專利名稱：反膠束萃取純化木質(zhì)素過氧化物酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種萃取純化酶的方法，尤其涉及一種反膠束萃取提純木質(zhì)素過氧化物酶的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的復(fù)雜的近似球狀的芳香族高聚體，其降解難度減緩了地球上碳循環(huán)的速度。木質(zhì)素過氧化物酶Hignin Peroxidase,^ )、錳過氧化物酶 (Manganese Peroxidase,Mn )和漆酶、Laccase)構(gòu)成木質(zhì)素降解體系，研究表明，LiP在木素降解中起關(guān)鍵作用。此酶具有廣泛的底物范圍和極強(qiáng)的氧化能力，利用該酶降解各種污染物已成為當(dāng)今世界環(huán)境污染治理的研究熱點(diǎn)。目前，LiP的純化方法多采用鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析，這些方法存在操作時間長，不易放大等缺點(diǎn)。反膠束純化技術(shù)彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn)，且具有成本低，可以重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
反膠束是溶解在有機(jī)溶劑中的表面活性劑在超過臨界膠束濃度時自發(fā)形成的聚集體。當(dāng)含反膠束的有機(jī)溶劑和蛋白質(zhì)水溶液接觸時，蛋白質(zhì)在靜電作用和疏水作用下進(jìn)入有機(jī)相，然后再調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)臈l件，使蛋白質(zhì)從有機(jī)相重新反萃取到水相中，以達(dá)到純化的目的。在萃取過程中，可以通過改變PH、離子強(qiáng)度、表面活性劑種類和濃度等因素實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)酶的選擇性萃取。因此，萃取條件對純化效果有著至關(guān)重要的作用。目前，反膠束萃取技術(shù)局限于應(yīng)用化學(xué)表面活性劑，常用的化學(xué)合成表面活性劑在酶催化反應(yīng)過程中與酶蛋白表面易產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電相互作用，使酶蛋白易變性失活，從而降低酶催化作用的有效性，阻礙了反膠束萃取純化酶的進(jìn)展。因此，開發(fā)一種更好的萃取純化酶的方法成為蛋白質(zhì)及酶制備的一個重要內(nèi)容。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種環(huán)保安全、操作簡便且成本低的反膠束萃取純化木素過氧化物酶(LiP)的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種反膠束萃取純化木素過氧化物酶的方法，包括以下步驟(1)配制反膠束溶液配制包括生物表面活性劑、異辛烷和正己醇的反膠束溶液，其中所述生物表面活性劑為鼠李糖脂；(2)前萃過程將配制好的木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液與所述反膠束溶液混合，(磁力)攪拌，離心后靜置分相，留取上層有機(jī)相；(3)后萃過程將所述上層有機(jī)相與緩沖液混合，(磁力)攪拌，離心后靜置分相，留取下層水相，得到純化后的木質(zhì)素過氧化物酶溶液。
分別測定所述下層水相中的蛋白質(zhì)萃取率(EE%)和LiP酶活回收率(AR%)，并分析所述下層水相及所述下層水相中粗酶液的成分。
上述的技術(shù)方案中，反膠束溶液中生物表面活性劑的濃度優(yōu)選為2. 75 mmol/L 3.0mmol/L;所述反膠束溶液中正己醇與異辛烷的體積比優(yōu)選為1 1 1 1. 2。
上述的技術(shù)方案中，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液優(yōu)選是由黃孢原毛平革菌 (.Phanerochaete cArj^ms/^ri )經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵后制備得到。更優(yōu)選的，所述培養(yǎng)發(fā)酵的過程具體包括在高壓滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種黃孢原毛平革菌孢子，每升所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種的孢子數(shù)為4X108 5X108個，37°C 38°C溫度、150r/min 180r/min 轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)6 8天，除去所得培養(yǎng)液中的孢子和菌絲，離心處理后即得木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液。
優(yōu)選的，所述步驟(2)的前萃過程中，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液的pH值為 3. 0 3. 5，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液中還含有濃度為0. 04mol/L 0. 045mol/L的KCl 溶液。
所述步驟(2)的前萃過程中，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液與所述反膠束溶液是按1 1 1 1.2的優(yōu)選體積比混合。
優(yōu)選的，所述步驟(3)的后萃過程中，所述緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的PH值為6. 0 6. 5，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中還含有濃度為0. 5mol/L 0. 55mol/L的KCl溶液。
所述步驟(3)的后萃過程中，所述上層有機(jī)相與所述緩沖液是按1 1 1 1.2 的優(yōu)選體積比混合。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)采用反膠束技術(shù)只需前萃和后萃兩步就可以達(dá)到萃取純化的目的，步驟簡單，操作方便。
(2)萃取純化LiP酶活回收率高，純化程度高。
(3)純化結(jié)果可以通過有效測定和分析得到證實(shí)。
(4)具有提取時間短，可在室溫下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)容易放大等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于工業(yè)上粗酶液的初步提純。


圖1為實(shí)施例1中KCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率和LiP酶活回收率的影響。
圖2為實(shí)施例2中后萃過程中混合液pH值對蛋白質(zhì)萃取率和LiP酶活回收率的影響。
圖3為本發(fā)明具體實(shí)施方式
中聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1 一種本發(fā)明的反膠束萃取純化木素過氧化物酶的方法，具體包括以下步驟 (1)配制反膠束溶液本實(shí)施例的反膠束溶液包括生物表面活性劑、異辛烷和正己醇， 其中表面活性劑為鼠李糖脂；配制時將鼠李糖脂經(jīng)超聲振蕩培養(yǎng)后溶于體積比為1 1的異辛烷和正己醇混合液中，配制成40mL、濃度為2. 75mmol/L的反膠束溶液(即鼠李糖脂-正己醇-異辛烷溶液)。4
(2)前萃過程在500mL錐形瓶中裝高壓滅菌后的常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)基IOOmL,接種4 X IO8個黃孢原毛平革菌BKM-F-1767(不限于此菌株，其他的黃孢原毛平革菌菌株均可) 孢子到該液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C溫度、150r/min轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)6天，用紗布除去所得培養(yǎng)液中的孢子和菌絲，10000rpm/min離心處理IOmin后即得LiP粗酶液；在LiP粗酶液中加入KC1，分別配制成KCl 濃度為 0. 01mol/L、0. 02 mol/L、0. 03 mol/L、0. 04 mol/L、0. 05 mol/ L和0. 06 mol/L的LiP粗酶液各5mL，LiP粗酶液的pH值均為3. 0 ；將含有不同KCl濃度的各LiP粗酶液與本實(shí)施例步驟(1)中配制的反膠束溶液按1 1的體積比混合，磁力攪拌 30min, 10000rpm/min離心IOmin后靜置分相，留取上層有機(jī)相。
(3)后萃過程將前萃過程中留取的上層有機(jī)相與含0. 5mol/L KCl, pH值為6. 0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1 1的體積比混合，磁力攪拌30min，10000rpm/min離心 IOmin后靜置分相，留取下層水相，得到純化后的木質(zhì)素過氧化物酶溶液。
采用紫外分光光度法分別測定所得下層水相中的蛋白質(zhì)含量和LiP酶活，測量結(jié)果如圖ι所示，測量結(jié)果顯示，前萃過程中KCl濃度較低時，蛋白質(zhì)萃取率和LiP酶活回收率都較低，隨著離子濃度的增大開始呈增長趨勢，但當(dāng)KCl濃度高于0. 04mol/L時，萃取效率又有所下降。本實(shí)施例最佳條件下的測量結(jié)果如下表1所示。
表1 實(shí)施例1中最佳條件下的純化結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種反膠束萃取純化木質(zhì)素過氧化物酶的方法，包括以下步驟(1)配制反膠束溶液配制包括生物表面活性劑、異辛烷和正己醇的反膠束溶液，其中所述生物表面活性劑為鼠李糖脂；(2)前萃過程將已備好的木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液與所述反膠束溶液混合，攪拌，離心后靜置分相，留取上層有機(jī)相；(3)后萃過程將所述上層有機(jī)相與緩沖液混合，攪拌，離心后靜置分相，留取下層水相，得到純化后的木質(zhì)素過氧化物酶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反膠束溶液中鼠李糖脂的濃度為2. 75 mmol/L 3.0mmol/L ；所述反膠束溶液中正己醇與異辛烷的體積比為1 1 1 1.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液是由黃孢原毛平革菌chrysosporium)經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵后制備得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)發(fā)酵的過程具體包括在高壓滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種黃孢原毛平革菌孢子，每升所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種的孢子數(shù)為4X108 5X108個，37°C 38°C溫度、150r/min 180r/min轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)6 8天，除去所得培養(yǎng)液中的孢子和菌絲，離心處理后即得木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(2)的前萃過程中，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液的PH值為3. 0 3. 5，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液中還含有濃度為0. 04mol/L 0. 045mol/L的KCl溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(2)的前萃過程中，所述木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液與所述反膠束溶液是按1 1 1 1.2的體積比混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)的后萃過程中，所述緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的PH值為6. 0 6. 5，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中還含有濃度為0. 5mol/L 0. 55mol/L的KCl溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)的后萃過程中，所述上層有機(jī)相與所述緩沖液是按1 1 1 1.2的體積比混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種反膠束萃取純化木質(zhì)素過氧化物酶的方法，包括以下步驟配制包括生物表面活性劑、異辛烷和正己醇的反膠束溶液，其中生物表面活性劑為鼠李糖脂；將配制好的木質(zhì)素過氧化物酶粗酶液與所述反膠束溶液混合，攪拌，離心后靜置分相，留取上層有機(jī)相；將所述上層有機(jī)相與緩沖液混合，攪拌，離心后靜置分相，留取下層水相，得到純化后的木質(zhì)素過氧化物酶溶液。本發(fā)明的方法環(huán)保安全、操作簡便且成本低。
文檔編號C12N9/08GK102533688SQ20121005819
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者彭馨, 曾光明, 袁興中, 郭靈芝, 黃華軍 申請人:湖南大學(xué)