透明質(zhì)素合成酶基因及其表達(dá)的制作方法

文檔序號：571596閱讀：741來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>食品,飲料機(jī)械,設(shè)備的制造及其制品加工制作,儲藏技術(shù)

專利名稱：：透明質(zhì)素合成酶基因及其表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)以在透明質(zhì)酸(HA)制備領(lǐng)域中解決一種或多種問題。這些問題是通過分離和應(yīng)用具有編碼酶活性透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因的編碼區(qū)的核酸區(qū)段而解決的，所述基因為負(fù)責(zé)M鏈生物合成的基因，如來自A或C組鏈球菌、多殺巴斯德氏桿菌、硫磺礦硫化葉菌和Ectocarpussiliculosus病毒的HAS基因。在此處公開的HAS基因是從適當(dāng)?shù)奈⑸飦碓吹腄NA克隆的，并通過基因工程插入到有用的重組構(gòu)建體中，該構(gòu)建體被引入到芽孢桿菌細(xì)胞中以制備HA及制備大量的HAS酶本身。術(shù)語"透明質(zhì)酸合成酶"、"透明質(zhì)素合成酶"和"HA合成酶"是可互換使用的以描述使糖胺聚糖多糖鏈多聚化的酶，該多糖鏈由IH，3和IH，4連接的交替的葡糖酸酸和N-乙酰葡糖胺糖組成。例如術(shù)語"seHAS"描述源自類馬鏈球菌的HAS酶，其中編碼seHAS酶的基因的表達(dá)通過提供逃避內(nèi)吞作用和免疫監(jiān)視的方式而與鏈球菌的A組和C組菌株的毒性相關(guān)。本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸合成酶基因、d)NA和基因產(chǎn)物(HAS)的分離和表征，其可用于使葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺多聚化以形成糖胺聚糖透明質(zhì)酸。本發(fā)明鑒定了HAS座位，并公開了編碼來自類馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、多殺巴斯德氏桿菌、硫磺礦硫化葉菌、炭疽芽孢桿菌pX01和Ectocarpussiliculosus病毒的酶活性HAS基因的核酸序列。HAS基因也提供了新探針以估計細(xì)菌樣品生產(chǎn)透明質(zhì)酸的潛力。通過應(yīng)用在此處提出的技術(shù)和知識，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠獲得編碼HAS基因的額外的核酸區(qū)段。如那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識的，根據(jù)本公開內(nèi)容，這些優(yōu)點提供了顯著的效用以能夠控制MS基因的表達(dá)和控制所產(chǎn)生的HAS基因產(chǎn)物即HAS酶的特性。因此,本發(fā)明針對純化的核酸區(qū)段的分離，該核酸區(qū)段具有編碼酶活性HAS的編碼區(qū)，不論它是原核還是真核來源的。這是可能的，因為該酶(事實上是基因)是在真核生物和一些原核生物兩者中發(fā)現(xiàn)的。也已知真核生物可生產(chǎn)HA并因而具有HA合成酶基因，該基因可連同本發(fā)明一起使用。本發(fā)明編碼HA合成酶的核酸區(qū)段定義為分離的不含總?cè)旧w或基因組DM的，從而它們可易于通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行操作。因此，如在此處所用的，短語"純化的核酸區(qū)段"指分離的不含無關(guān)染色體或基因組DNA的DNA區(qū)段，并且該區(qū)段保持使得其能夠用于重組技術(shù)實踐的狀態(tài)，如分立的分離DNA片段形式的DNA,或者插入了這種片段的載體(如質(zhì)粒、噬菌體或病毒)。本發(fā)明包含重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是包含重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該載體包含具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶SEQIDNO:2、10、12、14、16、18或20的編碼區(qū)的純化的核酸區(qū)段。純化的核酸區(qū)段可以含有SEQIDNO:1、9、11、13、15、17或19的核苷酸序列。重組載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔中的至少一種而引入芽孢桿菌細(xì)胞中。在上文中描述的編碼區(qū)可處于啟動子的控制之下,如革蘭氏陽性相容性啟動子或芽孢桿菌相容性啟動子。重組宿主細(xì)胞也可包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當(dāng)修飾的RNA聚合酶啟動子被RNA聚合酶識別時，RNA聚合酶能夠以比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子高的量表達(dá)RNA。這種修飾可為突變或串聯(lián)的啟動子元件的存在，該元件可為相同的或不同的啟動子元件。此外，重組宿主細(xì)胞可進(jìn)一步包括至少-種在天然芽孢桿菌細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)的額外的mRNA穩(wěn)定或去穩(wěn)定元件。芽孢桿菌細(xì)胞可具有至少UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc之一的增強(qiáng)的生產(chǎn)。可選擇地，重組宿主細(xì)胞可進(jìn)-一步具有至少一種純化的核酸區(qū)段,該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體途徑酶中有功能活性的酶的編碼區(qū)，該酶如選自UDP-葡萄糖脫氫酶.UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合的酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶。這種純化的核酸區(qū)段可在上述重組載體中提供或在不同的重組載體中提供。當(dāng)在相同的載體上提供時，2個編碼區(qū)可處于至少--個啟動子的至少-個拷貝的控制下或在不同啟動子的控制下。至少一個編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的核酸區(qū)段的存在將向重組宿主細(xì)胞提供比天然宿主細(xì)胞更高的活性，其中該天然宿主細(xì)胞也表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶。在進(jìn)一步的選擇中，重組宿主細(xì)胞可包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變增加了從中轉(zhuǎn)錄的mRNA的半衰期、編碼具有增加的轉(zhuǎn)錄效率的mRNA或發(fā)生于UDP-糖前體生物合成基因中的核糖體結(jié)合位點中，從而核糖體對該核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。本發(fā)明進(jìn)一步包含生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含通過引入在上文中描述的純化的核酸區(qū)段而構(gòu)建在上文中描述的重組宿主細(xì)胞，并使該重組宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。芽孢桿菌宿主可于約25。C到約42t:的溫度范圍生長于化學(xué)確定成分培養(yǎng)基、復(fù)合培養(yǎng)基或含有葡萄糖和至少N-乙酰葡糖胺和葡糖胺之一的培養(yǎng)基中。然后回收分泌的透明質(zhì)酸，且回收的透明質(zhì)酸可進(jìn)一步從培養(yǎng)基中提取并然后純化。例如，透明質(zhì)酸可通過至少過濾、離心和絮凝作用之一而從細(xì)胞和殘渣中分離，隨后濃縮透明質(zhì)酸，然后通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養(yǎng)基中分離濃縮的透明質(zhì)酸。該分離可進(jìn)一步包括三氯乙酸的添加，這促進(jìn)細(xì)胞和殘渣與透明質(zhì)酸的分離。沉淀劑可為乙醇、有機(jī)溶劑或化合物和脂族的帶正電的鹽中的至少一種，且可選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎗。本發(fā)明進(jìn)一歩包含通過在上文中描述的方法制備的透明質(zhì)酸。具體地，本發(fā)明涉及1.—種重組宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞是包含重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，所述重組載體包含具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，其中編碼區(qū)在啟動子的控制之下。2.項目1的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。3.項目1的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。4.項目3的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。5.項目1的重組宿主細(xì)胞，其中純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)處于革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下。6.項目5的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。7.項目1的重組宿主細(xì)胞,其中枯草芽孢桿菌進(jìn)一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段,其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。8.項目1的重組宿主細(xì)胞，其中重組載體進(jìn)一歩包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段。109.項目8的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制之下的。10.項目8的重組宿主細(xì)胞,其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。11.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；使宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。12.項目11的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。13.根據(jù)項目11的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。14.根據(jù)項目13的方法，該方法進(jìn)一步包含純化提取的透明質(zhì)酸的步驟。15.項目11的方法，該方法進(jìn)一歩包含引入純化的核酸區(qū)段的步驟，該核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。16.項目11的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同的啟動子控制之下的。17.項目11的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同的啟動子控制之下的。18.項目11的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。19.項目11的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。20.項目19的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。21.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。22.項目21的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的歩驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。23.項目21的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。24.項目21的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之F的。25.項目21的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。26.根據(jù)項目21的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。27.根據(jù)項目26的方法，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。28.項目21的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。29.項目28的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。30.—種重組宿主細(xì)胞,其中重組宿主細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞,其包含—種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口—種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。31.項目30的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。32.項目30的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。33.項目30的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。34.項目33的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。35.項目30的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。36.--種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組載體包含—種純化的核酸區(qū)段，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口—種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。37.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。38.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。39.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。40.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。41.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。42.項目36的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。43.項目42的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。44.由包含下面步驟的方法制備的透明質(zhì)酸將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。45.由項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:3的核苷酸序列。46.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。47.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)--步限定為使芽孢桿菌宿主于約25t:約42t;在化學(xué)確定成分的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。48.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25。C約42。C在復(fù)合培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。49.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖以及N-乙酰葡糖胺和葡糖胺兩者中至少一種的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。50.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中回收分泌的透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為--通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸；—濃縮分離的透明質(zhì)酸；禾口一通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養(yǎng)基中分離濃縮的透明質(zhì)酸。51.由根據(jù)項目50的方法制備的透明質(zhì)酸，其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步包括添加三氯乙酸,這促進(jìn)細(xì)胞和殘渣與透明質(zhì)酸的分離。52.由根據(jù)項目50的方法制備的透明質(zhì)酸，其中沉淀劑是醇、有機(jī)溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。53.由根據(jù)項目52的方法制備的透明質(zhì)酸,其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎗。54.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。55.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中該方法進(jìn)一步包括引入純化的核酸區(qū)段的步驟，其中該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。56.由根據(jù)項目55的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。57.由根據(jù)項目55的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。58.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼13區(qū)是在來自革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。59.由根據(jù)項目44的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段是通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔的至少一種引入到芽孢桿菌宿主的。60.—種重組宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含純化的核酸區(qū)段的重組載體,該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。61.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。62.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。63.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)--步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當(dāng)修飾的RNA聚合酶啟動子由RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子更大的量表達(dá)RNA。64.項目63的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是突變。65.項目63的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是串聯(lián)啟動子元件。66.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸載體具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)。67.項目66的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP—葡萄糖脫氫酶。68.項目66的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。69.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使RNA穩(wěn)定元件。70.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使:rm去穩(wěn)定元件。71.項目60的重組宿主細(xì)胞,其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少-一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。72.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期。73.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。74.項目60的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。75.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟14將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段弓I入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。76.項目75的方法，其中在引入具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。77.項目75的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。78.根據(jù)項目75的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。79.項目78的方法，其中RNA聚合酶啟動子的所述修飾是突變。80.項目78的方法，其中RNA聚合酶啟動子的所述修飾是串聯(lián)啟動子元件。81.根據(jù)項目75的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。82.根據(jù)項目81的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。83.根據(jù)項目81的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。84.根據(jù)項目75的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少多-一個的信使RNA穩(wěn)定元件。85.根據(jù)項目75的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。86.根據(jù)項目75的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。87.根據(jù)項目75的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種突變的內(nèi)源UI)P-糖前體生物合成基因，其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP-糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。88.根據(jù)項目75的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)-一步包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。89.根據(jù)項目88的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。90.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段弓I入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。91.由項目90的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:13的核苷酸序列。92.由根據(jù)項目90的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。93.由根據(jù)項目92的方法制備的透明質(zhì)酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。94.由根據(jù)項目92的方法制備的透明質(zhì)酸，其中所述:RM聚合酶啟動子的修飾是串聯(lián)啟動子元件。95.由根據(jù)項目92的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。96.由根據(jù)項目95的方法制備的透明質(zhì)酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。97.由根據(jù)項目95的方法制備的透明質(zhì)酸,其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。98.由根據(jù)項目90的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使RNA穩(wěn)定元件。99.由根據(jù)項目90的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少--個的信使RNA去穩(wěn)定元件。100.由根據(jù)項目90的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。101.由根據(jù)項目90的方法制備的透明質(zhì)酸,其中在將具有編碼SEQIDNO:14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP-糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。102.由根據(jù)項目9()的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN():14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。103.由根據(jù)項目102的方法制備的透明質(zhì)酸，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。104.—種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是包含重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組載體包含具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的。105.項目104的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。106.項目104的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。107.項目106的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。108.項目104的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。109.項目108的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。110.項目104的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞，且其中宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。111.項目104的重組宿主細(xì)胞，其中重組載體進(jìn)一歩包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段。112.項目111的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在至少一個啟動子的至少-個拷貝的控制之下的。113.項目111的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。114.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段弓I入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之F的；使宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。115.項目114的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。116.根據(jù)項目114的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。117.根據(jù)項目116的方法，該方法進(jìn)-步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。118.根據(jù)項目114的方法，該方法進(jìn)一步包含引入純化的核酸區(qū)段的步驟,其中該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。119.項目114的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。120.根據(jù)項目114的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。121.根據(jù)項目114的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的歩驟中，該純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDN0:9的核苷酸序列。122.根據(jù)項目114的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。123.根據(jù)項目122的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。124.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN():l()所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。125.項目124的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。126.項目124的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。127.項目124的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。128.項目124的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。129.根據(jù)項目124的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。130.根據(jù)項目129的方法，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。131.項目124的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的歩驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。18132.項目131的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。133.—種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞，該細(xì)胞包含一種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口-一種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。134.項目133的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。135.項目133的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。136.項目133的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。137.項目136的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。138.項目133的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。139.一種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組載體包含一種純化的核酸區(qū)段，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口一種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。140.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。141.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。142.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之F的。143.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。144.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。145.項目139的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。146.項目145的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。147.由包含下面歩驟的方法制備的透明質(zhì)酸將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。148.由項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQID19NO:3的核苷酸序列。149.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。150.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)--步限定為使芽孢桿菌宿主于約25"C約42t:在化學(xué)確定成分的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。151.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主于約2S。C約42"C在復(fù)合培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。152.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖和至少N-乙酰葡糖胺和葡糖胺之一的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。153.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中回收分泌的透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為—通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸；--濃縮分離的透明質(zhì)酸；禾口一通過至少--種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養(yǎng)基中分離濃縮的透明質(zhì)酸。154.由根據(jù)項目153的方法制備的透明質(zhì)酸，其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步包括添加三氯乙酸，這促進(jìn)細(xì)胞和殘渣與透明質(zhì)酸的分離。155.由根據(jù)項目153的方法制備的透明質(zhì)酸,其中沉淀劑是醇、有機(jī)溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。156.由根據(jù)項目155的方法制備的透明質(zhì)酸，其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鑰。157.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。158.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中該方法進(jìn)一步包括引入純化的核酸區(qū)段的步驟，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。159.由根據(jù)項目158的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。160.由根據(jù)項目158的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。161.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼SEQIDN0:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在來自革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。162.由根據(jù)項目147的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDN0:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段是通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔的至少一種引入到芽孢桿菌宿主的。163.—種重組宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞,該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含純化的核酸區(qū)段的重組載體,該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:l()所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。164.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。165.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。166.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當(dāng)修飾的RNA聚合酶啟動子由RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比內(nèi)源:RM聚合酶啟動子更大的量表達(dá):RNA。167.項目166的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是突變。168.項目166的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是串聯(lián)啟動子元件。169.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸載體具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)。170.項目169的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。171.項目169的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。172.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使RNA穩(wěn)定元件。173.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少--個的信使RNA去穩(wěn)定元件。174.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū),從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UD:P-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。175.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期。176.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。177.項目163的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。178.--種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP—GlcUA和UDP-GlcNAc中至少--種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。179.項目178的方法，其中在引入具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。180.項目178的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。181.根據(jù)項目178的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一歩包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。182.項目181的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。183.項目181的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯(lián)啟動子元件。184.根據(jù)項目178的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。185.根據(jù)項目184的方法，其中UDP_糖前體生物合成途徑的酶是UDP_葡萄糖脫氫酶。186.根據(jù)項目184的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。187.根據(jù)項目178的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的歩驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使RNA穩(wěn)定元件。188.根據(jù)項目178的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:l()所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。189.根據(jù)項目178的方法,其中在將具有編碼酶SEQIDNO:IO所示活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段,該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。190.根據(jù)項目178的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP-糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。191.根據(jù)項目178的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。22192.根據(jù)項目191的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。193.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。194.由項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:9的核苷酸序列。195.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的歩驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。196.由根據(jù)項目195的方法制備的透明質(zhì)酸，其中所述:RM聚合酶啟動子的修飾是突變。197.由根據(jù)項目195的方法制備的透明質(zhì)酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯(lián)啟動子元件。198.由根據(jù)項目195的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。199.由根據(jù)項目198的方法制備的透明質(zhì)酸,其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP—葡萄糖脫氫酶。200.由根據(jù)項目198的方法制備的透明質(zhì)酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。201.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的歩驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使謹(jǐn)穩(wěn)定元件。202.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。203.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的歩驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖23前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。204.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因,其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP-糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。205.由根據(jù)項目193的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:IO所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UD:P-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。206.由根據(jù)項目205的方法制備的透明質(zhì)酸，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。207.—種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是包含重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組載體包含具有編碼SEQIDN0:12所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的。208.項目207的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。209.項目207的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。210.項目209的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。211.項目207的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。212.項目211的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。213.項目207的重組宿主細(xì)胞，其中枯草芽孢桿菌細(xì)胞進(jìn)一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。214.項目207的重組宿主細(xì)胞，其中重組載體進(jìn)一步包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段。215.項目214的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制之下的。216.項目214的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。217.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下歩驟將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；使宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾n回收分泌的透明質(zhì)酸。218.項目217的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。219.根據(jù)項目217的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。220.根據(jù)項目219的方法，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。221.根據(jù)項目217的方法，該方法進(jìn)一步包含引入純化的核酸區(qū)段的步驟，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。222.根據(jù)項目217的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。223.根據(jù)項目217的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之F的。224.根據(jù)項目217的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQII)N():ll的核苷酸序列。225.根據(jù)項目217的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。226.根據(jù)項目225的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。227.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。228.項目227的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。229.項目227的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。230.項目227的方法，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。231.項目227的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。232.根據(jù)項目227的方法，其中回收透明質(zhì)酸的步驟包含從培養(yǎng)基中提取分泌的透明質(zhì)酸。233.根據(jù)項目232的方法，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。234.項目227的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。235.項目234的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。236.一種重組宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞，該細(xì)胞包含一種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口—種包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。237.項目236的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。238.項目236的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。239.項目236的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。240.項目239的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。241.項目236的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。242.—種重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組載體包含一種純化的核酸區(qū)段，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDN():12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口—種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。243.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。244.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之F的。245.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中編碼酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。246.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。247.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸。248.項目242的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段的編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的控制之下的。249.項目248的重組宿主細(xì)胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。250.由包含下面步驟的方法制備的透明質(zhì)酸將具有編碼SEQIDN0:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區(qū)是在啟動子的控制之F的；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。251.由項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:3的核苷酸序列。252.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。253.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25。C約42。C在化學(xué)確定成分的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。254.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25t:約42。C在復(fù)合培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。255.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖以及N-乙酰葡糖胺和葡糖胺兩者中至少一種的培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸。256.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中回收分泌的透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步限定為一通過過濾、離心和絮凝作用中至少--種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸；—濃縮分離的透明質(zhì)酸；禾口—通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養(yǎng)基中分離濃縮的透明質(zhì)酸。257.由根據(jù)項目256的方法制備的透明質(zhì)酸,其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細(xì)胞和殘渣中分離透明質(zhì)酸的步驟進(jìn)一步包括添加三氯乙酸，這促進(jìn)細(xì)胞和殘渣與透明質(zhì)酸的分離。258.由根據(jù)項目256的方法制備的透明質(zhì)酸，其中沉淀劑是醇、有機(jī)溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。259.由根據(jù)項目258的方法制備的透明質(zhì)酸，其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鐵。260.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，該方法進(jìn)一步包含對提取的透明質(zhì)酸進(jìn)行純化的步驟。261.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中該方法進(jìn)一步包括引入純化的核酸區(qū)段的歩驟，該純化的核酸區(qū)段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。262.由根據(jù)項目261的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在相同啟動子的控制之下的。263.由根據(jù)項目261的方法制備的透明質(zhì)酸，其中編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)是在不同啟動子的控制之下的。264.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段的編碼SEQIDN0:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)是在來自革蘭氏陽性細(xì)菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。265.由根據(jù)項目250的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區(qū)段是通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔的至少--種引入到芽孢桿菌宿主的。266.一種重組宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中27至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含純化的核酸區(qū)段的重組載體，該純化的核酸區(qū)段具有編碼SEQIDN0:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。267.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。268.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞。269.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當(dāng)修飾的RNA聚合酶啟動子由RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子更大的量表達(dá)RNA。270.項目269的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是突變。271.項目269的重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾是串聯(lián)啟動子元件。272.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)。273.項目272的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。274.項目272的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。275.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多一個的信使RNA穩(wěn)定元件。276.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。277.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。278.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期。279.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。280.項目266的重組宿主細(xì)胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。281.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。282.項目281的方法，其中在引入具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段的步驟中，該純化核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。283.項目281的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。284.根據(jù)項目281的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。285.項目284的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。286.項目284的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯(lián)啟動子元件。287.根據(jù)項目281的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。288.根據(jù)項目287的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。289.根據(jù)項目287的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。290.根據(jù)項目281的方法,其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少多-一個的信使RNA穩(wěn)定元件。291.根據(jù)項目281的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。292.根據(jù)項目281的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。293.根據(jù)項目281的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包括至少一種突變的內(nèi)源UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。294.根據(jù)項目281的方法，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。295.根據(jù)項目294的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的29結(jié)合親和力。296.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段弓I入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcMc中至少--種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；使芽孢桿菌宿主在培養(yǎng)基上生長以分泌透明質(zhì)酸；禾口回收分泌的透明質(zhì)酸。297.由項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中純化的核酸區(qū)段包含根據(jù)SEQIDNO:11的核苷酸序列。298.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種比內(nèi)源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。299.由根據(jù)項目298的方法制備的透明質(zhì)酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。301.由根據(jù)項目298的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區(qū)段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的，該純化的核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區(qū)。302.由根據(jù)項目300的方法制備的透明質(zhì)酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。303.由根據(jù)項目300的方法制備的透明質(zhì)酸,其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP—葡萄糖焦磷酸化酶。304.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少多--個的信使RNA穩(wěn)定元件。305.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括比在用于形成重組宿主細(xì)胞的芽孢桿菌宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的至少少一個的信使RNA去穩(wěn)定元件。306.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進(jìn)一步包括至少一種核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區(qū)，從而該重組宿主細(xì)胞比表達(dá)內(nèi)源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細(xì)胞具有更大的活性。307.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導(dǎo)致從突變的UDP-糖前體基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的半衰期的增加。308.由根據(jù)項目296的方法制備的透明質(zhì)酸，其中在將具有編碼SEQIDNO:12所示酶活性乳房鏈球菌透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。309.由根據(jù)項目307的方法制備的透明質(zhì)酸,其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結(jié)合位點上發(fā)生的，從而核糖體對核糖體結(jié)合位點具有增加的結(jié)合親和力。310.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段。311.--種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主生物中；和使宿主生物生長以分泌透明質(zhì)酸。312.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入到宿主中；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。313.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含一種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾n一種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。314.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞具有引入的載體，該載體包含—種具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段；禾口一種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。315.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。316.—種宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)，該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。317.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。318.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn);禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。319.--種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQIDNO:10所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段。320.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:10所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主生物中；和使宿主生物生長以分泌透明質(zhì)酸。321.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN():14所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入到宿主中；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。322.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含—種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:IO所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口—種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。323.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞具有引入的載體，該載體包含--種具有編碼SEQIDNO:10所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段；禾口—種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。324.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDN():l()所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；和使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。325.一種宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞具有UDP-GlcUA和UDPGlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)，該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:IO所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。326.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:10所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。327.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:IO所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。328.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段。32329.—種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主生物中;和使宿主生物生長以分泌透明質(zhì)酸。330.--種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入到宿主中；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。331.一種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含—種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)；禾口--種包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。332.—種宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞具有引入的載體，該載體包含一種具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段；禾口—種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)。333.由下面方法制備的透明質(zhì)酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中；和使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。334.—種宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)，該重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步具有包含核酸區(qū)段的載體，該核酸區(qū)段具有編碼SEQIDN0:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)。將具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。336.由含有以下步驟的方法制備的透明質(zhì)酸將具有編碼SEQIDNO:12所示透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強(qiáng)的生產(chǎn)；禾口使宿主生長以分泌透明質(zhì)酸。附圖簡述圖1描述seHAS和鄰HAS基因之間的相互雜交不發(fā)生。用于泳道1禾n2的A組探針僅與A組DNA(泳道2)雜交，而用于泳道3禾n4的C組探針僅與泳道3雜交。圖2圖解說明seHAS與細(xì)菌、病毒和真核MS蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。圖3圖解說明一些已知的透明質(zhì)素合成酶之間可能的進(jìn)化關(guān)系和相似性。圖4描述由各種基因工程處理的鏈球菌HAS酶生產(chǎn)的HA的大小分布。圖5圖解說明大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達(dá)。圖6描述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)中的重組HA生產(chǎn)。圖7描述鏈球菌HA合成酶的純化。圖8描述由在酵母膜中表達(dá)的重組鏈球菌HAS合成的HA的凝膠過濾分析。圖9是用特殊抗體對重組seHAS的蛋白質(zhì)印跡分析。圖10是由重組seHAS和spHAS生產(chǎn)的HA大小分布的動力學(xué)分析。圖11圖解seHAS的親水圖和預(yù)測的膜結(jié)合區(qū)域。圖12是膜中seHAS的拓?fù)鋵W(xué)組織的圖形模型。圖13是由重組seHAS合成真正的HA的證明。圖14描述用特定的寡核苷酸和PCR對編碼seHAS、編碼spHAS或編碼seHAS和spHAS兩者的核酸序列的識別。圖15描述用于特定PCR雜交的寡核苷酸。圖16A是通過比較枯草芽孢桿菌168(單獨的pSM143載體)的HA合成與枯草芽孢桿菌168(含有seHAS的pSM143載體)的HA合成而描述活枯草芽孢桿菌中重組HA生產(chǎn)的圖。圖16B是圖16A中的部分的放大。圖17A是描述對活枯草芽孢桿菌中由spHAS生產(chǎn)的重組M大小分布的營養(yǎng)性控制的圖。圖17B是描述與單獨含有載體的枯草芽孢桿菌相比的活枯草芽孢桿菌168中重組HA生產(chǎn)的圖。圖18A和圖18B是重組大腸桿菌的顯微照片。在圖18A中，墨汁染色(1，000X放大倍率)揭示具有pPraHAS的大腸桿菌K5細(xì)胞生產(chǎn)堅固的莢膜，該莢膜顯示為圍繞細(xì)胞的白色光環(huán)。在圖18B中，莢膜材料可通過用鏈霉菌屬(Str印tomyces)的HA裂解酶的簡單處理而從大腸桿菌K5(pPmHAS)細(xì)胞中去除。PmHAS指導(dǎo)了HA多糖的多聚化。圖19是革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中GAG生物合成的示意模型。圖20是證明來自乳房鏈球菌的HAS基因PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠。圖21描述來自釀膿鏈球菌、類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的HA合成酶活性。發(fā)明詳述在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明的應(yīng)用不限于在下面的描述中提出的或在附圖中闡明的成分的構(gòu)建和組織的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠用于其他實施方案或能夠以各種途徑實踐或?qū)崿F(xiàn)。同樣地，應(yīng)理解的是在此處應(yīng)用的措詞和術(shù)語是為了描述的目的，而不應(yīng)該認(rèn)為是限制性的。如在此處所用的，術(shù)語"核酸區(qū)段"和"DM區(qū)段"是互換使用的，且指已分離的不含特定物種的總基因組DM的DM分子。因此，如在此處所使用的"純化的"DM或核酸區(qū)段指含有透明質(zhì)酸合成酶("HAS")編碼序列的DNA區(qū)段，然而該編碼序列是從源細(xì)胞的無關(guān)基因組DNA分離的或是純化的不含后者的形式。包括于術(shù)語"DNA區(qū)段"中的是DNA區(qū)段和這種區(qū)段的較小片段以及重組載體，該載體包括如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。相似地，包含分離的或純化的HAS基因的DM區(qū)段指包括HAS編碼序列的DNA區(qū)段，該區(qū)段基本從其他天然存在的基因或蛋白質(zhì)編碼序列中分離。在這方面，為簡單起見將術(shù)語"基因"用于指功能蛋白質(zhì)、多肽或肽編碼單位。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的，該功能術(shù)語包括基因組序列、cDNA序列或其組合。"基本從其他編碼序列分離的"指目標(biāo)基因(在34本情況下為HAS)形成了DNA區(qū)段的編碼區(qū)的重要部分，且該DNA區(qū)段不含有大的部分的天然存在的編碼DNA，如大的染色體片段或其他功能基因或DNA編碼區(qū)。當(dāng)然，這指的是最初分離的DM區(qū)段，但不排除后面加入的或由人們手工在區(qū)段中有意留下的基因或編碼區(qū)。由于某些與原核來源的應(yīng)用相關(guān)的優(yōu)點，人們很可能認(rèn)識到從原核生物分離HAS基因的許多優(yōu)點。特別地,人們可選擇利用I類或II類HAS，如來自類馬鏈球菌或釀膿鏈球菌的I類HAS或來自多殺巴斯德氏桿菌的II類HAS。鏈球菌基于不同的細(xì)胞壁糖類抗原而在分類學(xué)上細(xì)分為蘭斯非爾德類群。有18個不同的類群，但最普遍的病原體是A、:B、C和D。以歷史的眼光看，最普遍的病原體也經(jīng)常有特定的物種名字，但統(tǒng)一的蘭斯非爾德檢驗方法被認(rèn)為是確定類型的明確方法并因而是有用的分類方案?？捎米鱄AS基因的來源的鏈球菌物種包括A組鏈球菌，如釀膿鏈球菌和溶血鏈球菌(S.haemolyticus),以及C組鏈球菌，如馬鏈球菌(s.equi)、類馬鏈球菌、獸瘟鏈球菌(S.zoo印ideraicus)、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)。從原核生物中分離HAS基因的-個這樣的優(yōu)點是真核的酶一般可能需要重要的翻譯后修飾，該修飾僅可在真核宿主中實現(xiàn)。這將傾向于限制獲得的任何真核HA合成酶基因的應(yīng)用性。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很可能認(rèn)識到在應(yīng)用原核的酶基因時,在時間和基因操作的容易性方面的額外的優(yōu)點。這些額外的優(yōu)點包括(a)原核基因由于相對小的基因組大小，以及在篩選相應(yīng)的基因組文庫時減少的量，因此較容易分離；和(b)操作的容易性，這是因為由于不含有內(nèi)含子，原核基因的編碼區(qū)的總大小是顯著較小的。此外，如果HAS基因的產(chǎn)物(即酶)需要翻譯后修飾，那么這將最好在該基因所源自的相似的原核細(xì)胞環(huán)境(宿主)中實現(xiàn)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的DNA序列將進(jìn)一步包括基因控制區(qū)，該控制區(qū)使得該序列能夠在選擇的重組宿主中表達(dá)。當(dāng)然，應(yīng)用的控制區(qū)的特性一般依賴于想要的特殊用途(如克隆宿主)而變化。在特別的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和插入了編碼HAS基因的DNA序列的重組載體，該基因在其氨基酸序列中包括根據(jù)SEQIDNO:2、10、12、14、16、18禾口20中至少一個的氨基酸序列。此外，在其他特別的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和插入了編碼基因的DM序列的重組載體,該基因在其氨基酸序列中包括MS基因或DNA的氨基酸序列，且特別地包括相應(yīng)于類馬鏈球菌HAS、釀膿鏈球菌HAS、乳房鏈球菌H:AS、多殺巴斯德氏桿菌HAS、硫磺礦硫化葉菌HAS、Ectocarpussiliculosus病毒HAS和炭疽芽孢桿菌質(zhì)粒pX01HAS的HAS基因或cDNA。例如，當(dāng)DNA區(qū)段或載體編碼全長的HAS蛋白質(zhì)時，或想要用于表達(dá)HAS蛋白質(zhì)時，優(yōu)選的序列是那些基本在SEQIDNO:2、10、12、14、16、18和20中至少一個中提出的。具有HA合成酶活性的核酸區(qū)段可通過在此處描述的方法分離。術(shù)語"基本在SEQIDNO:X中提出的序列"指基本相應(yīng)于SEQIDNO:X的部分的序列，并且該序列與SEQIDNO:X的氨基酸序列相比只有相對少數(shù)的氨基酸不同或該序列是SEQIDNO:X的生物學(xué)功能等價物。術(shù)語"生物學(xué)功能等價物"是本領(lǐng)域中眾所周知的，并進(jìn)一步在此處詳細(xì)定義為具有基本在SEQIDNO:X中提出的序列并且與原核生物生產(chǎn)HA或透明質(zhì)酸被膜的能力相關(guān)的基因。例如，seIIAS和spHAS編碼序列為約70%相同的且富含堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)。SeHAS的堿基含量為A-26.71%、C-19.13%、G-20.81%和T-33.33%(A/T=60%)，而spHAS為A-31.34%、C-16.42%、G_16.34X禾PT-35.8%(A/T=67%)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員驚訝的是seIIAS編碼序列不與spHAS基因雜交，反之亦然，盡管它們是70%相同的。該意想不到的不能相互雜交可歸因于在可讀框中錯配堿基造成的短中斷。SpHAS不能與seHAS相互雜交顯示于圖1中。SeHAS和spHAS編碼序列共同的相同核苷酸的最長一段僅20個核苷酸。此外，高度富含A-T的序列將形成比富含G-C的序列不穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。另一個可能的解釋是在兩個序列中均有幾個As或Ts區(qū)段，該區(qū)段可以以錯誤排列和不穩(wěn)定的方式雜交。這將使得se:HAS和sp:HAS基因序列相互不在可讀框內(nèi)配對，因而降低了有效雜交的概率。由于70%相同的兩個編碼蛋白質(zhì)的基因不能夠相互雜交的獨特現(xiàn)象，有益的是依照其功能考慮所述的核酸區(qū)段；即編碼酶活性透明質(zhì)酸合成酶的核酸區(qū)段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解編碼酶活性透明質(zhì)酸合成酶的核酸區(qū)段可含有對在SEQIDNO:1、2和9-20中提出的序列的保守的或半保守的替代，且仍然在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。特別地，本領(lǐng)域充滿從業(yè)者對核酸區(qū)段做結(jié)構(gòu)改變(即編碼保守的或半保守的氨基酸替代)并仍然保持其酶或功能活性的例子。例如參見(l)Risler等人"結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)中的氨基酸替代。模式識別方法。"J.Mol.Bio:l..204:1019-1029(1988)["...根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的觀察到的可交換性，僅可描繪4組;(i)lie和Val;(ii)Leu和Met;(iii)Lys、Arg和Gin及(iv)Tyr和Phe。"];(2)Niefind等人"蛋白質(zhì)模型的氨基酸相似系數(shù)和源自主鏈折疊Anoles的序列比對"J.Mol.Biol.219:481-497(1991)[相似性參數(shù)使得能夠設(shè)計氨基酸替代];和(3)()verington等人"環(huán)境特異性氨基酸替代表蛋白質(zhì)折疊的三級模板和預(yù)測"ProteinScience1:216-226(1992)["觀察到的替代作為局部環(huán)境的函數(shù)的分析顯示有不同的模式..."可做相容的改變。]，每一個的內(nèi)容都清楚地在此處整體引用作為參考。這些參考文獻(xiàn)和無數(shù)其他的文獻(xiàn)顯示在給出核酸序列時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對該核酸序列進(jìn)行替代和改變而不改變其功能性。同樣地，替代的核酸區(qū)段可與其未改變的親代高度相同，且保持其未改變的親代的酶活性,并仍然不能進(jìn)行雜交。本發(fā)明公開了編碼酶活性透明質(zhì)酸合成酶如seHAS、spHAS、suHAS和pmHAS的核酸區(qū)段。盡管seHAS與spHAS70%相同且均編碼酶活性透明質(zhì)酸合成酶,但它們不相互雜交。因而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解可對在SEQIDN():l中列出的seHAS核酸區(qū)段進(jìn)行替代而不背離本發(fā)明的范圍和項目。標(biāo)準(zhǔn)化的和可接受的功能等價氨基酸替代顯示于表I中。表I氨基酸組保守的和半保守的替代非極性R組丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸極性但不帶電荷的R組甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是可進(jìn)一步限定為重組載體的純化的核酸區(qū)段,該區(qū)段編碼根據(jù)SEQIDNos:2、10、12、14、16、18或20的蛋白質(zhì)。如在此處所用的，術(shù)語"重組載體"指已進(jìn)行修飾以含有編碼HAS蛋白質(zhì)或其片段的核酸區(qū)段的載體。該重組載體可進(jìn)一步限定為包含啟動子的表達(dá)載體，該啟動子可操作地連接到該編碼HAS的核酸區(qū)段上。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案是一個宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞用包含:HAS基因的重組載體制備為重組體。該優(yōu)選的重組宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞。在另一個實施方案中，該重組宿主細(xì)胞可為真核細(xì)胞。如在此處所用的，術(shù)語"基因工程處理的"或"重組"細(xì)胞是要指向其中引入了重組基因如編碼MS的基因的細(xì)胞。因此,基因工程處理的細(xì)胞與不含有重組引入的基因的天然存在的細(xì)胞可區(qū)別。因而,基因工程處理的細(xì)胞是具有人工引入的基因的細(xì)胞。重組引入的基因?qū)閏DNA基因的形式,基因組基因的拷貝，或者包括位于啟動子附近的基因，該啟動子天然地與引入的特定基因無關(guān)。當(dāng)人們想要用除鏈球菌之外的宿主生產(chǎn)重組M合成酶時，有利的是應(yīng)用原核系統(tǒng)如大腸桿菌、芽孢桿菌菌株、乳球菌屬(Lactococcussp.)，或者甚至用真核系統(tǒng)如酵母或中國倉鼠卵巢細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、VERO細(xì)胞等。當(dāng)然，在著手該工作時，通常需要的是使HA合成酶基因處于選擇的替代宿主中有功能的序列的控制之F。該適當(dāng)?shù)腄NA控制序列以及其構(gòu)建和使用通常是本領(lǐng)域中眾所周知的，如在下文中更加詳細(xì)討論的。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞可為芽孢桿菌細(xì)胞，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細(xì)胞,且在其中引入的載體含有與has基因可操作地連接的芽孢桿菌相容性啟動子。在更優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是芽孢桿菌細(xì)胞，如嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、角牟淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculars)、Bacillusclausii、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslaut.us)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽船千菌、Bacillusmetaterium、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、卩耆熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽包桿菌禾口蘇云金芽包桿菌(Bacillusthuringienisis)。在優(yōu)選的實施方案中，編碼HA合成酶的DNA區(qū)段進(jìn)一步包括本領(lǐng)域中公知的功能為復(fù)制或"復(fù)制子"起點的DNA序列，該序列使得能夠由特定的宿主進(jìn)行連續(xù)的序列的復(fù)制。這種起點使得能夠制備染色體外定位的且復(fù)制的嵌合體區(qū)段或質(zhì)粒，在其中連接了M合成酶DNA序列。在更優(yōu)選的的例子中，應(yīng)用的起點是能夠在適合于生物技術(shù)應(yīng)用的細(xì)菌宿主中復(fù)制的。然而,對于更加多功能的克隆DNA區(qū)段，想要的是可選擇地甚至額外地應(yīng)用由其他想要應(yīng)用的宿主系統(tǒng)識別的起點(如在穿梭載體中)。其他復(fù)制起點如SV40、多形瘤或牛乳頭狀瘤病毒起點的分離和應(yīng)用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，其中所述病毒可應(yīng)用于許多高等生物的克隆或表達(dá)。在某些實施方案中，本發(fā)明因而可按照重組轉(zhuǎn)化載體而限定，該載體包括編碼HA合成酶的基因序列和適當(dāng)?shù)膹?fù)制起點，并在選擇的控制區(qū)的控制之下。因而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解的是按照本發(fā)明的公開內(nèi)容,可使用其他的方式獲得HAS基因或c:[)NA。例如，可獲得聚合酶鏈反應(yīng)或:RT-PCR生產(chǎn)的I)NA片段，該片段含有來自許多來源的基因或cDNA的全長互補(bǔ)物，該來源包括鏈球菌的其他菌株，或者來自真核來源如cDNA文庫。事實上可將任何分子克隆方法用于生成根據(jù)本發(fā)明的DNA片段。因而，通常對用于DM分離的特定方法的唯一限制是分離的核酸應(yīng)該編碼生物學(xué)功能性等價物HA合成酶?！┮逊蛛xDNA，則將其與選擇的載體連接在一起。事實上可應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的任何克隆載體以實現(xiàn)該優(yōu)點。一般有用的載體包括用于原核生物的質(zhì)粒和噬菌體，及甚至用于真核生物的病毒載體。例子包括pKK223-3、pSA3、重組的A、SV40、多形瘤、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒。然而，人們相信當(dāng)應(yīng)用能夠在乳球菌屬或芽孢桿菌菌株和大腸桿菌兩者中復(fù)制的載體時，最終可實現(xiàn)特別的優(yōu)點。如這些由Dao和Ferretti的pSA3載體或Trieu-Cuot等人的pAT19載體所示例的載體使得人們能夠在容易操作的宿主如大腸桿菌中進(jìn)行克隆群體選擇,并隨后轉(zhuǎn)移入食品等級的乳球菌屬或芽孢桿菌菌株中以生產(chǎn)M。這些是用于生產(chǎn)某些食品和生物技術(shù)產(chǎn)品的良性和充分研究的生物。這些在下面情況中是有利的，即人們可通過基因劑量作用(即通過擴(kuò)增而提供額外拷貝的HA合成酶基因)和/或包括額外的基因來增加乳球菌屬或芽孢桿菌菌株合成M的能力，從而增加M前體的可用性。細(xì)菌合成M的固有能力也可通過形成額外的攜帶HA合成酶基因的質(zhì)粒拷貝或擴(kuò)增該質(zhì)粒而增加。該擴(kuò)增可導(dǎo)致質(zhì)?？截悢?shù)目及因此的HA合成酶基因拷貝數(shù)目中10-倍的增加?？蛇M(jìn)一步增加HA合成酶基因拷貝數(shù)目的另一個程序是向質(zhì)粒中插入多拷貝的基因。另一種技術(shù)可包括將MS基因整合入染色體DNA中。該額外的擴(kuò)增尤其可行，這是因為細(xì)菌:HA合成酶基因是小的。在一些計劃中，將染色體DNA-連接的載體通過使用能夠在選擇的宿主中表達(dá)插入的DNA的載體來應(yīng)用于轉(zhuǎn)染宿主，該宿主是為篩選的目的而選擇的，如大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，HA合成酶基因是通過同源或異源重組而引入到宿主細(xì)胞染色體中的。has基因在這種構(gòu)型中更加穩(wěn)定，尤其是當(dāng)無藥物選擇時。多種載體可用于將has基因引入到芽孢桿菌中，如pTLH或pKSV7，或者引入到酵母中，如YIp211，或者引入到動物細(xì)胞中，如pcDNA/FRT。首先將DNA通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或電穿孔引入到宿主細(xì)胞中。然后將具有has基因的DNA區(qū)段穩(wěn)定地整合入宿主染色體中。例如，spII4S基因用于通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合修復(fù)鏈球菌染色體的突變；該操作結(jié)果導(dǎo)致:HA的生產(chǎn)(I)eAngelis等人，1993)。當(dāng)應(yīng)用真核來源如皮或滑膜成纖維細(xì)胞或公雞雞冠細(xì)胞時，人們想要首先通過制備cDNA文庫而進(jìn)行。這是首先通過從上述細(xì)胞中分離mRNA而實施的，隨后用具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶制備雙鏈cDNA并與選擇的載體連接。在本領(lǐng)域中對于雙鏈cDNA的制備許多可能性都是可用且公知的，且所有這種技術(shù)都認(rèn)為是可采用的。優(yōu)選的技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄。一旦獲得了雙鏈cDNA群體，則在選擇的宿主中通過可接受的技術(shù)制備cDNA文庫，如通過連接入適當(dāng)?shù)妮d體中并在適當(dāng)?shù)乃拗髦袛U(kuò)增。由于所獲得的極大數(shù)目的克隆及通過在此處提出的技術(shù)篩選極大數(shù)目克隆的容易性，人們可想要應(yīng)用噬菌體表達(dá)載體以克隆和表達(dá)篩選cDNA克隆，如入gtll、入gt.12、XGemll禾卩/或AZAP。在某些其他的實施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和重組載體，它們在其序列中包括基本在SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17和19的至少一個中提出的核酸序列。例如，術(shù)語"基本在SEQI:DNO:1中提出的"是以與上述的相同的意義使用的，意思是核酸序列基本相應(yīng)于SEQIDNO:1的部分，且具有相對少的與SEQIDNO:1的密碼子不同或不是功能等價物的密碼子。術(shù)語"功能等價物密碼子"在此處用于指編碼相同氨基酸的密碼子如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，且也可指編碼在表I中提出的生物學(xué)等價的氨基酸的密碼子。也可理解氨基酸和核酸序列可包括額外的殘基，如額外的N-或C-末端氨基酸或額外的5'或3'核酸序列，且仍然是基本如在此處公開的序列之一中提出的，只要該序列滿足上文提出的標(biāo)準(zhǔn),該標(biāo)準(zhǔn)包括當(dāng)涉及蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性時維持生物學(xué)的蛋白質(zhì)活性。末端序列的添加特別地應(yīng)用于核酸序列，該序列包括如在側(cè)面與編碼區(qū)的5'或3'部分相接的多種非編碼序列，或可包括已知在基因中存在的多種內(nèi)部序列。特別地，真核生物中has基因產(chǎn)物的氨基酸序列比在原核生物中發(fā)現(xiàn)的大大約40%。慮及遺傳密碼的簡并性以及保守和半保守的替代，與SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19的核苷酸具有約40%約80%的一致性的；或者更優(yōu)選地為約80%約90%的一致性的；或者更加優(yōu)選地為約90%約99%的--致性的。序列為"基本如在SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19中提出的"序列；基本與那些在SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19中提出的序列相同的序列也可功能性地定義為能夠在標(biāo)準(zhǔn)或較低嚴(yán)格性雜交條件下與含有SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19的互補(bǔ)物的核酸區(qū)段雜交的序列。適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并在此處明確地提出。如在此處所用的術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"用于描述這樣的條件，即在該條件下基本互補(bǔ)的核酸區(qū)段將形成標(biāo)準(zhǔn)的沃森-克里克堿基對。已知有許多因子決定結(jié)合或雜交的特異性，如pH:、溫度、鹽濃度、如甲酰胺和二甲基亞砜等試劑的存在、雜交的區(qū)段的長度等。當(dāng)預(yù)期將較短的核酸區(qū)段用于雜交時,例如約14和約IOO個核苷酸之間的片段，雜交的鹽和溫度優(yōu)選的條件將包括40-5(TC時1.2-1.8X的高磷酸鹽緩沖液(HPB)。自然地，本發(fā)明也包含與在SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19中提出的序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的DNA區(qū)段。"互補(bǔ)"的核酸序列是那些能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的沃森-克里克互補(bǔ)原則進(jìn)行堿基配對的。如在此處所用的，術(shù)語"互補(bǔ)序列"指基本互補(bǔ)的核酸序列，如可由在上文中提出的相同的核苷酸比較進(jìn)行估計的，或定義為能夠與SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17或19的核酸區(qū)段進(jìn)行雜交的。不管其本身編碼序列的長度怎樣，本發(fā)明的核酸區(qū)段可與其他I)NA序列組合，如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外的限制性酶切位點、多克隆位點、抗原決定部位標(biāo)記、多組氨酸區(qū)域、其他編碼區(qū)段等，從而其總長度可有相當(dāng)大的變化。因此預(yù)期可應(yīng)用幾乎任何長度的核酸片段，其總長度優(yōu)選地受到在想要的重組DM規(guī)程中制備和使用的容易性的限制。自然地，也應(yīng)理解本發(fā)明不局限于分別為SEQIDNOS:1、9、11、13、15、17和19和SEQIDNOS:2、10、12、14、16、18和20的特定的核酸和氨基酸序列。因此重組的載體和分離的DNA區(qū)段可不同地包括HAS編碼區(qū)本身、在基本編碼區(qū)中具有選擇的替代或修飾的編碼區(qū)，或者它們可編碼較大的多肽，然而該多肽包括MS-編碼區(qū)，或可編碼具有氨基酸序39列變體的生物學(xué)功能性等價物蛋白質(zhì)或肽。長期以來猜測CarterA型多殺巴斯德氏桿菌的被膜含有透明質(zhì)酸(HA)。多殺巴斯德氏桿菌的透明質(zhì)酸的表征導(dǎo)致它和seMS和spHAS蛋白質(zhì)之間的有趣的酶學(xué)差異。多殺巴斯德氏桿菌細(xì)胞產(chǎn)生易于看到的細(xì)胞外HA被膜,且由于兩種鏈球菌:HAS是膜蛋白質(zhì)，所以檢驗了雞霍亂病原體的膜制備物。在早期的試驗中，當(dāng)在與那些測量鏈球菌HAS活性的條件相似的條件下測定時，源自單獨超聲處理的粗制膜組分具有非常低水平的UDP-GlcNAc-依賴性UDP-[14C]GlcUA向HA的整合[0.2pmo1的GlcllA轉(zhuǎn)移(Ug蛋白質(zhì))—"h—。。來自具有重組hasA質(zhì)粒的大腸桿菌的酶也首先是抗分離的。這些結(jié)果與用相似的方法從鏈球菌獲得的易于探測的量相反。在蛋白酶抑制劑存在時用冰冷的裂解酶處理的可選擇的制備規(guī)程與超聲處理一起使得能夠從兩種革蘭氏陰性細(xì)菌的物種中基本恢復(fù)MS活性。特定的HAS活性，即轉(zhuǎn)移的5-1()pmolG:lcUA(ug蛋白質(zhì))—、—、通常能從野生型多殺巴斯德氏桿菌的粗制膜中用新方法獲得。在UDP-GlcNAc不存在時，在較高分子量的材料中幾乎未整合來自UDP-["C]GlcUA的放射性(是用同一方法對兩種糖前體進(jìn)行測定結(jié)果的不到1%)。從無被膜的突變體TnA制備的膜當(dāng)補(bǔ)充了兩種糖前體時不具有可探測的MS活性(數(shù)據(jù)未顯示)。用聚丙烯酰胺葡聚糖S-20()柱的凝膠過濾分析顯示，自材料在孔隙體積(Voidvolume)洗脫開始，在體外合成的14C_標(biāo)記的產(chǎn)物的大多數(shù)的分子量》8X104Da，該值相應(yīng)于由至少400個單體組成的HA分子。該產(chǎn)物對鏈霉菌透明質(zhì)酸酶消化敏感但抗蛋白酶處理。對HAS測定的參數(shù)進(jìn)行改變以由多殺巴斯德氏桿菌的膜使UDP-糖向多糖的整合最大化。鏈球菌sp:HAS需要Mg2+，因此該金屬離子包括在多殺巴斯德氏桿菌的膜的最初測定中。多殺巴斯德氏桿菌HAS(pmHAS)在Tris-類型的緩沖液中從pH6.58.6為相對活性的，最適值為pH7。HAS活性在中性pH下至少lh期間內(nèi)相對于溫育時間是線性的。pmHAS在較高離子強(qiáng)度時是明顯低活性的，這是因為向含有pH7的50mMTris和20mMMgCl2的反應(yīng)體系中加入l()()慮的NaCl減少了5()%的糖整合。在pH7時測定了pmHAS的金屬離子特異性。在存在EDTA的無金屬條件下，沒有探測到放射性標(biāo)記的前體向多糖的整合(<5%的最大信號)。在試驗的金屬離子(Mg、Mn、Co、Cu和Ni)中Mn2'離子在最低濃度時具有最大的整合率。Mg2'給出Mn2+刺激的50%，但是在10-倍高的濃度上。l()raM的Co2+或Ni2+支持較低水平的活性(分別為ImMMn2+測定的20%或9%)，但提供了10mMCu2+的膜是無活性的。事實上，使10mMCu2+和20mMMg2+與膜制劑混合幾乎不導(dǎo)致標(biāo)記向多糖中的整合(<8%的單用Mg的值)。pmHAS的最初表征是在Mg2'存在時進(jìn)行的。酶對其糖核苷酸前體的結(jié)合親和力是通過測量表現(xiàn)KM值而測定的。^C]GlcUA或[3H]GlcNAC向多糖的整合是分別在不同的UDP-GlcNAc或UDP-GlcUA濃度進(jìn)行監(jiān)控。在含Mg2+的緩沖液中，UDP-GlcUA的20uM的表觀KM值和UDP-GlcNAc的75uM的表現(xiàn)KM值是用滴定數(shù)據(jù)的Hanes-Woolf圖([S]/v對[S])來確定的。兩種糖的Vmax值是相同的，這是因為相應(yīng)于1/VMX的Ilanes-Woolf圖的斜率是相同的。與用Mg"測定的結(jié)果相比較，在M^+存在時UDP-G:lcNAc的^值增加了約25-50%到105uM，且V隨增加了2-3-倍。來自多殺巴斯德氏桿菌、類馬鏈球菌或釀膿鏈球菌的HA合成酶利用UDP-糖，但它們在pH和金屬離子依賴性和KM值方面具有一些不同的動力學(xué)最適值。該酶在pH7時是最大活性的；然而，據(jù)報道pmHAS在微酸性pH時具有更大的活性且在大于pH7.4時相對無活性。在體外測定條件下pmHAS利用Mn2+比利用Mg2+更有效，但細(xì)菌細(xì)胞中生理學(xué)金屬輔因子的特性是未知的。作為比較,在前文用鏈球菌酶的研究中Mg"大大好于Mrf'，雖然在比最適的Mg"濃度低10-倍的濃度時Mn"作用是最大的。pm:HAS結(jié)合UDP-糖明顯地比印HAS更緊密。對于每一種底物,在粗制膜中測量的pmHAS的KM值比那些從發(fā)現(xiàn)于鏈球菌膜中的HAS獲得的低約2-3-倍liDP-GlcUA分別為50或39uM，UDP-GlcNAc分別為500或150iiM。通過動力學(xué)分析，pm:HAS的VMX在Mn2+存在時比在Mg2+存在時高2-3-倍，但在用前--種離子的測定中UDP-GlcNAc的Km値稍微増加了。該明顯降低的親和力提示增加的多聚化速率不是歸因于Mr^離子/糖核苷酸復(fù)合物與酶活性位點的更好的結(jié)合的。因此，可能的是Mn2—增強(qiáng)了一些其他的反應(yīng)步驟，改變了酶的另一個位點./結(jié)構(gòu)，或修飾了磷脂膜環(huán)境。praHAS的基因序列和蛋白質(zhì)序列分別顯示于SEQII)N():9和10中。小球藻病毒(Chlorellavirus)PBCV-1編碼可合成透明質(zhì)素的有功能的糖基轉(zhuǎn)移酶。該發(fā)現(xiàn)與通常對病毒的以下觀察相反，即(a)病毒利用宿主細(xì)胞的糖基轉(zhuǎn)移酶來生成新的糖結(jié)構(gòu)或者(b)在病毒體成熟過程中積聚宿主細(xì)胞的糖綴合物。此外，通常認(rèn)為M僅限于動物和少數(shù)其毒性細(xì)菌病原體中。盡管已對許多植物糖類進(jìn)行了表征,但在植物或原生生物細(xì)胞中以前未發(fā)現(xiàn)HA或相關(guān)的類似物。脊椎動物、細(xì)菌和病毒HAS酶具有幾個序列相似區(qū)。在對病毒PBCV-1[緣草履蟲小球藻病毒]的基因組雙鏈DNA進(jìn)行測序時，發(fā)現(xiàn)了一個ORF[可讀框]即A98R(訪問號#442580)，該ORF編碼與多種HAS具有2833%的氨基酸一致性的567個殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)命名為cvHAS(小球藻病毒HA合成酶)。編碼PBCV-1的基因序列和其編碼的蛋白質(zhì)序列分別顯示于SEQIDNO:7和8中。PBCV-1是大的(直徑為175-190nrn)多角體噬斑形成性病毒科(藻DM病毒科)的原型，該科病毒在某些單細(xì)胞的真核小球藻樣綠藻中復(fù)制。PBCV-1病毒體含有至少50個不同的蛋白質(zhì)和位于外層糖蛋白被膜內(nèi)側(cè)的脂質(zhì)成分。PBCV-1基因組是具有共價閉合發(fā)夾末端的線性且無序列改變的330-kb長的dsDNA分子?；谄渫茢嗟陌被嵝蛄校珹98R基因產(chǎn)物應(yīng)為整合膜蛋白質(zhì)。為了檢驗該假說，在大腸桿菌中生產(chǎn)了重組A98:R，并對膜組分進(jìn)行了HAS活性的測定。UI)P-GlcUA和UDP-G:l.cNAc是通過源自在質(zhì)粒pCVHAS上含有A98R基因的細(xì)胞的膜組分而整合到多糖中的(平均的特異性活性為2.5pmolesGlcUA轉(zhuǎn)移/ug蛋白質(zhì)/分鐘)，而不是通過來自對照細(xì)胞的樣品的(<0.OOlpmolesGlcUA轉(zhuǎn)移/Ug蛋白質(zhì)./分鐘)。在用pCVHAS轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的可溶性組分中未探測到活性。UD:P-GlcUA和UDP-GlcNAc對于多聚化是同時需要的。其活性在10mMMnCl2存在時的pH7.2的H印es緩沖液中是最適的，而在不含該金屬離子時探測不到活性。在相似的濃度Mg2+和Co2+的有效性僅為Mn2+的20%。pmHAS具有相似的金屬需求，但其他HAS偏好Mg2—。重組A98R酶合成了平均分子量為3-6Xl()6I)a的多糖，該多糖比由重組spHAS或DG42x1HAS在體外合成的HA小(分別為107Da和5-8X106Da)。該多糖被St.r印t.omyceshyal訓(xùn)niticusHA裂解酶完全降解，該酶能使HA解聚，但不使結(jié)構(gòu)....匕相關(guān)的糖胺聚糖如肝素和軟骨素解聚。對PBCV-1感染的小球藻細(xì)胞進(jìn)行了A98R基因表達(dá)的檢查。在感染后15分鐘出現(xiàn)了1，700個核苷酸的A98R轉(zhuǎn)錄物，且該轉(zhuǎn)錄物在感染60分鐘之后消失，從而顯示A98R是早期基因。隨后，對來自未感染的和PBCV-1感染的小球藻細(xì)胞的膜組分在感染后50和9()分鐘進(jìn)行了H:AS活性的測定。感染的細(xì)胞而^M未感染的細(xì)胞具有活性。與細(xì)菌來源的重組A98R酶一樣，放射性標(biāo)記從UDP-[14C]GlcUA向多糖的整合依賴于Mn2+和UDP-GlcNAcfil:。該放射性標(biāo)記的產(chǎn)物也被HA裂解酶降解。破壞的PBCV-1病毒體不具有HAS活性。對PBCV-1感染的小球藻細(xì)胞用高度特異性的1251-標(biāo)記的HA-結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行了HA多糖的分析。來自感染后50和90分鐘時細(xì)胞的提取物含有大量的HA，但來自未感染的藻類或破壞的PBCV-1病毒體丕含有HA。標(biāo)記的HA-結(jié)合蛋白質(zhì)也與感染后50和90分鐘的完整感染細(xì)胞進(jìn)行相互作用，但不與健康細(xì)胞相互作用。因此，新合成的HA多糖的相當(dāng)大部分是固定于感染的藻類的細(xì)胞外表面的。細(xì)胞外M在病毒與其藻類宿主之間的相互作用中不起明顯的作用，這是因為通過在PBCV-1噬斑測定的頂層瓊脂中包括睪丸透明質(zhì)酸酶(465單位/ml)或自由HA多糖(100yg/ml),噬斑的大小和噬斑的數(shù)目均未改變。PBCV-1基因組也具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-GlcDH)和谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)的額外基因。UDP-GlcDIi將UDP-Glc轉(zhuǎn)變?yōu)閁DP-GlcUA,即HA生物合成的必需前體。GFAT將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸前?6-磷酸，即UDP-GlcNAc代謝途徑中的中間物。與A98RHAS--樣，這兩個PBCV-1基因在感染早期表達(dá)并編碼酶活性蛋白質(zhì)。多個酶在HA生物合成途徑中的存在顯示HA生產(chǎn)一定在小球藻病毒的生活史中發(fā)揮重要的功能。鏈球菌、脊椎動物和PBCV-1的HA合成酶具有許多基元，該基元為以相同的相對順序存在至少24個相同的殘基的模式。這些保守的基元可能反映如在圖2中所示的HA生物合成中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域。圖2是分別來自類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的C組seHAS和suHAS;來自釀膿鏈球菌的A組spHAS;小鼠同工酶mHASl、mMS2和mlIAS3;人同工酶hliASl、h:HAS2和hH:AS3;蛙同工酶x:I.HASl和xl:HAS2;最初的PBCV-1病毒H:AS、cvHAS以及新病毒HASsvNC、vMA、vAL禾PvCA;大鼠rnHAS2;雞ggHAS2;牛btHAS2和兔同工酶ocHAS2和ocHAS3的蛋白質(zhì)序列的比對。圖2的比對是用Mutalin5.4.1版的多重比對程序?qū)崿F(xiàn)的(版權(quán)I.N.R.A.法國1989、1991、1994、1996;用等級聚類(hierarchicalclustering)的多重序列比對，Corpet，Nucl.Acids:Res.，16:10881(1988))。在比對的較下面的線上提供了一致線(consensusline)。-一致線中的大寫字母代表所列的所有HAS蛋白質(zhì)中相同的殘基，而小寫字母代表那些在所有情況下均不相同的一致殘基。一致線也含有下面的符號！是I、V的任何一個；$是L、M的任何一個；％是F、Y的任何一個；#是N、D、Q、E、B、Z的任何一個。符號比較表為blosuni62，缺口權(quán)重為12，且缺口長度權(quán)重為2。當(dāng)對更多的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行測序時，也發(fā)現(xiàn)了HAS和其他從UDP-糖前體合成P-連接的多糖的酶之間相似性的區(qū)域。例子包括細(xì)菌纖維素合成酶、真菌和細(xì)菌幾丁質(zhì)合成酶和各種MS。當(dāng)糖基轉(zhuǎn)移酶的三維結(jié)構(gòu)信息積聚時，這些相似的結(jié)構(gòu)基元的重要性將變得明顯。圖3描述已知的透明質(zhì)素合成酶之間的可能的進(jìn)化關(guān)系。圖3的系統(tǒng)樹是用DNAsis多重比對程序通過Higgins-Sharp算法生成的。計算的匹配百分?jǐn)?shù)顯示于系統(tǒng)樹的每一個分支上。42本發(fā)明的DNA區(qū)段包含生物學(xué)功能性等價物HAS蛋白質(zhì)和肽。這種序列可作為已知天然發(fā)生于核酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)中的密碼子豐余性和功能性等價性的結(jié)果而出現(xiàn)?？蛇x擇地,功能性等價物蛋白質(zhì)或肽可通過應(yīng)用重組DM技術(shù)而生成，其中基于對交換的氨基酸的特性的考慮可進(jìn)行對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。人工設(shè)計的改變可通過應(yīng)用定點誘變技術(shù)而引入，如改進(jìn)酶活性或HAS蛋白質(zhì)的抗原性，或者檢驗HAS突變體以在分子水平檢查HA合成酶活性。同樣地，HAS編碼區(qū)中的特定改變可導(dǎo)致具有修飾的大小分布或結(jié)構(gòu)構(gòu)型的HA的生產(chǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解可以以生產(chǎn)改變的透明質(zhì)酸合成酶的方式對HAS編碼區(qū)進(jìn)行處理，這反過來能夠生產(chǎn)具有不同多聚體大小和/或功能能力的透明質(zhì)酸。例如，可以以透明質(zhì)酸合成酶具有改變的糖底物特異性的方式對HAS編碼區(qū)進(jìn)行改變，從而透明質(zhì)酸合成酶生成新的透明質(zhì)酸樣的多聚體，該多聚體整合了不同的結(jié)構(gòu)如以前未整合的糖或糖衍生物。該新整合的糖將產(chǎn)生具有不同功能特性的透明質(zhì)酸、具有較小或較大多聚體大小/分子量的透明質(zhì)酸或兩者。在給定HAS編碼序列的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解可對HAS編碼序列進(jìn)行改變和/或替代，從而可實現(xiàn)這些想要的特性和/或大小的修飾。表II列出了重組seMS的糖核苷酸特異性和鎂離子需求。表11:重組seHAS的糖核苷酸特異性和鎂離子需求<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>*膜(324ng蛋白質(zhì))與120uMUDP-[24C]GlcUA(2.8X1()4dpni)或300uMUDP-[3H]GlcNAc(2X10Mpm)在37。C溫育1小時。在顯示的第二個非標(biāo)記的糖核苷酸存在時使用放射性標(biāo)記的糖核苷酸。HA合成酶活性是如在申請中描述的進(jìn)行確定的。如在此處所用的術(shù)語"修飾的結(jié)構(gòu)"表示含有通常不發(fā)現(xiàn)于天然存在的HA多糖中的糖或衍生物的透明質(zhì)酸多聚體。術(shù)語"修飾的大小分布"指大小分布通常不發(fā)現(xiàn)于天然酶中的透明質(zhì)酸分子的合成；所設(shè)計的大小比正常的小或大。不同大小的各種透明質(zhì)酸產(chǎn)物已應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如藥物送遞中。如果約4約20個單糖的透明質(zhì)酸多聚體可以以好的量制備，那么在血管發(fā)生和傷口愈合中的應(yīng)用將有很大潛力。小的透明質(zhì)酸寡糖的另一個特別的應(yīng)用是用于醫(yī)學(xué)目的的重組人蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化。這種蛋白質(zhì)的主要問題是其從血液中的清除和短的生物學(xué)半衰期。對該問題的一個現(xiàn)有的解決方法是偶聯(lián)一個小分子的屏蔽，該屏蔽防止該蛋白質(zhì)太快地從血液循環(huán)中清除。非常小分子量的透明質(zhì)酸非常適用于該角色且為非免疫原性的和生物相容性的。附著到藥物或蛋白質(zhì)上的較大分子量的透明質(zhì)酸可用于導(dǎo)向具有透明質(zhì)酸的內(nèi)吞受體的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)。在該公開內(nèi)容的啟示下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解有幾個途徑可對由透明質(zhì)酸合成酶制備的透明質(zhì)酸多聚體的大小分布進(jìn)行調(diào)節(jié)以得到不同的大小。首先，產(chǎn)物大小的動力學(xué)控制可通過降低溫度、降低酶反應(yīng)時間及降低一種或兩種糖核苷酸底物的濃度而進(jìn)行改變。降低這些變量的任何一項或全部將得到透明質(zhì)酸產(chǎn)物的較小的量和較小的大小。這些方法的缺點是產(chǎn)物的產(chǎn)量也將降低，且可能難以實現(xiàn)天與天或批與批之間的可重復(fù)性。其次，HA多聚體的大小分布可通過改變酶合成大的透明質(zhì)酸產(chǎn)物的內(nèi)在能力而調(diào)節(jié)。對蛋白質(zhì)的改變可通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行處理，如特定氨基酸的替代、缺失和添加(或者甚至通過代謝處理引入輔基)。然后這種產(chǎn)生內(nèi)在較慢的酶的改變使得能夠通過動力學(xué)方式對透明質(zhì)酸的大小進(jìn)行更多的可重復(fù)性控制。最終的透明質(zhì)酸大小分布是通過酶的某些特征決定的，該特征依賴于序列中的特定的氨基酸。在鏈球菌酶和真核透明質(zhì)酸合成酶之間絕對保守的殘基的20%中，在特定的位置有一套氨基酸控制或巨大地影響酶可制備的透明質(zhì)酸多聚體的大小。這些殘基的任何一個的特定的改變都可產(chǎn)生修飾的MS，該HAS產(chǎn)生具有修飾的大小分布的HA產(chǎn)物。在透明質(zhì)酸釋放之前對降低酶可制備的透明質(zhì)酸的內(nèi)在大小的seHAS、spHAS、suHAS、pmHAS或cvHAS進(jìn)行的改變將提供生產(chǎn)透明質(zhì)酸產(chǎn)物的有力方式，該透明質(zhì)酸產(chǎn)物的大小比天然的酶的小或潛在的大。最后，大分子量的透明質(zhì)酸可用特定的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行降解以制備低分子量的透明質(zhì)酸。然而，該實踐非常難以實現(xiàn)可重復(fù)性，且人們必須小心翼翼地再次純化透明質(zhì)酸以去除透明質(zhì)酸酶和不想要的消化產(chǎn)物。如在圖4中所示的，可對透明質(zhì)素合成酶進(jìn)行處理以同正常的野生型酶相比生產(chǎn)不同大小的透明質(zhì)酸多聚體，特別是較小的。該圖顯示一系列spMS酶的M大小的分布(分子量測量為百萬道爾頓)，對每一種酶均用定點誘變進(jìn)行了處理以使其與天然的酶具有單--的氨基酸改變。每一種均用丙氨酸替代了不同的半胱氨酸殘基。具有空心符號的5個曲線的聚合代表下面的spHAS蛋白質(zhì)野生型、C124A、C261A、C366A和C402A。實心的圈代表僅為部分活性的很少表達(dá)的C225A蛋白質(zhì)。實心三角形代表C280AspHAS蛋白質(zhì)，人們發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)可合成比正常的酶或所示的其他變體范圍小許多的HA多聚體。這種實踐顯示對透明質(zhì)酸合成酶進(jìn)行處理以合成想要的HA產(chǎn)物大小的范圍是可行的。在此處公開的編碼透明質(zhì)酸合成酶的HAS基因的任何一種也可通過定點誘變進(jìn)行處理以生產(chǎn)合成想要的M產(chǎn)物大小范圍的酶。結(jié)構(gòu)上修飾的透明質(zhì)酸在概念上與通過在想要的HAS或spHAS中改變特定的氨基酸而改變透明質(zhì)酸產(chǎn)物的大小分布是沒有區(qū)別的。預(yù)期UDP-GlcNAc的衍生物是特別有用的，在其中N-乙?；鶊F(tuán)是缺失的UDP-GlcN或是用另一個化學(xué)上有用的基團(tuán)進(jìn)行替代的。強(qiáng)的底物特異性必須依賴于保守的20%的氨基酸中的特定氨基酸亞組。對一個或多個這種殘44基的特定的改變生成了有功能的合成酶，該合成酶可比天然的酶以較低的特異性與--種或多種底物進(jìn)行相互作用。然后該改變的酶將利用可選擇的天然或特定的糖核苷酸以整合糖衍生物，該糖衍生物設(shè)計為使得不同的化學(xué)性質(zhì)能夠用于下面的目的(i)為了普通或定向的藥物遞送、放射學(xué)程序等,使結(jié)構(gòu)上修飾的透明質(zhì)酸與特定的藥物、蛋白質(zhì)或毒素共價偶聯(lián)；(ii)使透明質(zhì)酸自身或與其他支持體進(jìn)行共價偶聯(lián)以形成凝膠或其他具有更強(qiáng)的物理特性的三維生物材料，及(iii)使透明質(zhì)酸與一種表面進(jìn)行偶聯(lián)以形成生物相容性的膜或單分子層。也可對細(xì)菌進(jìn)行基因工程處理以生產(chǎn)透明質(zhì)酸。例如，我們生成了含有HAS基因以及糖核苷酸前體之--的基因的枯草芽孢桿菌菌株。我們之所以選擇該菌株是因為它經(jīng)常用于生產(chǎn)人用產(chǎn)物的生物技術(shù)工業(yè)中。這些細(xì)菌想要作為能夠以比現(xiàn)在用野生型天然菌株可獲得的更大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸的細(xì)菌世代的第一個世代原型。例如，構(gòu)建了3個枯草芽孢桿菌菌株以含有透明質(zhì)素合成酶(spH:AS)和UDP-葡萄糖脫氫酶(hasB)的釀膿鏈球菌基因之-或兩者，其結(jié)果顯示于表III中?；趯A進(jìn)行探測和定量的敏感的商業(yè)放射分析測定，可確定具有兩個基因的菌株(#3菌株)生產(chǎn)HA并將其分泌到培養(yǎng)基中。親代菌株或僅有脫氫酶基因的菌株(#1菌株)不生產(chǎn)1仏。僅含有spH:AS基因的#2菌株生產(chǎn)H:A，但僅為#3菌株所生產(chǎn)的約10%。瓊脂糖凝膠電泳顯示由#3菌株分泌到培養(yǎng)基中的HA具有非常高的分子量。表III數(shù)據(jù)表明枯草芽孢桿菌168可以通過重組DNA技術(shù)引入spHAS基因和hasB基因，從而經(jīng)過基因工程處理而生產(chǎn)和分泌M。盡管在不引入hasB基因的情況下，該修飾的菌株也能生產(chǎn)HA，但是有了hasB之后，H:A的水平會大大提高?？莶菅挎邨U菌168含有兩個基因(tauD和gt.aB)，它們能夠提高HA合成所需的兩種糖核苷酸的水平。表IV證明當(dāng)對其進(jìn)行處理以含有并(在質(zhì)粒pSM143中，ATCC)表達(dá)seHAS以及特定seHAS變體(該變體是進(jìn)行處理以生產(chǎn)與野生型相比大小不同的M的)時,枯草芽孢桿菌168也制備M，即使在hasB基因不存在時。特別地，變體seHAS(C226A)和seHAS(C281A)支持活枯草芽孢桿菌168細(xì)胞中的HA合成。這些后--種情況中的HA合成水平比用表達(dá)鄰HAS和hasB基因觀察到的低，這歸因于HA合成所需的兩種前體的較低的內(nèi)源水平。用從枯草芽孢桿菌168細(xì)胞分離的膜的體外試驗證明由這些修飾的HAS酶制備的HA的大小分布分別比由野生型seHAS制備的大和小，其中所述枯草芽孢桿菌168細(xì)胞用含有hasB和seHAS(C226A)或seHAS(C281A)變體的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化了。在枯草芽孢桿菌中從野生型seHAS生產(chǎn)的HA的大約大小是1.5MDa。在地衣芽孢桿菌和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)中也己證明了重組HA從spH:AS基因的生產(chǎn)。圖6是對HA染色的瓊脂糖凝膠的數(shù)字圖象。在具有編碼spHAS(pPD41△5)的質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和糞腸球菌菌株中可看到HA生產(chǎn)。作為負(fù)對照，將含有無功能的hasA基因(pPD41AEcoRV)的質(zhì)粒引入到每一個菌株中，且這些菌株均不能生產(chǎn)HA。表i]:]:含有spHAS和hasB基因的枯草芽孢桿菌168中HA的生產(chǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>(*)大多數(shù)HA在培養(yǎng)基中但一些是細(xì)胞結(jié)合的；HA是用購自Pharmacia的HATest.50試劑盒進(jìn)行確定的。表IV枯草芽孢桿菌168中生產(chǎn)的透明質(zhì)素(HA)重組菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>[oeo"使100ml培養(yǎng)物生長過夜；培養(yǎng)基通過購自Corgenix(透明質(zhì)酸"Chugai")的HA檢驗試劑盒進(jìn)行分析。這些實驗利用通常與這些基因相連的鏈球菌啟動子以驅(qū)動蛋白質(zhì)表達(dá)。人們預(yù)期用在革蘭氏陽性的或芽孢桿菌相容的啟動子控制下的spHAS或seHAS讀框構(gòu)建菌株將產(chǎn)生更好的結(jié)果。所用的載體是革蘭氏陽性/大腸桿菌穿梭載體，該載體在枯草芽孢桿菌中具有中等的拷貝數(shù)和紅霉素抗性基因(使得在枯草芽孢桿菌中能夠?qū)?iig/ml產(chǎn)生抗性，在大腸桿菌中能夠?qū)?75ug/ml產(chǎn)生抗性)。所用的枯草芽孢桿菌宿主菌株是來自BGSC的1A1且可形成孢子，該菌株具有色氨酸需求但在其他方面是野生型的。細(xì)胞生長和HA生產(chǎn)是在SpizizensMinimalMedia加色氨酸、葡萄糖、痕量元素和紅霉素(8ug/ml)中進(jìn)行的。在32。C時的劇烈攪拌中進(jìn)行生長直到培養(yǎng)基耗盡(36個小時)。表III和IV證明這些進(jìn)行了生物工程加工的細(xì)胞當(dāng)用spHAS或seHAS基因轉(zhuǎn)化時能夠生產(chǎn)透明質(zhì)酸，它們正常時是不能生產(chǎn)的。在此處描述的HAS基因的任何--個也能夠引入到非透明質(zhì)酸生產(chǎn)性細(xì)菌中以生成能夠生產(chǎn)透明質(zhì)酸的生物工程加工的菌株。當(dāng)轉(zhuǎn)向在此處所描述的來自基因組DM或cDNA的HAS基因之一的表達(dá)時，人們可制備用于重組制備HAS蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。用于在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)的DNA區(qū)段的處理可通過重組表達(dá)領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常知道的技術(shù)來實現(xiàn)。HAS可成功表達(dá)于真核表達(dá)系統(tǒng)中，然而本發(fā)明者主張細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可用于所有46目的的HAS制備。人們相信細(xì)菌表達(dá)最終將在應(yīng)用的容易性、生產(chǎn)成本和因而獲得的材料的數(shù)量方面比真核表達(dá)更有利。鏈球菌透明質(zhì)素合成酶(seMS)的純化顯示于表V和圖7中。來自純化方案的各個階段的級分是通過在12.5X的凝膠上的SDS-PAGE進(jìn)行分析的，然后將其用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。泳道分子量標(biāo)記；l,含有重組seHAS-H6的大腸桿菌全細(xì)胞膜；2,在用去污劑對膜進(jìn)行增溶后的不溶性級分；3，去污劑增溶的級分；4，從Ni-NTA層析樹脂中流過的；5-9,5次連續(xù)的對柱的洗滌(每次以兩倍柱的體積)；10，單一條帶的洗脫的純HA合成酶。spH:AS的純化與seHAS所顯示的相同(T:[apak-Simmons,1999)。表V<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>人們認(rèn)為用編碼HAS的DNA區(qū)段對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將提供獲得HAS蛋白質(zhì)的方便方法。人們同樣認(rèn)為cDNA、基因組序列及其組合適合于真核表達(dá)，這是因為宿主細(xì)胞當(dāng)然將對基因組轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行加工以產(chǎn)生有功能的mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。本發(fā)明的另一個實施方案是制備蛋白質(zhì)組合物的方法，該方法包含使包含編碼蛋白質(zhì)的載體的重組宿主細(xì)胞生長，該蛋白質(zhì)包括根據(jù)SEQIDN()S:2、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列或具有保守的或半保守的氨基酸變化的功能相似物。宿主細(xì)胞將在允許核酸表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的條件下生長，隨后對這樣生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收。HAS和最終HA(包括宿主細(xì)胞)的生產(chǎn)，允許核酸表達(dá)、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和回收的條件按照本公開內(nèi)容和在此處描述的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的。表達(dá)透明質(zhì)酸的優(yōu)選的宿主是原核生物，如類馬鏈球菌和其他鏈球菌物種的適當(dāng)成員。然而，也已知HA可用表達(dá)重組HA合成酶的異源宿主細(xì)胞來合成，如芽孢桿菌、腸球菌屬(Enterococcus)或甚至埃希氏菌屬(Escherichia)的物種成員。本發(fā)明表達(dá)HA合成酶最優(yōu)選的宿主是用本發(fā)明的:HAS基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，如乳球菌屬(Lactococcus)物種、枯草芽孢桿菌或大腸桿菌。用于本發(fā)明的HA表達(dá)方法的最優(yōu)選的宿主包括芽孢桿菌物種，這是因為這種細(xì)胞是有效的工業(yè)分泌者，且?guī)讉€物種已命名為GMS生物?？捎糜诒景l(fā)明的方法的芽孢桿菌細(xì)胞的例子包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌(Baci1lusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillusclausii、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、Bacillusmetaterium、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。最優(yōu)選的宿主是枯草芽孢桿菌。相似地，人們相信幾乎任何真核表達(dá)系統(tǒng)均可用于表達(dá):HAS，如可應(yīng)用基于桿狀病毒(baculovirus)的、基于谷氨酰胺合成酶的、基于二氫葉酸還原酶的系統(tǒng)、基于SV-40的、基于腺病毒的、基于巨細(xì)胞病毒的、基于酵母的等。對于這種方式的表達(dá)，人們可以使編碼序列靠近或在啟動子的控制之下。在本領(lǐng)域中可以理解的是為了使編碼序列在這種啟動子的控制之下，人們使蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄讀框的轉(zhuǎn)錄起始位點的5'末端位于選擇的啟動子"下游"(即3')的約1個和約5()個核苷酸之間。同樣地，釀酒酵母(Saccharoraycescerevisiae)表達(dá)載體系統(tǒng)如pYES2也可在如顯示于圖8中的GAL啟動子的控制之下生產(chǎn)HAS。圖8顯示spHAS或xlHAS酶是用pYES2質(zhì)粒在重組酵母中表達(dá)的。當(dāng)提供了UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc時，每一種酶都制備高分子量的HA,如在這些凝膠過濾層析曲線中觀察到的(M峰值在約13ml約25ral)。圖8表示用表達(dá)于酵母膜上的重組HAS合成的透明質(zhì)酸的凝膠過濾分析。用標(biāo)準(zhǔn)方法將DNA片段亞克隆入pYES2酵母表達(dá)載體(購自Invitrogen)中以產(chǎn)生pYES/HA，所述DNA片段編碼(a)相應(yīng)于spHAS的419個氨基酸殘基的可讀框(最初的Val密碼子變?yōu)镸et)或(b)xl:HAS蛋白質(zhì)。來自具有該構(gòu)建體的細(xì)胞的膜是通過用玻璃珠攪拌而制備的。源自pYESZHA構(gòu)建體的樣品含有大量的HA合成酶活性，且"42kDa"的HAS蛋白質(zhì)是通過用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行探測的；來自僅具有載體的細(xì)胞的膜既不具有活性也不具有免疫反應(yīng)性條帶(未顯示)。使膜(315lig蛋白質(zhì))首先與無載體的UDP-[14C]GlcUA(luCi14C)和900yM未標(biāo)記的UDP-GlcNAc在5()mMpH7的Tris、2()mMMgC:l.2、lraMDTT和0.05MNaCl(450u1反應(yīng)體積)中于30攝氏度溫育1.5分鐘。在該脈沖標(biāo)記之后，然后將非放射性標(biāo)記的UDP-GlcUA添加至終濃度為900uM。樣品(100uL)是在脈沖后于"追蹤(chase)"后的1.5分鐘(深色圓圈)和15分鐘(黑色方形)和45分鐘(黑色三角形)獲取的。該反應(yīng)是通過添加SI)S至2X并于95攝氏度加熱1分鐘而終止的。在將半數(shù)樣品注射入在0.2MNaCl、5mMpH8的Tris中平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S-500服凝膠過濾柱(Pharmacia;IX50cm)中之前用離心(10，000Xg，5分鐘)使樣品澄清。該柱于0.5ml/分鐘的速度洗脫，且級分(lml)中的放射活性是通過在加入了BioSafeIIcocktai:[(4.5ral，ResearchProductsI:nt:[.)之后用液體閃爍計數(shù)法進(jìn)行定量的?？紫扼w積和總包含體積(totallyincludedvolume)分別在14ml和35.5ml的洗脫體積。藍(lán)色葡聚糖的峰值(平均為2X106Da)在25-27ml處洗脫。在真核酵母細(xì)胞中表達(dá)的重組MS在體外生成高分子量的透明質(zhì)酸。當(dāng)預(yù)期真核表達(dá)時，人們一般也想要將適當(dāng)?shù)木巯佘账峄稽c(如5'-AATAAA-3')插入到包括HAS基因或DNA的轉(zhuǎn)錄單位中，如果在最初的克隆區(qū)段中不含有該聚腺苷酸化位點的話。一般地，使聚腺苷酸化添加位點置于蛋白質(zhì)終止位點R游約302000個核苷酸的位置，并處于轉(zhuǎn)錄終止子之前。人們預(yù)期事實上任何常用的真核宿主細(xì)胞可用于根據(jù)此處的HAS表達(dá)。用于表達(dá)本發(fā)明的HAScDNA的優(yōu)選的細(xì)胞系的例子包括-般用于真核表達(dá)的細(xì)胞系，如293、AtT-20、H印G2、VERO、HeLa、CHO、WI38、B服、C0S-7、RIN和MDCK細(xì)胞系。這一般包括提供具有編碼MS酶的重組DNA區(qū)段且能夠表達(dá)該酶的重組宿主的步驟；將重組宿主在下面條件下培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，該條件使得克隆的HAS基因或d)NA能夠轉(zhuǎn)錄且適合于透明質(zhì)酸的生產(chǎn)；及分離和純化HAS酶或從重組宿主中分泌的透明質(zhì)酸。通常，適合于克隆的HAS基因或cDNA表達(dá)的條件將依賴于所應(yīng)用的啟動子、載體和宿主系統(tǒng)。例如，當(dāng)人們應(yīng)用lac啟動子時，人們可以通過引入可刺激lac轉(zhuǎn)錄的材料如異丙基硫代半乳糖苷而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。例如，克隆的seHAS和spHAS基因是為了如在圖5中所示的純化HAS的目的而在大腸桿菌中表達(dá)為含有HIS6的蛋白質(zhì)的。當(dāng)應(yīng)用其他啟動子時，可需要不同的材料以誘導(dǎo)或增量調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。圖5描述大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達(dá)。膜蛋白質(zhì)(每泳道5ug)是用10%(w/v)的凝膠在還原性條件下通過SDS-PAGE進(jìn)行分級分離的。該凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色、照相、掃描并用moleculardynamicspersonaldensitometer(PDSIP60型號)進(jìn)行定量。M合成酶的位置用箭頭標(biāo)記。泳道A是天然的spMS(A組)；泳道C是天然的seHAS;泳道E是重組seHAS;泳道P是重組spHAS;泳道V是單獨的載體。所用的標(biāo)準(zhǔn)是Bio-rad的低Mr并以kDa顯示。除獲得合成酶表達(dá)之外，人們優(yōu)選地想要提供有利于HA合成的環(huán)境，這是通過引入編碼糖核苷酸前體生物合成所需的酶的適當(dāng)基因，或者通過使用含有前體提供酶(precursor-supplyingenzyme)的底物的生長培養(yǎng)基而實現(xiàn)的，該底物如N-乙酰葡糖胺或葡糖胺(GlcNAc或Glc順2)和葡萄糖(Glc)。人們將進(jìn)一歩想要在透明質(zhì)酸酶缺陷的宿主中整合基因，從而由酶合成的產(chǎn)物將不在培養(yǎng)基中降解。此外,可選擇宿主使M的生產(chǎn)最適化。例如，適當(dāng)?shù)乃拗魇巧a(chǎn)大量糖核苷酸前體以支持HAS酶并使得該酶能夠生產(chǎn)大量的HA的。這種宿主可天然地存在，或者可由各種技術(shù)包括誘變或重組DNA技術(shù)來制備。糖核苷酸合成酶的基因，特別是生產(chǎn)UDP-GlcUA所必需的UDP-Glc脫氫酶也可連同HAS基因或cDNA分離并整合到載體中。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是含有這些輔助的重組基因或cDNA的宿主，因而使得能夠有糖核苷酸及因此的HA的增加的生產(chǎn)。人們相信用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法不是特別關(guān)鍵的。為了有用的細(xì)節(jié),人們可以參考美國專利Nos.4，517，295;4，801，539;4，784，990或4，780，414的公開內(nèi)容，它們均在此處明確地整體引用作為參考。當(dāng)應(yīng)用原核宿主如類馬鏈球菌時，人們可能想要在厭氧的條件下在富含C(、的液體生長培養(yǎng)基中使細(xì)菌發(fā)酵。這使得能夠有比在好氧情況下更大的HA生產(chǎn)。另--個考慮是厭氧生長的鏈球菌細(xì)胞不生產(chǎn)致熱性外毒素。適當(dāng)?shù)纳L條件可依照本公開內(nèi)容對其他的原核宿主進(jìn)行設(shè)定，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。一旦已構(gòu)建了合適的宿主并在適合于HA生產(chǎn)的條件下進(jìn)行培養(yǎng),那么人們將想要分離這樣生產(chǎn)的H:A。一般地，M將被分離或由重組生物釋放到周圍的培養(yǎng)基中，從而使得能夠易于用公知的技術(shù)從培養(yǎng)基中分離HA。例如，HA可至少通過過濾、離心和絮凝作用之一而從細(xì)胞和殘渣中分離，且三氯乙酸的添加可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞和殘渣與透明質(zhì)酸的分離。然后M可通過沉淀、超濾和透析的至少一種而從培養(yǎng)基中分離。沉淀劑包括醇如乙醇和異丙醇、有機(jī)溶劑或化合物如丙酮或有機(jī)(脂族的帶正電荷的)季銨鹽如鯨蠟基氯化吡啶鎗(CPC)或鯨蠟基溴化三銨(CTB)。用于分離HA的優(yōu)選的技術(shù)描述于美國專利No.4，517，295中，該專利在此處引入作為參考,在其中于發(fā)酵末期將有機(jī)羧酸即三氯乙酸添加到細(xì)菌懸浮液中。三氯乙酸導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞凝塊并死亡，并促進(jìn)這季銨鹽些細(xì)胞和關(guān)聯(lián)的殘渣與想要的產(chǎn)物HA分離的容易性。將澄清的上清液濃縮并透析以去除包括有機(jī)酸的低分子量的污染物。前述的程序利用通過過濾盒的過濾程序，如那些含有0.22um孔大小的濾器。繼續(xù)滲濾直到溶液的導(dǎo)電性降低到約0.5百萬歐姆。濃縮的HA是通過添加過量的試劑級的乙醇或其他有機(jī)溶劑而沉淀的，且沉淀的HA然后通過用乙醇洗滌和真空千燥進(jìn)行千燥、凍千以去除乙醇。然后HA可再溶解于pH8的硼酸鹽緩沖液中，并用CPC或某些其他的有機(jī)銨鹽如一種混合的三甲基溴化銨溶液CETAB于4攝氏度進(jìn)行沉淀。沉淀的HA是通過粗過濾進(jìn)行回收的，并重懸于1MNaCl中，如進(jìn)一步在上文中參考的專利中描述的進(jìn)行滲濾和濃縮。結(jié)果所得的HA是過濾除菌的，并依賴于想要的最終用途易于轉(zhuǎn)變?yōu)檫m當(dāng)?shù)柠}、千粉或無菌的溶液。A.可采用的一般的基因工程方法如果將無強(qiáng)大的細(xì)胞膜屏障的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，那么轉(zhuǎn)化可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的磷酸鈣沉淀方法實現(xiàn)。然而,其他方法也可用于將DNA引入細(xì)胞中，如通過核注射、陽離子脂質(zhì)、電穿孔、原生質(zhì)體融合或通過由DuPont開發(fā)的BIOLISTIC生物顆粒送遞系統(tǒng)(1989)。使用DuPont系統(tǒng)的優(yōu)點是高的轉(zhuǎn)化效率。如果使用原核細(xì)胞或含有大量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，那么優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是用氯化鈣誘導(dǎo)感受態(tài)的鈣處理或電穿孔。含有想要的克隆和控制序列的適當(dāng)?shù)妮d體的構(gòu)建應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)。將分離的質(zhì)?；駾NA片段進(jìn)行切割、剪切并以想要構(gòu)建想要的質(zhì)粒的形式進(jìn)行再連接。切割是在適當(dāng)?shù)木彌_液中通過用限制性內(nèi)切酶處理來實現(xiàn)的。通常，在約20y1緩沖液中約1yg的質(zhì)?；駾NA片段使用約1單位的酶。用于特定的限制性內(nèi)切酶的合適緩沖液和底物數(shù)量由生產(chǎn)商詳細(xì)說明。于37"C約1小時的溫育時間是可用的。在溫育之后，蛋白質(zhì)通過用酚和氯仿提取而去除，且核酸是通過乙醇沉淀從水相級分中回收的。如果需要平末端，那么將制劑于15。C用10單位的聚合酶I(Klenow)處理15分鐘、進(jìn)行酚-氯仿提取并用乙醇沉淀。為了連接，約等摩爾量的想要成分(進(jìn)行了剪切以提供正確配對)用每0.5ugDNA約10單位的T4DNA連接酶進(jìn)行處理。當(dāng)將切割的載體用作成分時，有用的是通過用細(xì)菌堿性磷酸酶預(yù)處理以防止切割的載體的再連接。對于在構(gòu)建的質(zhì)粒中證實功能序列的分析，第一個步驟是通過于30-32。C進(jìn)行轉(zhuǎn)化以克隆入特定的感受態(tài)大腸桿菌SURE細(xì)胞(Stratagene)中而擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。其次，將重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K5菌株Bi8337-41，該菌株可生產(chǎn)UDP-GlcUA前體，且成功的轉(zhuǎn)化體是通過適當(dāng)?shù)目股乜剐赃M(jìn)行選擇的。然后對來自轉(zhuǎn)化體文庫的質(zhì)粒進(jìn)行篩選以獲得展示HA生產(chǎn)的細(xì)菌菌落。將這些菌落挑取、擴(kuò)增，且將質(zhì)粒用限制酶切作圖進(jìn)行純化和分析。然后將顯示功能性HAS基因跡象的質(zhì)粒進(jìn)一步通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的許多序列分析技術(shù)進(jìn)行表征。B.來源和宿主細(xì)胞培養(yǎng)物和載體通常，將原核生物用于DNA序列的起始克隆和本發(fā)明中有用的載體的構(gòu)建。人們相信適當(dāng)?shù)膩碓礊楦锾m氏陽性細(xì)胞,特別是那些源自C組鏈球菌菌株的。具有單一的膜但具有厚細(xì)胞壁的細(xì)菌如葡萄球菌(Staphylococci)和鏈球菌(Streptococci)是革蘭氏陽性的。革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌含有兩層不連續(xù)的膜，而不是一層圍繞細(xì)胞的膜。革蘭氏陰性生物傾向于具有較薄的細(xì)胞壁。革蘭氏陽性生物的單一的膜與革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)膜類似。通常，將含有源自與宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制起點和控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主一起使用。該載體通常帶有復(fù)制起點，以及能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如,大腸桿菌一般用源自一個大腸桿菌物種的質(zhì)粒PBR322進(jìn)行轉(zhuǎn)化。pBR322含50有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，從而提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡單方法。pBR質(zhì)粒或pUC質(zhì)粒或其他微生物質(zhì)?；蚴删w也必須含有或經(jīng)修飾后含有可由微生物用于表達(dá)其蛋白質(zhì)的啟動子。這種啟動子可為異源的啟動子，即來自其他生物的啟動子，只要該啟動子與宿主細(xì)胞相容，即該啟動子可被宿主細(xì)胞的:RM聚合酶識別，從而RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄宿主相容性啟動子附著的基因。這些最經(jīng)常用于重組DNA構(gòu)建體的啟動子包括lacZ啟動子、tac啟動子、T7噬菌體啟動子和色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)。盡管這些是最經(jīng)常使用的，也已發(fā)現(xiàn)并使用了其他的微生物啟動子，且已發(fā)表了關(guān)于其核苷酸序列的細(xì)節(jié)，從而使得技術(shù)人員能夠?qū)⑺鼈児δ苄缘嘏c質(zhì)粒載體進(jìn)行連接。此外，該啟動子可為具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。對啟動子的修飾可為突變或串聯(lián)加入兩個或多個啟動子元件。當(dāng)以串聯(lián)方式提供兩個或多個啟動子元件時，該兩個或多個啟動子元件可為相同的啟動子元件或兩個或多個不同的啟動子元件。如在此處所用的術(shù)語"串聯(lián)啟動子元件"可理解為指兩個或多個啟動子序列，其中每-個該序列都可操作地連接到編碼序列上，從而該啟動子序列通過介導(dǎo)編碼序列向mRNA的轉(zhuǎn)錄而指導(dǎo)由編碼序列編碼的多肽的生產(chǎn)。串聯(lián)啟動子以及構(gòu)建體及其在芽孢桿菌細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用詳細(xì)描述于美國專利Nos.5，955，310和6，255，076中,i亥專利分別于1999年9月21日和2001年7月3日授予Widner等人，在此處明確地將其內(nèi)容整體引入作為參考。此外，當(dāng)本發(fā)明的重組載體含有超過一個核酸區(qū)段時，其中每一個區(qū)段都具有編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，如具有編碼酶活性透明質(zhì)素合成酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段和具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區(qū)的核酸區(qū)段，則每一個核酸區(qū)段均可操作地連接到啟動子上。兩個或多個核酸區(qū)段可連接到相同的啟動子上，且該單一的啟動子可驅(qū)動兩個基因的表達(dá)，或者兩個或多個核酸區(qū)段可連接到不同的啟動子--匕。除原核生物之外，也可使用真核微生物如酵母培養(yǎng)物。釀酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最普遍使用的，盡管通常許多其他的菌株也是可用的。對于在糖酵母(Saccharomyces)中的表達(dá)，例如質(zhì)粒YRp7是普遍使用的。該質(zhì)粒已含有trpl基因，該基因提供對無色氨酸時缺乏生長能力的酵母突變菌株的選擇標(biāo)記，例如ATCCNo.44076或PEP4-1。然后作為酵母宿主細(xì)胞基因組的特征的trpl損害的存在提供了通過在無色氨酸存在時生長而探測轉(zhuǎn)化體的有效環(huán)境。酵母載體中適當(dāng)?shù)膯有蛄邪ò肴樘抢没颉?_磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖_6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。在構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒中，與這些基因相關(guān)的終止序列也連接到表達(dá)載體中想要表達(dá)的序列的3'以提供mRNA的聚腺苷酸化和終止。其他具有由生長條件控制的轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的啟動子是乙醇脫氫酶2、細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解性酶類和前文所述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶類的啟動子區(qū)域。含有酵母相容性啟動子、復(fù)制起點和終止序列的任何質(zhì)粒載體均為適當(dāng)?shù)?。除微生物之外，源自多?xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上，任何這樣的細(xì)胞培養(yǎng)物均為可用的，不論其來自脊椎動物還是無脊椎動物培養(yǎng)物。然而，對脊椎動物具有最大的興趣，且脊椎動物細(xì)胞在培養(yǎng)物中的繁殖在最近幾年中已成為常規(guī)程序。這種有用的細(xì)胞系的例子為VER0和HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞系和WI38、BHK、COS和MDCK細(xì)胞系。對于在哺乳動物中的應(yīng)用，對表達(dá)載體的控制功能通常是由病毒材料提供的。例如，常用的啟動子是源自多形瘤、腺病毒2、牛乳頭狀病毒和使用頻率最大的猿猴病毒40(SV40)的。SV40病毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，這是因為兩者均易于作為也含有SV40病毒復(fù)制起點的片段而從病毒獲得。也可使用較小的或較大的SV40片段，前提是其包括了從HindIII位點延伸到位于病毒復(fù)制起點的Bgll位點的約250bp長的序列。進(jìn)一步地，也可能且經(jīng)常想要的是利用通常與想要的基因序列相關(guān)的啟動子或控制序列，只要這種控制序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。復(fù)制起點可通過構(gòu)建包括外源起點(如源自SV40或其他病毒(如多形瘤、腺病毒(Adeno)、BPV)來源的)的載體來提供，或者通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制來提供。如果載體是整合入宿主細(xì)胞染色體中的,那么后一種機(jī)制經(jīng)常是足夠的。C.真實的HA合成酶從C組類馬鏈球菌的高度被囊化的菌株中的分離。命名為seHAS的編碼的蛋白質(zhì)具有417個氨基酸(計算的分子量為47，778且PI為9.1)，且是迄今鑒定的MS家族的最小的成員(圖2)。seHAS在SDS-PAGE中也遷移得異?？?Mr42kDa)(圖5和9)。圖9是用特異性抗體對重組seHAS的蛋白質(zhì)印跡分析的圖示。含有重組seHAS(E;泳道2、7和9)或spHAS(P;泳道3、6、8和10)的C組(C;泳道1)或A組(A;泳道4)鏈球菌膜和大腸桿菌膜(9yg/泳道)是通過還原性SDS-PAGE而進(jìn)行分級分離及轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜條是如在申請中描述的那樣用純化的I:gG組分進(jìn)行探測和顯影的，該IgG組分是針對下面的spHAS區(qū)的中央結(jié)構(gòu)域肽E"M^(泳道卜4);C-末端肽(泳道5-6);完整的蛋白質(zhì)(泳道7和8);重組中央結(jié)構(gòu)域(泳道9和10)。來自單獨用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的非免疫性IgG或膜不著色，如在泳道5中所示。seHAS和spHAS蛋白質(zhì)編碼序列(分別為SEQIDNOS:1和13)是72%相同的。推斷的seHAS的蛋白質(zhì)序列是通過與合成的肽抗體的反應(yīng)性來證實的(圖9)。在大腸桿菌中表達(dá)的重組seHAS是作為主要蛋白質(zhì)在膜中回收的(圖5)，并在UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA存在時在體外合成了非常大分子量的M(圖10)。圖10表示對由seHAS和spHAS生產(chǎn)的HA大小分布的動力學(xué)分析。含有等量seHAS或spHAS蛋白質(zhì)的大腸桿菌膜如在申請中描述的與1.35mMUDP_[14C]GlcUA(l.3X103dpmZ廳l)和3.OmMUDP-GlcNAc于37。C進(jìn)行溫育。這些底物濃度大于15倍的各自Km值。對在0.5、1.0和60分鐘獲取的樣品用SDS進(jìn)行處理并在聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR上進(jìn)行層析。將柱子的分級分離范圍內(nèi)的HA(組分12-24)曲線標(biāo)準(zhǔn)化為每一組分中總:HA的百分?jǐn)?shù)。在頂部圖中箭頭上面的值是用Da冊多角激光散射儀器(Wyat.tTechnologyCorp.)在分離實驗中直接確定的HA的麗(百萬)。由seHAS(鐮、國、A)和spHAS(O、□、△)在0.5分鐘(0、鑤)、1.0分鐘(□、■)和60分鐘(△、▲)合成的HA的大小分布如圖所示。分析顯示seHAS和spHAS在它們合成的HA鏈的大小分布中是基本相同的(圖10)。在制備HA的能力上seHAS是spHAS的兩倍快。C.1細(xì)菌菌株和載體粘液樣C組菌株D181(類馬鏈球菌)是從RockefellerUniversityCollection獲得的。大腸桿菌宿主菌株Sure和XL卜BlueMRF，購自Strat.agene，且ToplOF'購自Invitrogen。除非另外注明，鏈球菌生長于THY中，且大腸桿菌菌株生長于LB培養(yǎng)基中。pKK-223表達(dá)載體購自Pharmacia,PCR2.1克隆載體購自Invitrogen,且預(yù)消化的入ZapExpressionTMBamH]:/CIAP載體購自Stratagene。C.2重組DNA和克隆將用Caparon和Scott方法(如本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的)從類馬鏈球菌分離的高分子量基因組DNA用Sau3Al進(jìn)行部分消化為平均大小為2-12kb。消化的DNA用乙醇進(jìn)行沉淀、洗滌并連接到BaraHI/CIAPAZAPExpression載體上。將連接的DM用購自Promega的PackageneTM提取物包裝入噬菌體中。包裝的噬菌體文庫的滴度是用XL1-BlueMRF'大腸桿菌作為宿主進(jìn)行檢査的。C.3簡并PCR擴(kuò)增簡并寡核苷酸是基于spHAS(釀膿鏈球菌)、DG42(非洲爪蟾HAS;19)和nodC(苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)結(jié)瘤因子；20)中的保守序列設(shè)計的，并用于用D181基因組DNA作為模板的pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為于94°C1分鐘、44。C1分鐘、72t:1.5分鐘進(jìn)行34個循環(huán)，隨后于72"C最后延伸10分鐘。寡核苷酸HADRF15'-GAYmgaYRTYTXACXAATTAYGCTAT:HGAYTT:RGG-3，(SEQIDNO:45)(有義鏈)相應(yīng)于序列D259RCLTNYA:I:DL(SEQIDNO:46)(spHAS)。寡核苷酸HACTR15'-ACGWGTWCCCCANTCxgyATTTTTNADXGTrca-3，(SEQIDNO:47)(反義鏈)相應(yīng)于區(qū)域C4Q4TIKNTEWGTR(SEQIDNO:48)(spHAS)。一些位置的堿基的簡并性由IUPAC采用的命名法以其列于表VI中的簡并堿基編碼代表。表VI:[u:PAc編碼-簡并堿基國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(iupac)確立了簡并堿基的標(biāo)準(zhǔn)單字母名稱。它們是B=C+G+TI)=A+G+TH=A+C+TK=T+GM=A+CN=A+C+G+TR=A+GS=G+CW=A+TV=A+C+GX=稀有堿基(在別處詳細(xì)說明)Y=C+T這兩個寡核苷酸得到了459bp的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物是在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離的并用BI0-101Geneclean試劑盒進(jìn)行純化。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用TOP10F，細(xì)胞53作為宿主將該片段克隆入PCR2.1載體中。雙鏈質(zhì)粒DNA是用QIAfilt.erPlasmidMidiKit(Qiagen)從大腸桿菌(TOP10F')中純化的。也合成了兩個其他的簡并的有義引物HAVAF15，-GTNGCTGCTGTWRTXCCWWSXTWTAAYGARGA-3，(SEQIDNO:49)(相應(yīng)于spHAS的區(qū)域V66AAV]:PSYNE(SEQIDNO:50))和HAVDF15，-GTX:圖:'GAYGGNWSXWSNMXGATGAXGC-3'(SEQIDNO:51)(基于spHAS的V1CI°DDGSSNTD(SEQIDNO:52))。基于459bp長的PCR產(chǎn)物序列合成了兩個唯一的反義引物。它們是D181.25'-GAAGGACTTGTTCCAGCGGT-3，(SEQIDNO:53)和D181.45，-TGAATGTTCCGACACAGGGC-3，(SEQIDNO:54)。當(dāng)與D181.2或:[)181.4—起用于擴(kuò)增D181基因組DM時，兩個簡并有義引物的每一個都可以得到預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。將4個PCR產(chǎn)物用與上文相同的策略進(jìn)行克隆和測序。對于每一個PCR產(chǎn)物，對從6個不同克隆中獲得的序列進(jìn)行比較以得到一致序列。因而我們獲得了與spHAS具有高度同源性的具有連續(xù)ORF的1042bp長的序列。C.4文庫篩選將兩個分子探針用于篩選文庫克隆的459bp長的PCR產(chǎn)物和寡核苷酸D181.5(源自1042bp長序列的5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3，(SEQIDNO:55))。將459bp長的PCR產(chǎn)物根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用Prime-It11隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Stratagene)進(jìn)行放射性標(biāo)記。寡核苷酸是通過Kinace-KKinasingKit(Stratagene)用[入"P]ATP進(jìn)行標(biāo)記的。將放射性標(biāo)記的產(chǎn)物在NucTr鄰Push柱(Stratagene)上從非標(biāo)記材料中分離。寡探針特異性地與D181基因組消化物在DNA印跡中進(jìn)行雜交。為了篩選入噬菌體文庫，將XLBLUEMRF'用作含有吸附的噬菌體的硝酸纖維素膜上的宿主(3000噬斑/平板)，于6(rC進(jìn)行預(yù)雜交，并根據(jù)說明書于8(rC在Quik:Hyb雜交溶液(Stratagene)中與5'-末端標(biāo)記的寡核苷酸D181.5進(jìn)行雜交。然后將膜于室溫用2XSSC緩沖液和0.1%(w/V)的SDS洗滌15分鐘，于6(TC用0.1XSSC緩沖液和0.1%的SDS(w/v)洗滌30分鐘，干燥并然后于-7(TC對Bio-MaxMS膜曝光過夜。將陽性噬斑再次平板培養(yǎng)并再篩選兩次。純的陽性噬菌體保存于具有氯仿的SM緩沖液中。用載體引物在這些噬菌體上的PCR揭示了3個不同大小的插入體。用載體引物和來自克隆的1042bp長的序列的不同區(qū)域的引物組合揭示3個不同的噬菌體中只有一個具有完整的M基因。該噬菌體中的插入體大小為6.5kb。通過來自選擇的噬菌體文庫克隆的自身切除將插入物亞克隆入質(zhì)粒形式的嘗試失敗了。因此，在純的陽性噬菌體DNA上再次采用PCR策略以獲得ORF的5'和3'末端。寡核苷酸引物D181.3(5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3')(SEQIDNO:56)和T3(載體引物)擴(kuò)增了3kb長的產(chǎn)物，且寡核苷酸D181.了和T7(載體引物)擴(kuò)增了2.5kb長的產(chǎn)物。ORF的5'和3'末端序列是通過對上述這兩個產(chǎn)物的測序獲得的。對所有PCR產(chǎn)物序列的分析使得我們能夠重構(gòu)1254bp長的seHAS基因的ORF。C.5seHAS的表達(dá)克隆引物是在seHAS的起始和終止密碼子區(qū)域進(jìn)行設(shè)計的，從而在有義寡核苷酸(5，—AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3，)(SEQIDNO:57)中含有EcoRI限串ij位點而在反義寡核苷酸(5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3')(SEQIDNO:58)中含有PstI位點。這些引物從D181基因組DNA以及純的雜交陽性噬菌體中擴(kuò)增了1.2kb長的PCR產(chǎn)物。將該1.2kb長的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化,用PstI和EcoRI進(jìn)行消化并定向克隆入PstI-和EcoRI-消化的pKK223載體中。將連接的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SURE細(xì)胞中，然后使該細(xì)胞在3(TC進(jìn)行生長。該步驟實際上是重要的，這是因為其他宿主細(xì)胞或高溫導(dǎo)致克隆的插入物的缺失。將菌落分離并純化其PDNA。在6個菌落中(名為a、b、c、d、e和f)，5個具有正確大小的插入物，而1個無插入物。C.6HA合成酶活性HA合成酶活性是在從5個上述克隆制備的膜上進(jìn)行測定的。將新鮮的對數(shù)期細(xì)胞于3000g收獲、于fC用PBS洗滌，且將膜通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的原生質(zhì)體方法的修改方法進(jìn)行分離。來自釀膿鏈球菌和類馬鏈球菌的膜制劑也通過不同原生質(zhì)體方法的修改方法而獲得。將膜于37。C在50mMpH7.0的磷酸鈉和鉀中與20mMMgCl2、lmMDTE、120uMUDP-GlcUA禾n300uMUDP-GlcNAc進(jìn)行溫育。糖的整合是用UDP-[14C]GlcUA(318mCi/mmol;ICN)和/或UDP-[3H]GlcNAc(29.2Ci/mmo1NEN)進(jìn)行監(jiān)控的。反應(yīng)是通過加入SDS至終濃度為2%(w/v)而終止的。產(chǎn)物HA是通過下行紙層析從前體分離的并通過在起始時確定整合的放射性而測量。C.7凝膠過濾分析用含有重組seIIAS或spHAS的膜在體外生產(chǎn)的放射性標(biāo)記的HA是通過在聚丙烯酰胺葡聚糖S50()HR(PharmaciaBiotechInc.)的柱(().9X4()cra)上的層析進(jìn)行分析的。樣品(0.4ml于200mMNaCl、5mMpH8.0的Tris-HCl加0.5%SDS中)是用200mMNaCl、5mM的Tris-HCl進(jìn)行洗脫的，并將pH8.0的0.5ml級分進(jìn)行"C和/或3H放射性的測定。HA多糖的真實性是通過用Str印tomyceshyalurolyticus的M-特異性透明質(zhì)酸裂解酶(EC4.2.2.1)于37。C對獨立的相同樣品處理3個小時而測定的。然后將消化物進(jìn)行凝膠過濾。C.8SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡SDS-PAGE是根據(jù)Laemmli方法進(jìn)行的。向硝酸纖維素的電轉(zhuǎn)移是用Bio-RadminiTransblot儀器用20%的甲醇在標(biāo)準(zhǔn)印跡緩沖液中進(jìn)行的。該印跡用TBS中的2%BSA進(jìn)行封閉。將蛋白質(zhì)A/G堿性磷酸酶綴合物(Pierce)和對氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸對甲苯胺用于探測。C.9DNA測序和分析質(zhì)粒是用熒光標(biāo)記的載體引物在兩條鏈上進(jìn)行測序的。測序反應(yīng)是用熒光標(biāo)記的引物(用7-脫氮G)的ThermosequenaseTM試劑盒進(jìn)行的。樣品在PharmaciaALFExpressDNASequencer上進(jìn)行電泳，且數(shù)據(jù)用ALFManager軟件v3.02進(jìn)行分析。插入物的內(nèi)部區(qū)域是用ABIPrism377以內(nèi)部引物進(jìn)行測序的(軟件版本2.1.1)。不明確的區(qū)域是用Sequenase7-脫氮-DNA聚合酶、7-脫氮GTPmastermix(USB)和[a-35S]dATP(AmershamLifeSciences)進(jìn)行人工測序的。將獲得的序列用DMSISv2.1(HitachiSoftwareEngineeringCo.，Ltd.)進(jìn)行匯編和分析。將核苷酸和氨基酸序列與Genbank和其他的數(shù)據(jù)庫中的其他序列進(jìn)行比較。C.lOseliAS的鑒定seHAS的鑒定是用:PCR方法實現(xiàn)的，該:PCR方法具有基于spHAS、DG42(現(xiàn)在已知為發(fā)育調(diào)節(jié)的非洲爪蟾HAS并命名為xlHAS)和NodC(根瘤菌|3-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)中高度一致性的幾個區(qū)域的寡核苷酸引物。XlHAS和NodC蛋白質(zhì)分別與spHAS具有50%和10%的一致性。該策略得到了459bp長的PCR產(chǎn)物，其序列與spHAS具有66.4%的一致性，顯示已鑒定了A組(spHAS)HA合成酶基因的C組同系物(seHAS)。然后將該基因的完整編碼區(qū)用相似的基于PCR的策略進(jìn)行重構(gòu)。然后將最終一套PCR引物用于從基因組DNA中擴(kuò)增完整的0RF。當(dāng)將1.2kb長的PCR片段插入到表達(dá)載體p腦3中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SURE細(xì)胞中時，在來自5個檢驗的菌落中的分離膜中證實了H:A合成活性。重構(gòu)的基因的0RF編碼417個氨基酸的預(yù)測的新蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)未在數(shù)據(jù)庫中且比spHAS短2個氨基酸。兩個細(xì)菌蛋白質(zhì)具有72%的一致性，且核酸序列具有70%的一致性。seMS蛋白質(zhì)的預(yù)測分子量是47，778，且預(yù)測的等電點為pH9.1。最近鑒定的哺乳動物HAS如小鼠和人同工酶(在圖2中分別為niH:AS1、2、3和hH:AS1、2、3)與細(xì)菌蛋白質(zhì)相似。兩組之間的總一致性為28-31%，且此外seHAS中的許多氨基酸與那些真核的HAS是高度保守的(如K/R或D/E替代)。PBCY-1HAS即A98R與哺乳動物HAS具有28-33%的一致性，并預(yù)測在脂質(zhì)膜上具有相似的拓?fù)鋵W(xué)。在哺乳動物物種中，相同科的成員是幾乎完全相同的(如muHASl和hu:HASl是95%相同的；rau:HAS2和huHAS2是98%相同的)。然而，如圖3所示，即使在相同的物種中，不同的HAS家族成員也是相當(dāng)不同的(如muHAS1和muHAS2是53%相同的；muHASl和muHAS3是57%相同的；muHAS2和muHAS3是71%相同的)。圖11顯示seMS的親水性圖和預(yù)測的膜拓?fù)鋵W(xué)。鏈球菌C組HAS的親水性圖是由Kyte和Doolittle的方法(J.Mol.Bio:l..157,105,1982)用DNAS]:S生成的。該蛋白質(zhì)據(jù)預(yù)測為整合膜蛋白質(zhì)。圖12顯示膜中seHAS的拓?fù)鋵W(xué)組織的模型。所提出的蛋白質(zhì)拓?fù)鋵W(xué)遵守進(jìn)料(charge-in)規(guī)則，并使大的中央結(jié)構(gòu)域置于內(nèi)部。該結(jié)構(gòu)域可能含有酶的大多數(shù)底物結(jié)合和催化功能。在所有HAS家族成員中保守的seHAS中的Cys226以及其他3個半胱氨酸顯示于中央結(jié)構(gòu)域中。Cys281是關(guān)鍵的殘基，其改變可巨大地改變由酶合成的HA產(chǎn)物的大小分布。對seHAS預(yù)測的總體膜拓?fù)鋵W(xué)與迄今報道的對spHAS和真核HAS預(yù)測的相同。該蛋白質(zhì)在氨基末端具有兩個推定的跨膜結(jié)構(gòu)域,且在羧基末端具有2-3個膜結(jié)合或跨膜結(jié)構(gòu)域。兩個鏈球菌酶的親水性圖幾乎是相同的，并闡明了在預(yù)測seHAS中K3l3-R4Q6(spHAS中K313-K4Q5)的90個殘基的極度疏水區(qū)域的拓?fù)鋵W(xué)中的困難。seHAS在大腸桿菌細(xì)胞中是有效表達(dá)的。如由SDS-PAGE凝膠染色測定的，大約1()%的總膜蛋白質(zhì)是se:HAS(圖5)。42kD的顯著的se:HAS條帶在僅有載體的對照泳道中是基本缺失的。在SURE細(xì)胞中用相同的載體,對于spHAS也發(fā)現(xiàn)膜蛋白質(zhì)這-異常高水平的表達(dá)。大腸桿菌SURE細(xì)胞中約8%的膜蛋白質(zhì)是spHAS。相反地，C組膜中seHAS的量不超過總膜蛋白質(zhì)的1%。A組膜中的spHAS幾乎不能被探測到。在大腸桿菌SURE細(xì)胞中表達(dá)的重組se:HAS在體內(nèi)不合成H:A，這是因為這些細(xì)胞缺失必需底物之一UDP-GlcUA。然而，含有重組seHAS蛋白質(zhì)的膜在提供底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA時合成HA(圖13)。圖13表示由重組seHAS對真實HA的合成。將從含有重組seHAS或單獨載體的細(xì)胞制備的大腸桿菌膜(69iig)于37。C與700yMUDP-[3H]GlcNAc(2.78X103dpm/nmol;□、■)和300uMUDP-[14C]GlcUA(3.83Xl()3dpm/nniol;0、鑤)在此處描述的200y1終體積中溫育1個小時。酶反應(yīng)是通過加入EDTA至25mM的終濃度而終止。將反應(yīng)混合物的一半用鏈霉菌透明質(zhì)酸酶于37t:處理3小時。將SDS(2X，w/v)加入到透明質(zhì)酸酶處理的(O、□)和未處理的(、■)樣品中，該樣品于9(TC加熱1分鐘。將該樣品用柱緩沖液(5慮56Tris、0.2MNaCl，pH8.0)稀釋到500u1，用離心使其澄清并將200u1注射入聚丙烯酰胺葡聚糖S-500服柱中。收集級分(lml)并確定放射性。BD是藍(lán)色葡聚糖(2X106DA;Pharmacia)的峰值洗脫位置。V。標(biāo)記孔隙體積，且V工標(biāo)記內(nèi)體積(includedvolume)。整合到柱中分級分離的:HA的總量中的[14C]GlcUA:[3H]GlcMc比例是1.4，該比例與兩種底物的特異性活性比例相同。因此，整合到產(chǎn)物中的糖的摩爾比例是如對真實的HA預(yù)測的1:1。來自用單獨載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的膜不合成HA。使用120yMUDP-GlcUA和300iiMUDP-GlcNAc,HA合成相對于膜蛋白質(zhì)是線性的(在《().2iig時)且這種線性維持至少1個小時。同樣地，從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或用載體單獨轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制備的膜不具有可探測的HAS活性。如果Mg"與EDTA螯合(<對照的5%)或如果缺失了兩種底物之一(對照的2%)，那么HA合成是沒有的。重組seHAS也顯示對糖核苷酸底物的預(yù)期的特異性，不能夠使UDP-GalA、UDP-Glc或UDP-GalNAc之一與兩種正常底物之一共聚合(表II:)。根據(jù)凝膠過濾分析，在分離的膜中由seHAS合成的HA的平均質(zhì)量為5-10X106Da。基于兩種糖的等摩爾整合及其對特定的鏈霉菌透明質(zhì)酸酶降解的敏感性，可以斷定重組seMS的產(chǎn)物是真實的HA(圖13)。盡管對于總體M合成的條件不是最適的(因為一種底物的90%整合到產(chǎn)物中)，但該酶產(chǎn)生了H:A鏈長度的廣泛分布。峰值級分相應(yīng)于7.5X106Da的HA物質(zhì)，該HA物質(zhì)是含有約36，000個單聚糖的多聚體。在該柱子上分解的HA大小的分布范圍為2-20X106Da。推定的seHAS的蛋白質(zhì)序列是通過spIIAS蛋白質(zhì)的抗體與C組蛋白質(zhì)的交叉作用的能力證實的(圖9)。全長spHAS蛋白質(zhì)或僅僅spHAS的中央結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體也與seHAS蛋白質(zhì)相互作用。針對spHAS的C-末端的抗肽的抗體不與seHAS蛋白質(zhì)中這--有些趨異的區(qū)域相互作用。然而，抗spHAS序列E147-T161的抗肽抗體識別seHAS中相同的預(yù)測序列。該抗肽抗體也與鏈球菌膜中的天然seHAS和spHAS蛋白質(zhì)反應(yīng)，并證實來自兩個物種的天然和重組酶具有相同的大小。如同spHAS蛋白質(zhì)，seHAS在SDS-PAGE上遷移異常地快。盡管計算質(zhì)量為47，778Da，由SDS-PAGE所得的Mr—致地為42kDa。由于其中央結(jié)構(gòu)域區(qū)域中的序列一致性和對兩種細(xì)菌酶預(yù)測的總體一致的結(jié)構(gòu)，抗區(qū)域E147-T161的肽特異性抗體可用于在膜中使MS蛋白質(zhì)的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化,該膜從用兩種不同酶的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制備。利用這種方法，將具有基本相同量的重組sp:HAS或seHAS的膜進(jìn)行關(guān)于HA合成的起始速率和HA產(chǎn)物的大小分布的比較。如對于spHAS所顯示的，HA鏈由HAS的合成是持續(xù)的。該酶表現(xiàn)為與生長的HA鏈結(jié)合，直到該鏈作為終產(chǎn)物釋放。因此，可能的是在第一輪M鏈合成中，通過監(jiān)控在早期生產(chǎn)的HA鏈的大小分布而比較由seHAS和spHAS使HA延伸的速率?；诓煌瑫r間對HA產(chǎn)物大小的凝膠過濾分析，我們估計由seHAS延伸的平均速率在37t:為約9，000個單糖Z分鐘(圖10)。在5分鐘內(nèi)，該酶可聚合5-10X106Da的HA鏈。因此在60分鐘的溫育中，每一個酶分子能夠起始、完成并釋放5-8個這樣的大M分子。在早期(如《1分鐘時)，作為第一條HA鏈延伸的反映，由seHAS合成的HA的大小與spHAS相比更大。在60分鐘時，HA產(chǎn)物大小的兩種分布不可區(qū)別?？寺〉膕eHAS代表真實的C組HA合成酶。因此前面報道的或公開的"C組"蛋白質(zhì)不是真正的C組HAS。seHAS蛋白質(zhì)與來自細(xì)菌、脊椎動物和病毒的9種目前已知的M合57成酶同源,這些合成酶組成該快速增長的HA合成酶家族。該同源性特別地顯示于圖2中。在哺乳動物中，3個命名為HAS1、HAS2和HAS3的基因已得到鑒定并定位到人和小鼠的3個不同的染色體上。在兩棲動物中，迄今鑒定的唯一的MS蛋白質(zhì)是發(fā)育調(diào)節(jié)的DG42，該蛋白質(zhì)于1988年克隆且現(xiàn)在通過在酵母膜中重組蛋白質(zhì)的分析已知其編碼HA合成酶活性?？赡芷渌侵拮傅腍AS基因?qū)⒑芸毂昏b定。趨異的進(jìn)化模型表明原始的細(xì)菌HAS前體可能在脊椎動物發(fā)育的早期被侵占了，或者當(dāng)原始細(xì)菌捕獲了原始的MS時細(xì)菌制備HA被膜的致病策略得到發(fā)展。細(xì)菌和真核HAS酶向共同結(jié)構(gòu)的趨同進(jìn)化似乎是不可能的，但也許已發(fā)生。至少10個鑒定的HAS蛋白質(zhì)預(yù)測為具有相似拓?fù)鋵W(xué)的膜蛋白質(zhì)。HA合成發(fā)生于質(zhì)膜上，且HA或者釋放入培養(yǎng)基中或者保持與細(xì)胞結(jié)合以形成細(xì)菌被膜或真核細(xì)胞外周被膜。胞質(zhì)中的糖核苷酸底物用于組裝M鏈,該M鏈通過膜伸出到外周空間。H:AS蛋白質(zhì)的極其疏水的羧基部分的蛋白質(zhì)拓?fù)鋵W(xué)在理解該酶如何同時在生長的HA鏈從膜伸出時使其延伸中是關(guān)鍵的。例如，空前的酶活性可能需要蛋白質(zhì)與脂雙層的異常且復(fù)雜的相互作用?；趕pHAS-堿性磷酸酶融合蛋白質(zhì)分析的初歩結(jié)果顯示氨基和羧基末端及大的中央結(jié)構(gòu)域均為細(xì)胞內(nèi)的，如圖11和12所示。seMS蛋白質(zhì)也含有大的中央結(jié)構(gòu)域(為總蛋白質(zhì)的63%),該結(jié)構(gòu)域似乎含有兩個底物結(jié)合位點和:HA合成所需的兩種糖基轉(zhuǎn)移酶活性。盡管目前的軟件程序不能可靠地預(yù)測長的C-末端疏水區(qū)段中的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和特性，但所提出的拓?fù)鋵W(xué)組織與目前的證據(jù)一致，且也適用于真核的酶，該真核的酶主要由于蛋白質(zhì)的C-末端2個預(yù)測的額外跨膜結(jié)構(gòu)域的延伸而大40%。spHAS中6個Cys殘基的4個是與seH:AS保守的。僅有spHAS中的Cys225和seHAS中的Cys224是在HAS家族的所有成員中保守的。由于巰基反應(yīng)試劑如對苯甲酸汞(p-mercurobenzoate)或NEM極大地抑制HAS活性，可能的是該保守的Cys是酶活性必需或重要的。然而,來自定點誘變研究的最初結(jié)果顯示spHAS的C225S突變體不是無活性的，它保持了野生型活性的5-1()%。用特異性的寡核苷酸對僅編碼seHAS、僅編碼鄰HAS或編碼seHAS和spHAS兩者的核酸序列的識別顯示于圖14中。基于SEQIDN0:1的序列和spHAS的編碼序列設(shè)計了3對有義-反義寡核苷酸?；趕eHAS的核酸區(qū)段(分別為sel-se2和sesp卜sesp2，SEQIDN()S:3-6)顯示于圖15中。使這3個寡核苷酸對在一般的:PCR反應(yīng)條件下與基因組DNA進(jìn)行雜交，該基因組DNA來自C組(seHAS)(泳道2、4和6)或A組(spHAS)(泳道3、5和7)鏈球菌。泳道1和8以kb(千堿基)顯示麗標(biāo)準(zhǔn)的位置。PCR反應(yīng)用T叫DNA聚合酶(來自Promega)進(jìn)行如下25個循環(huán)94攝氏度1分鐘以實現(xiàn)DNA變性、48攝氏度(對于較小的通用sesp引物為42攝氏度)1分鐘以使得能夠雜交、72攝氏度1.5分鐘以進(jìn)行DM合成。然后將PCR反應(yīng)混合物通過在1%瓊脂糖凝膠上的電泳而進(jìn)行分離。sel-se2引物對設(shè)計為對C組HAS(seHAS)具有唯一的特異性。sp卜sp2引物對設(shè)計為對A組HAS(spHAS)具有唯一的特異性。sesp卜sesp2引物對設(shè)計為可與A組和C組HAS核酸序列兩者進(jìn)行雜交的。所有3個引物對均如預(yù)期地起作用，從而顯示相互雜交及支持特異性的和Z或唯一的PCR產(chǎn)物生成的適當(dāng)能力。用于特異性PCR或雜交的寡核苷酸顯示于圖15中。對于SEQIDN0S:3、4、5和6的合成寡核苷酸的每一個均顯示了SEQIDNO:1的相應(yīng)區(qū)域。該4個寡核苷酸的每一個均將特異性地與seHAS序列雜交，且適當(dāng)?shù)挠辛x/反義引物對適合用于如在圖14中所示的聚合酶鏈反應(yīng)。在枯草芽孢桿菌中seHAS的表達(dá)圖16A和16B證明來自枯草芽孢桿菌菌株枯草芽孢桿菌168中的se:HAS的重組:HA生產(chǎn)，如由凝膠過濾層析所證實的。圖16A是用單獨的pSM143載體轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌168中HA生產(chǎn)與用含有seHAS的pSM143轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌168進(jìn)行比較的圖。HA的生產(chǎn)可通過約13.5分鐘約16分鐘之間的峰值來顯現(xiàn)。圖16B是該峰值的放大以忽略由未整合到HA中的放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)和糖導(dǎo)致的大峰值，該峰值可在圖16A中于約16.5分鐘約20分鐘之間看到。在枯草芽孢桿菌中對由spHAS的重組HA生產(chǎn)的凝膠過濾分析圖17A證明枯草芽孢桿菌中由spHAS生產(chǎn)的重組M大小分布的營養(yǎng)控制。編碼spHAS酶的枯草芽孢桿菌168(pPD41A5)培養(yǎng)于LuriaBertani液體培養(yǎng)基(LB)中，其生產(chǎn)的HA在比培養(yǎng)于Spizzizens培養(yǎng)基(Sp)中的相同菌株(峰值在約14.43分鐘)更早的時間點(峰值在13.48分鐘)從凝膠過濾柱....匕洗脫。這兩種培養(yǎng)物是平行生長的，但更大的M是由生長于LB中的細(xì)菌生產(chǎn)的。含氚的HA的放射性是由每秒的裂變(DPS)來定量的。陰性對照顯示枯草芽孢桿菌通常不生產(chǎn):HA。由用spHAS轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌得到的HA峰值對特異性的HA裂解酶敏感但不對蛋白酶敏感。因此，人們可通過改變宿主細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基而改變在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的M的分子量。例如，與在化學(xué)確定成分培養(yǎng)基如Spizzizens培養(yǎng)基或M9基本培養(yǎng)基中生長的重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的HA相比，通過使重組宿主細(xì)胞在復(fù)合培養(yǎng)基中生長可生產(chǎn)更大分子量的HA分子，如LB(LuriaBertani)、TerrificBrot.h、NZCYM、SOB、SOC或2xYT培養(yǎng)基。HA的大小也可通過提供的碳源如葡萄糖而改變。圖17B顯示當(dāng)利用含有spHAS的枯草芽孢桿菌168和含有單獨載體的枯草芽孢桿菌時在峰值中的差異。將在用3H葡糖胺對枯草芽孢桿菌進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記之后獲得的培養(yǎng)基樣品通過凝膠過濾進(jìn)行分析。通過利用該方法，可能確定由細(xì)菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸(HA)的相對大小和量。所有樣品在進(jìn)行凝膠過濾之前通過16,000Xg離5分鐘而澄清。放射性成分是用LB5()8RadioflowDetector(EG&GBerthold)和Zinssercocktai:1.(1.8ral/min)探測的。多聚物的大小是通過在PhenomenexPolyS印-GFC-P5000或6000柱(300X7.8mm)上的層析進(jìn)行分析的，i亥柱在Waters600E系統(tǒng)....匕以0.2M硝酸鈉在0.6ml/min進(jìn)行洗脫。該柱是用各種大小的葡聚糖(S80、145、50和20kDa)或具有平均分子量為600和8()k:[)a的MAN']:'-標(biāo)記的HA(I)eAngelis，2001)通過MALLS進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于MA[丄S，首先將HA多聚物(100iig)加載到兩個串聯(lián)TosoBios印TSK-GEL柱(6000PWXL伴隨4000PWXL;每一個7.8mm，30cm;日本)上并在pH7的50mM磷酸鈉、150mMNaCl中于O.5ml/min進(jìn)行洗脫。使洗脫液以多角度的模式流經(jīng)OptilabDSP干涉度量折光計，然后流經(jīng)DawnDSF激光光度計(632.8nra;WyattTechnology,SantaBarbara,CA)。生產(chǎn)商的軟件包用于用0.153的dn,ZdC系數(shù)確定絕對平均分子量。HA標(biāo)準(zhǔn)是通過用N-met.hylisatonicanhydride對鏈球菌HA多糖上的羥基基團(tuán)進(jìn)行亞化學(xué)計量標(biāo)記(1MANT/50個單糖)而制備的。600kDa的標(biāo)準(zhǔn)是通過用制備級HPLC通過對大批HA的分級分離而獲得的。對大批HA用具有microtip的HeatSystems-UltrasonicW-380超聲波儀(電源設(shè)置4)進(jìn)行延長的超聲處理(總時間30分鐘，2分鐘間隔時間，1%丙酮水溶液，冰溶)以生產(chǎn)80kDa的標(biāo)準(zhǔn)。多殺巴斯德氏桿菌HAS的異源表達(dá)pPm7A插入物中的PmHAS0RF是用Taq聚合酶(Fisher)和引物的13個循環(huán)的PCR進(jìn)行擴(kuò)增的，該引物相應(yīng)于靠近推定的氨基和羧基末端的序列(密碼子為大寫有義的，5'-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAAG-3'(SEQIDNO:59)，和反義的，5，-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3，(SEQIDNO:60);起始和終止密碼子分別為粗體)。對密碼子2(T到C)進(jìn)行了改變(斜體小寫字母)以增加大腸桿菌中蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。該引物也含有EcoRI和PstI限制位點(下劃線的)以促進(jìn)向表達(dá)質(zhì)粒pKK223-3中(tac啟動子，Pharmacia)的克隆。將結(jié)果所得的重組構(gòu)建體pPmllAS轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SURE細(xì)胞(Stratagene)中，并將該菌株用作體外HAS測定的膜制劑的來源。將對數(shù)期培養(yǎng)物(LB液體培養(yǎng)基，30t:)在收獲前用0.5mM的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)3個小時。將該質(zhì)粒也轉(zhuǎn)化入大腸桿菌K5中；對結(jié)果所得的菌株用光學(xué)顯微鏡和浮力密度離心進(jìn)行被膜存在是否的鑒定。K5細(xì)菌培養(yǎng)物常規(guī)地不受誘導(dǎo)，這是因為IPTG的加入不顯著地增加LB或確定成分培養(yǎng)基中HA的水平。K5細(xì)菌是有用的外源宿主，這是因為它們含有在HA合成中與pmHAS相互作用的多糖轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)和機(jī)制；這些蛋白質(zhì)促進(jìn)HA向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運。源自含有pPmHAS質(zhì)粒的大腸桿菌SURE細(xì)胞的膜而不是源自僅單獨具有載體pKK223-3的細(xì)胞的樣品，當(dāng)提供了兩種UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc時可在體外合成HA(分別為25vs.*1.5pMo:[GlcUA轉(zhuǎn)移[mg蛋白質(zhì)]-1[小時]-1)。如果省略了UDP-G:[cNAc或如果二價金屬離子用EDTA螯合時，觀察不到[14C]GlcA的整合。源自重組HAS的HAS活性與從野生型多殺巴斯德氏桿菌膜中獲得的酶相似，這是由于Mr^比Mg"刺激了至少多10倍的活性。利用標(biāo)記的HA結(jié)合蛋白質(zhì)也對重組大腸桿菌培養(yǎng)物用放射分析測定進(jìn)行了HA多糖存在性的檢驗。具有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了每A600為460ug/ml的HA)。具有單獨的pKK223-3載體的K5細(xì)胞不產(chǎn)生HA(t每A600為0.01ug/ml的HA)。作為比較地，生長于相同培養(yǎng)基上的野生型多殺巴斯德氏桿菌P-1059產(chǎn)生了每A600為1,100iig/ml的M。具有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了這樣高水平的HA從而細(xì)胞變成被囊化的了(圖18A)。重組菌株的被膜的半徑為0.2-0.5踐(假設(shè)細(xì)菌細(xì)胞的寬度為0.5踐)。該被膜可通過用綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶或鏈霉菌HA裂解酶進(jìn)行處理而去除(圖18B)。天然的K5宿主菌株或含有PKK223-3載體的轉(zhuǎn)化體均不具有由光學(xué)顯微鏡確定的易于觀察的被膜。通過浮力密度離心也相信具有P:PmHAS的K5細(xì)胞是被囊化的。重組細(xì)胞浮在58%的Precoll墊層的頂部，而載體對照細(xì)胞或透明質(zhì)酸酶處理的重組細(xì)胞經(jīng)過Percoll墊層而沉淀(未顯示)。被膜生物合成過程中糖基轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)運中的作用糖基轉(zhuǎn)移酶催化重復(fù)的GAG主鏈的形成,但是在某些情況中，這些相同的多肽也可在多聚物經(jīng)過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運中起作用。革蘭氏陽性的A和C組鏈球菌僅具有一層脂膜，且被膜操縱子編碼合成酶和UDP-GlcUA生產(chǎn)的兩種酶UDP-葡萄糖脫氫酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(4千堿基的DNA;Crater和vandeRijn，1995)。對一系列含有報道酶的鏈球菌spHAS融合蛋白質(zhì)的拓?fù)鋵W(xué)分析顯示該合成酶至少跨過雙分子層4次且密切地與膜相聯(lián)(Heldermon等人，2001)(圖19)。根據(jù)生物化學(xué)和生物物理學(xué)分析，由spHAS或seHAS多肽單體和16個脂質(zhì)分子組成的復(fù)合物可催化兩種UDP-糖向新生的HA鏈的轉(zhuǎn)移(Tl鄰ak-Simmons等人，1998)。人們推測小的膜內(nèi)在多肽spHAS或seIIAS需要脂質(zhì)的輔助以促進(jìn)生長的HA多聚物鏈通過生成蛋白質(zhì)/脂質(zhì)核心而跨過疏水核心的轉(zhuǎn)運。另一方面，能夠進(jìn)行GAG生物合成的革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌和多殺巴斯德氏桿菌具有兩層脂膜，且其被膜座位編碼除糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-GlcUA形成酶之外的許多轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白質(zhì)(10-18千堿基；Roberts,1996;Townsend等人，2001)。盡管許多細(xì)節(jié)尚未完全理解，但在最充分研究的模型大腸桿菌II組被膜系統(tǒng)中，看來新生多聚物鏈的轉(zhuǎn)運需要由至少7個不同的多肽種類組成的裝置(Whitfield和Roberts,1999;Silver等人，2001)。簡單地說，含有KpsC、M、S、T的復(fù)合物在內(nèi)膜進(jìn)行裝配并與KfiA、B、C催化復(fù)合物相互作用。KpsM和T形成ATP-結(jié)合型盒式(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白。周質(zhì)蛋白質(zhì)KpsD和另一種膜蛋白質(zhì)Kps:E的二聚體有助于將多聚體轉(zhuǎn)運過周質(zhì)間隙(Arrecubieta,2()01)。在外膜上招募了孔蛋白復(fù)合物以將生長的多糖鏈轉(zhuǎn)運出細(xì)胞。某些Kps突變體使被膜多糖鏈多聚化，但具有錯誤的轉(zhuǎn)位，結(jié)果導(dǎo)致胞質(zhì)或周質(zhì)中多聚體的積聚?；谄渫贫ǖ霓D(zhuǎn)運蛋白質(zhì)與大腸桿菌蛋白質(zhì)的序列相似性和基因組織,同樣認(rèn)為多殺巴斯德氏桿菌具有類似II組的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。在pmHAS和pmCS的情況中，羧基末端尾巴可能含有與轉(zhuǎn)運機(jī)制相互作用的?？?docking)區(qū)段(Jing和DeAngelis，2000)(圖19)，在此處明確地整體引入作為參考。乳房鏈球菌MS圖21闡明來自乳房鏈球菌的4個獨立的粘液樣菌落的HAS基因的PC:R擴(kuò)增。對于每一個樣品，在約1.25kb長的預(yù)期大小處有明顯的條帶，該條帶相應(yīng)于suHAS的完整讀框加通過PCR擴(kuò)增加入的限制位點。圖22闡明來自釀膿鏈球菌、類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的HA合成酶活性。其他鑒定的H:AS序列除已在此處公開的且在圖2中的比對中闡明的HAS序列之外，也鑒定了其他HAS序列，該序列可用于在本發(fā)明的芽孢桿菌物種中生產(chǎn)HA的方法。例如，SEQIDN0S:15和16分別公開了在古細(xì)菌硫磺礦硫化葉菌中發(fā)現(xiàn)的M合成酶的核苷酸和氨基酸序列。由于其在高溫下即約75。C發(fā)揮功能的能力，該H:A合成酶從嗜極端菌中(extreniophi:l.e)的分離提供了具有比在此處前文中描述的HA合成酶更好的穩(wěn)定性和更快的動力學(xué)的HAS。與鏈球菌hasABC操縱子相似的一組基因已在炭疽芽孢桿菌質(zhì)粒pXOl中鑒定，該質(zhì)粒含有炭疽毒素基因。然而，pXOl中基因的順序為A、C、B。pX01質(zhì)粒的完整序列在訪問號No.AF065404下，且與hasA相似的序列是該序列的():RF93，其起始于111374而終止于112474。SEQIDN0S:17和18分別代表與在炭疽芽孢桿菌pXOl中鑒定的hasA相似的基因的核苷酸和氨基酸序列。在炭疽芽孢桿菌中沒有多糖被膜的報道，因此，鑒定這些基因的研究小組0kinaka等人相信p0X10RF93、94和95是仍然必須被拋棄的無功能基因的例子(J.Bacteriol.181:6509(1999))。在可感染褐藻Ectocarpussiliculosus的病毒中已鑒定了第三個推定的HAS。氨基酸和核苷酸序列分別列于SEQIDN0S:19和20中。該情況可能與PBCV-1病毒的cvHAS相似。61一個證明任何推定的HA合成酶的HA合成酶活性(天然的或重組的)的方法包括使細(xì)菌生長于液體培養(yǎng)基中、提取多糖級分(即陽離子去污劑沉淀/高鹽提取/醇沉淀/再溶解于水中./溶劑提取/醇沉淀)及在酸水解之后進(jìn)行單糖成分的分析。進(jìn)一步的分析包括完整多聚物和酶(HA裂解酶、軟骨素酶(chondroitinase)等)處理的樣品的瓊脂糖凝膠電泳。同樣地，在ELISA或競爭形式用特異性HA結(jié)合蛋白質(zhì)的生物學(xué)測定是有用的。為對酶進(jìn)行檢驗，從細(xì)胞中制備了膜，提供了各種UDP-糖，然后分析了向多聚物的整合，隨后進(jìn)行層析和./或電泳。通過用PCR和引物與基因組DNA制備使得能夠?qū)?RF克隆入表達(dá)載體的基因盒，觀察到了異源表達(dá)。各種宿主均可用這種載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且可對結(jié)果所得的重組細(xì)胞進(jìn)行在此處前文描述的多糖和/或酶的分析。因而應(yīng)該明顯的是已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明提供了重組宿主細(xì)胞，該細(xì)胞具有在其中引入的編碼酶活性MS的編碼區(qū)的純化核酸區(qū)段，以及從重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，該方法完全滿足在上面提出的目的和優(yōu)點。盡管本發(fā)明已與其特定的實施方案一起進(jìn)行了描述，但明顯的是許多改變、修飾和變化對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的。因此，在附加的項目中想要包含所有這些在附加的項目的精神和廣泛范圍內(nèi)的改變、修飾和變化。在本申請中提出的所有數(shù)字和數(shù)量測量(包括在實施例和項目中的)均為近似值。在此處說明性地公開和申請專利的本發(fā)明可適當(dāng)?shù)卦诓淮嬖谌魏螞]有在此處特定地公開或申請專利的元件時進(jìn)行實踐。因而，本發(fā)明可包含在此處公開或申請專利的元件、由其組成或基本由其組成。下面的項目在符合本申請的情況下具有盡可能寬的范圍。該項目不必限于優(yōu)選的實施方案或在實施例中顯示的實施方案。圖6:透明質(zhì)素在瓊脂凝膠上染色的數(shù)字圖像。不同的菌種被標(biāo)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有hasB基因以及功能性hasA基因(pP:[MlA5)或非功能性hasA基因(pP:[MlAEcoRV)。每--泳道代表在新鮮生長培養(yǎng)基中接種的獨立菌落，所有培養(yǎng)物在同一時間收獲。收獲培養(yǎng)物時600nm吸收值標(biāo)示于圖像底部。細(xì)胞離心之后，移去培養(yǎng)基，并用瓊脂凝膠分析。StainsAll染色為黑色的表明有HA。在另一個實驗中，幾乎所有由轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生產(chǎn)的材料都被特異性透明質(zhì)酸裂解酶去除，這證明了所述材料是H:A。含有p:PD41AEcoRV的菌株不能生產(chǎn)HA，因此它們實際上都是陰性的。地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物也表明能生產(chǎn)HA。圖20:基因組DNA從乳房鏈球菌的四個分離的粘液狀菌落(泳道2-5)制備，并用設(shè)計來擴(kuò)增全長編碼區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5'(正向)引物含有5'BaraH]:和pstl限制性酶切位點(斜體字)，其序列如下:ATGGAAAAACTAAAAAATCTC(SEQIDNO:42)。3'(反向)引物含有5'EcoRI和pstl位點(斜體字)，其序列如下TTATTTACTTGTCTTTTTACG(SEQIDNO:43)。反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳分析，并用溴化乙錠染色，接著制備數(shù)字圖象。在每一樣品中，在1.25kb的預(yù)期大小處，有一明顯的條帶(箭頭指示)，其相應(yīng)于suHAS的完整閱讀框加限制性位點。泳道1含有l(wèi)ambdaDNA的HindIII消化物，其作為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。圖21:HA合成活性用紙層析測定法通過。5-12ug膜蛋白)。t]UDP-GlcUA整合入HA而測定(使用約-----OrigiriEilMessage-----序列表〈110〉WEIGEL，PAULH.KUMARI，KSHA脆DEANGELIS，PAUL<12()>透明質(zhì)素合成酶基因及其表達(dá)〈130〉619908-5〈140>PCT/US02/18915〈141〉2002-06-13〈15()>6()/297，744〈151>2001-06-13〈150>60/297，788〈151>2001-06-13<15()>()9/469，2000〈151〉1999-12-21〈150>09/178，851〈151〉1998-10-26〈15()>6()/064，435〈151>1997-10-31〈160>60〈170〉PatentlnVer.2.丄<210>1〈211>1254〈212>DNA〈213〉類馬鏈球菌〈4()()Mcataactgttgtggcctttagtattttttgggtactgt.tg60atttacgtcaatgtttetctctttggtgcttgtcaatttatggctttttg120ctgatagcttttatcctttt180鄉(xiāng)gctgggctgcagccattattccctctttgetgagtea240ttgctegagacctta朋肌gtgttcagcagca肌cctatcccctagcagaaatttatgtt300gttg3Cg3tgg卿tgCtg3tgtgCgtg3C360actggtgficctgtcattgttcatcggtctig420catgcacaggcctgggccttgadgetgatgtctttttgaccgttgactca480gatacttatatctaccctgatgctttagagaaacc11.taatgacccaact540gtttttgctgcgacgggtcaccttaatgtcaaaccaatctcttaacacgc600ttcgctatgataatgcttttggcgUgtmcgtigctgccca660ggtaatatccttgtttgctcaggtccgcttagcgtttacagacgcg郷tggttgttcct720ccagaccttcctgggtattcctgtaagtattggtgatgac780郷tgcttg3ccaactatgc&mctgfitttfitttatcaatc840tg'tattacag'atg'ttcctgacaag'atgtctacttacttg'accg'ctgg'aac900aagtccttcttta^gagtccattatttcttcaXga^ca^tccttttgta960gccctatggaccatacttgaggtgtctatgtttatgatgcttgtttattctgtggtggat1020ttctttgtaggC肌tgtC3gtggctcagggttttagcctttctggtga;tt1080atcttcattg'ttgccctgtgtcg'gaacattcattacatgcttaag'cacccgctg'tccttc1140ttgttatctccgttttatggggtgctgcatttgtttgtcctacagccctt1200tctctttttatgctgactggggaaceicgtaa3a^tt8tt1254〈210〉2〈211〉417〈212>PRT〈213〉類馬鏈球菌〈400>2Met1TrpArgThrLeuValLeuSerLeuMetTyr65LeuSer50:L.ysSer35LeuLeu20lieL.ys5lieTyrLeuGluThrLeu85ValIleTrp145Asp130AlaThrTyrlieAsnAspProThr180Tyr165ValAsnLeulieThrValValAlaPhe10TyrLeuPheGlyTyrValAsnGlySerPhePheVa:[AlaAlalie70LysAspPheTyr55lieLeu40LysVal25LeulieAlaTyrLeu45ArgProPheLysProSerTyrSerValGinGlulieTyrVal100ArglieGluAspTyrVal115HisArgSerGluPheGluArgSer150ProAspArgL.ys135AspGlySer105AspThr120AsnGinGin90AlaGlyG:lyAlaAspValAspAla_LeuPheAlaAlaThr185Glu170GlyAsn75GinAspAspL.ysPhe155GluGly60GluThrGluLeuArg140LeuSerAla30LeuAlaAlaProAsp丁yrThrGly110SerSer125HisAlalie15LysValGlyGluLeu95lieAsnGinThrValAspLeuLeuLysHisLeuAsnVal190Thr175ArgPheGlyGinSer80AlaLysValAlaSer160PheAsn64ArgGinThrAsnLeuLeuThrArgLeuThrAsplieArgTyrAspAsn195200205AlaPheGlyValGluArgAlaAlaGinSerValThrGlyAsnlieLeu210215220ValCysSerGlyProLeuSerValTyrArgArgGluValValValPro225230235240AsnlieAspArgTyrlieAsnGinThrPheLeuGlylieProValSer245250255lieGlyAspAspArgCysLeuThrAsnTyrAlaThrAspLeuGlyLys260265270ThrValTyrGinSerThrAlaLysCyslieThrAspValProAspLys275280285Met.SerThrTyrLeuLysGinGinAsnArgTrpAsnLysSerPhePhe290295300ArgGluSerlielieSerValLysLyslieMetAsnAsnProPheVal305310315320AlaLeuTrpThrlieLeuGluValSerMetPheMetMetLeuValTyr325330335SerValValAspPhePheValGlyAsnValArgGluPheAspTrpLeu340345350ArgValLeuAlaPheLeuVallieliePhelieValAlaLeuCysArg355360365AsnlieIiisTyrMetLeuLysHisProLeuSerPheLsuLsuSerPro370375380PheTyrGlyValLeuHisLeuPheValLeuGinProLeuLysLeuTyr385390395400SerLsuPheThrlieArgAsnAlaAspTrpGlyThrArgLysLysLeu405410415Leu〈210>3〈211>22〈212>DNA〈213〉類馬鏈球菌〈400>3gCtg￡ltg￡lg3C￡lggt￡ltt￡l￡lgC22〈21()>4〈211>20〈212>DNA〈213〉類馬鏈球菌65〈400>4atcaaattcti:tgacattgc20〈210>5〈211>2()〈212>DNA〈213〉類馬鏈球茼〈400>5gactcagtitaI20〈210>6〈211>17〈212〉DNA〈213〉類馬鏈球菌〈400>6tt.tttacgtgttCCCCEl17〈210>7〈211)567〈212>PRT〈213〉小球藻病毒PBCV-l〈400〉7MetGlyAsnlielielieMetValSerTrpTyrThrlielieThr151015SerAsnLeulieAlaValGlyGlyAlaSerLeulieLeuAlaProAla202530lieThrG:lyTyrVa:[LeuHisTrpAsnlieAlaLeuSerThrlieTrp354045GlyValSerAla丁yrGlyliePheValPheGlyPhePheLeuAlaGin505560ValLeuPheSerGluLeuAsnArgLysArgLeuArgLysTrplieSer65707580LeuArgProLysGlyTrpAsnAspValArgLeuAlaVallielieAla859095GlyTyrArgGluAspProTyrMetPheGinLysCysLeuGluSerVa:[100105110ArgAspSerAspTyrGlyAsnValAlaArgLeulieCysVallieAsp115120125GlyAspGluAspAspAspMetArgMetAlaAlaValTyrLysAlalie130135140TyrAsnAspAsnlieLy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