì)胞生長成植物。
68.一種改善黃麻植物的生長、纖維產(chǎn)量、纖維強(qiáng)度、疾病抗性或水利用的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1所述的非天然核酸序列摻入黃麻植物內(nèi)。
【文檔編號】C12N15/82GK103987722SQ201280032223
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月29日
【發(fā)明者】M.阿拉姆, H.罕, M.扎曼, M.K.烏丁, M.S.哈克, M.S.伊斯拉姆, M.S.阿扎姆 申請人:孟加拉朱特研究所