一種海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊和其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物與環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白腐菌共固定化方法，具體涉及一種海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊和其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白腐菌能夠在好氧條件下實現(xiàn)對異生質(zhì)的降解，在廢水處理、環(huán)境修復(fù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。白腐菌對異生質(zhì)的降解開始于次生代謝階段，主要依靠其分泌的木質(zhì)素降解酶系。該胞外酶系主要包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，它們通過引發(fā)一系列的自由基反應(yīng)實現(xiàn)異生質(zhì)的間接的降解。
[0003]然而，將白腐菌直接用于廢水處理會有一些不可避免的缺點(diǎn)。首先，白腐菌為絲狀真菌，抗剪切力差，反應(yīng)器中剪切力太大會破壞其菌絲結(jié)構(gòu)，影響其產(chǎn)酶；太小會影響水體的傳質(zhì)和溶氧從而影響菌的生長和降解能力。另外，白腐菌生長和產(chǎn)酶受水質(zhì)環(huán)境影響較大，這意味著在實際應(yīng)用中要人為的對廢水成分進(jìn)行控制，限制了其應(yīng)用的范圍，增加了應(yīng)用成本。
[0004]單純的固定化白腐菌可有效提高白腐菌對環(huán)境的適應(yīng)能力，但是白腐菌的產(chǎn)酶仍受自身代謝的限制。單純的固定化木質(zhì)素降解酶系可擺脫白腐菌代謝影響，提高廢水的處理效率，但是木質(zhì)素降解酶系中除漆酶外，其它兩種酶都以過氧化氫為直接底物來啟動反應(yīng)，且在實際操作中過氧化氫的量很難控制，這限制了錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種可應(yīng)用于廢水處理的，海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊。同時，本發(fā)明還提供了其制備方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案為:
一種海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊，其特征在于:所述生物微膠囊包含有殼體以及殼體內(nèi)部芯材；殼體材料為海藻酸鈣凝膠，海藻酸鈣凝膠內(nèi)部包埋白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體；殼體內(nèi)部芯材為氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液，氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液內(nèi)部分散有白腐菌細(xì)胞和白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體；所述的白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體的木質(zhì)素降解酶總酶活濃度大于60U/L。
[0007]所述的白腐菌細(xì)胞為白腐菌菌絲或孢子；白腐菌細(xì)胞為菌絲時，濃度10_300g/L，濕重；白腐菌細(xì)胞為孢子時，濃度500-10000個/mL。
[0008]氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液中，氯化鈣和羧甲基纖維素鈉濃度均大于0.005g/mL0
[0009]所述的生物微膠囊粒度大小為:3-15mm ;殼體厚度為:0.2-2mm0
[0010]上述海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊的制備方法，包括以下步驟:
O白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體的制備:將白腐菌接種于液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)6-10天，過濾，收集菌絲，備用；過濾后的濾液經(jīng)透析，濃縮，制得粗酶液；向粗酶液中加入飽和硫酸銨溶液和磷酸緩沖液，攪拌15-20min，得反應(yīng)液；向反應(yīng)液中滴加濃度為25%的戊二醛，交聯(lián)，離心，用醋酸緩沖液洗滌，得到白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體；
2)白腐菌懸液的制備，從下述a或b中選用任一方法制備白腐菌懸液:
a將步驟I)所收集的菌絲，接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-8天后，刮取培養(yǎng)基中的白腐菌孢子分散于氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液中，制得白腐菌懸液；
b將步驟I)中收集到的菌絲打散，直接分散于氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液中，制得白腐菌懸液；
3)共固定化微膠囊的制備:取步驟I)中制得的胞外酶交聯(lián)聚集體分散于海藻酸鈉水溶液中，得溶液A ;然后再取步驟I)中制得的胞外酶交聯(lián)聚集體分散于步驟2)中的白腐菌懸液中，得溶液B ;攪拌下將溶液B滴加到溶液A中，攪拌成囊，再加無菌水稀釋，過濾，得到微膠囊，然后將微膠囊置于氯化鈣水溶液中固定，過濾，用無菌水洗滌3-4次，得到海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊。
[0011]所述的，步驟I)中，液體培養(yǎng)基的組成為:2 g/L ΚΗ2Ρ04、0.25 g/L MgS04、0.1 g/LCaCl2、5 mg/L MnS04、5 mg/L VB1、0.2 g/L 酒石酸錢、20 g/L 葡萄糖和 150 mL/L 的微量元素儲備液；
所述的微量元素儲備液的組成為=NaCl 1.0g/L、MgSO4-7H20 3.0g/L、FeSO4-7H20100mg/L、CoSO4WH2O 100mg/L、CaCl2 100mg/L、ZnSO4*7H20 100mg/L、CuSO4*5H20 10mg/L、KAl (SO4) 2 100mg/L、H3BO3 lOmg/L 和 NaMoO4 10mg/L。
[0012]所述的，步驟I)中，粗酶液、飽和硫酸銨溶液和磷酸緩沖液的體積比為1:5-9:
0-1 ;所述的磷酸緩沖液pH為7.4，濃度為0.2-0.5M。
[0013]所述的，步驟I)中25%戊二醛在反應(yīng)液中的體積濃度為0.2-0.4%。
[0014]所述的，步驟I)中交聯(lián)為恒溫震蕩交聯(lián)，交聯(lián)溫度為30°C，交聯(lián)時間為1.5_9h，交聯(lián)的震蕩頻率為60_100rpm，離心速度為10000r/min，離心時間為20min。
[0015]所述的，步驟I)中醋酸緩沖液pH為4.5，濃度為20mM。
[0016]所述的，步驟I)中粗酶液包含木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶中的一種或多種。
[0017]所述的，步驟2)中，制得的白腐菌懸液中，含有濕重濃度為10_300g/L的菌絲或濃度為500-10000個/mL的孢子。
[0018]所述的，步驟2)中，氯化鈣-羧甲基纖維素鈉水溶液中，氯化鈣和羧甲基纖維素鈉的濃度均大于0.0lg/mL。
[0019]所述的，步驟2)中，固體培養(yǎng)基的組成為:200g/L 土豆浸出液，20g/L葡糖糖，3g/L磷酸二氫鉀，1.5g/L硫酸鎂和20g/L瓊脂。
[0020]所述的，步驟3)中，胞外酶交聯(lián)聚集體的木質(zhì)素降解酶總酶活濃度大于60U/L ; 所述的，步驟3)中，海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的濃度為0.005-0.04g/mL ; 所述的，步驟3 )中，攪拌成囊時間為I_5min，當(dāng)溶液B滴加到溶液A中時，溶液B中的氯化鈣會迅速與溶液A中的海藻酸鈉反應(yīng)成嚢，攪拌的目的是為了防止兩個微膠囊粘連，微膠囊壁厚會隨時間的變化而變厚，成囊后用無菌水稀釋過濾也是為了防止微膠囊的粘連。
[0021]所述的，步驟3)中，氯化I丐水溶液中固定時間為30_60min，固定所用氯化I丐水溶液中CaCl2濃度為0.02-0.03g/mL，氯化鈣水溶液的體積為所得共固定微膠囊體積的I倍以上。
[0022]所述的，步驟3)中，滴加操作可用醫(yī)用注射器、蠕動栗等可用于滴加的設(shè)備；攪拌操作可用磁力攪拌器等攪拌設(shè)備。
[0023]本發(fā)明制備海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊的原理為:生物微膠囊是一種將生物大分子或微生物、動植物細(xì)胞包封在一層親水性的半透膜內(nèi)所形成的珠狀微膠囊，可為固定在內(nèi)部的微生物或酶提供微環(huán)境，促進(jìn)微生物的生長以及酶的催化作用。
[0024]白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體包埋于海藻酸鈣凝膠中作為壁材，分散于氯化鈣-羧甲基纖維素鈉溶液中的白腐菌孢子或菌絲以及交聯(lián)酶聚集體作為芯材形成共固定化微膠囊。在降解過程中，白腐菌交聯(lián)酶聚集體首先參與異生質(zhì)降解，與此同時，白腐菌在代謝過程中分泌的H2O2產(chǎn)生酶系可為交聯(lián)酶聚集體提供H2O2，促進(jìn)異生質(zhì)的降解。
[0025]本發(fā)明技術(shù)方案其有益效果為:
1、本發(fā)明直接將白腐菌胞外酶直接制成交聯(lián)酶聚集體，省去了將木質(zhì)素降解酶系提純的步驟，可有效降低生產(chǎn)成本。
[0026]2、本發(fā)明中胞外酶交聯(lián)聚集體在微膠囊的外部首先與異生質(zhì)接觸，可有效減少降解的啟動時間，提高降解效率，且可起到對膠囊內(nèi)部白腐菌的保護(hù)作用。同時，膠囊內(nèi)部的白腐菌所分泌的產(chǎn)過氧化氫酶系可為交聯(lián)酶聚集體提供直接底物，促進(jìn)降解。
[0027]3、本發(fā)明膠囊內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞生長提供一個微環(huán)境，有利于菌體的生長。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明海藻酸鈣-羧甲基纖維素鈉共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微膠囊的制備工藝流程。
【具體實施方式】
[0029]
下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實施例僅用于闡明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制；在本發(fā)明構(gòu)思的前提下，對本發(fā)明方案的簡單改進(jìn)及替換都屬于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
[0030]下述實例中所用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實例中所用的材料、試劑如無特殊說明，均可直接購買或由常規(guī)方法得到。
[0031]1、液體培養(yǎng)基組分:2 g/L KH2PO4^0.25 g/L MgS04、0.1 g/L CaCl2,5 mg/L MnSO4'5 mg/L VB1、0.2 g/L酒石酸銨、20 g/L葡萄糖和150 mL/L的微量元素儲備液。
[0032]2、微量元素儲備液的組分:NaCl 1.0g/L, MgS04*7H20 3.0g/L, FeSO4*7H20 10mg/L、CoS04.7H20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、ZnSO4.7H20 100mg/L、CuS04.5H20 10mg/L、KAl (SO4)2100mg/L、H3BO3 lOmg/L 和 NaMoO4 10mg/L。
[0033]3、固體培養(yǎng)基的組成為:200g/L 土豆浸出液，20g/L葡糖糖，3g/L磷酸二氫鉀，1.5g/L硫酸鎂和20g/L瓊脂。
[0034]4、降解體系的構(gòu)建:含40mg/L染料的液體培養(yǎng)基。
[0035]實施例1
選取Pheuwrocheiete(購自廣東微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號為
GIM3.383)為白腐菌菌種。
[0036]I)白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體的制備:將白腐菌/3AMerocAgeie chrysosporiun^種于液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)10天，過濾收集菌絲，菌絲備用，濾液進(jìn)行透析，濃縮，制得粗酶液；向粗酶液中加入飽和硫酸銨溶液和磷酸緩沖液(0.2M，pH7.4)，粗酶液、飽和硫酸銨溶液和磷酸緩沖液體積比為1:6:1，磁力攪拌器攪拌下聚集15min，得反應(yīng)液；向反應(yīng)液中滴加25%戊二醛，使戊二醛最終體積濃度為0.25%，恒溫震蕩交聯(lián)3h，交聯(lián)溫度為30°C，交聯(lián)震蕩頻率為60rpm，離心速度為10000r/min，離心時間lOmin，用醋酸緩沖液(20mM，pH4.5)洗滌，得白腐菌胞外酶交聯(lián)聚集體；
2)白腐菌懸液的制備:將步驟I)所收集的菌絲，接種