專利名稱：測定煙草中p-香豆酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草的種植與栽培，具體來說，涉及測定煙草中P-香豆酸含量的方法。
背景技術(shù)：
p_香豆酸,又稱對輕基肉桂酸，即3-(4-輕基苯基)-2丙烯酸(口-辦￡//'<0^<^/7/7<3 /<^acid-,p-Coumaric acid),是植物次生代謝物質(zhì)，多以束縛形式存在，一般以酯鍵、醚鍵和其他化合物連接在一起，它與對逆境的抗性以及作物的特色形成等生理活動有著密切的關(guān)系。煙草中P-香豆酸是苯丙烷代謝途徑的中間產(chǎn)物，也是木質(zhì)素合成途徑代謝產(chǎn)物。因此，測定煙草中的P-香豆酸含量對于判斷煙草的質(zhì)量和風(fēng)格特征有著重要的意義。經(jīng)過檢索，中國專利數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于煙草中P-香豆酸測定方法的專利，而現(xiàn)有的技術(shù)文獻(xiàn)也沒有相關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供測定煙草中P-香豆酸含量的方法，以為探明煙葉特色形成提供一些理論支持。本發(fā)明提供的測定煙草中P-香豆酸含量的方法包括以下步驟:
第一步制備P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品
準(zhǔn)確稱取P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；
第二步制備供試樣品溶液
(O鮮煙葉樣品制備:液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重(無水分)，再將其研磨成粉，備用；
(2)烤后煙葉樣品制備:烤后煙葉粉碎過40目篩備用。(3)提取P-香豆酸:取煙葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾后加入3mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(體積比)萃取5次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動相定容后過0.22 μ m的濾膜后進(jìn)樣；
第三步測定P-香豆酸含量
分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出P-香豆酸含量。上述P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，純度彡98% ;上述乙腈為天地公司生產(chǎn)的色譜純試劑，乙酸為Fisher公司生產(chǎn)的色譜純試劑，氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉、乙醚、乙酸乙酯為國產(chǎn)分析純。上述檢測煙葉色譜的色譜條件是:色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱(4.6mmX250mm，5μπι);流動相為A (含2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，梯度洗脫，柱溫35°C，流速1.0mL.mirT1，檢測波長310nm,進(jìn)樣量2 μ L。上述各步驟所用的儀器設(shè)備是:Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，Waters2996 二極陣列管檢測器(DAD)檢測，Empower色譜工作站,萬分之一電子天平,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空泵、磁力攪拌器等。本發(fā)明的測定煙草中P-香豆酸含量的方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重復(fù)性好、使用有機(jī)試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)，可用于煙草鮮煙葉和烤后煙葉中P-香豆酸含量的測定。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)品與煙葉樣品HPLC 圖2為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3為標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。
具體實(shí)施例方式通過以下具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1測定方法實(shí)施例
首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:準(zhǔn)確稱取P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸I mL用乙臆定各至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液,備用；
接著制備供試樣品溶液:
(1)制備鮮煙葉樣品:液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重(無水分)，再將其研磨成粉，備用；
(2)烤后煙葉樣品制備:烤后煙葉粉碎過40目篩，備用；
(3)提取P-香豆酸:取煙葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾后加入3mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(V: V)萃取5次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動相定容后過0.22μ m的濾膜后進(jìn)樣；
最后進(jìn)行P-香豆酸含量的測定:分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液配成濃度分別為0.5、1、2、3、5、10、20,30,50 μ m/mL的溶液取2 μ L注入超高效液相色譜儀，根據(jù)色譜圖中峰面積計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出P-香豆酸含量；
其中，所述色譜條件為:色譜柱Waters C18色譜柱(4.6_X 250mm, 5 μ m);流動相A(含
2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，柱溫350C，流速1.0mL.min—1，檢測波長310nm,進(jìn)樣量2 μ L。梯度條件:0-40min5%B — 30%B ;40_50min 30%B — 5%B。實(shí)施例2線性關(guān)系考察
分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1、2、3、5、10、20、30、50 μ L，按實(shí)施例1中色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積。以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計算，得出P-香豆酸的回歸方程為 y=l.48 X IO4X-L 45X 103，R2=0.9993，線性范圍為 0.647 52.230μ g/mL。精密度試驗(yàn):精密吸取供試樣品溶液按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10次，進(jìn)樣量2 μ L，記錄色譜圖，測得P-香豆酸峰面積的RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，按供試品制備方法平行6次樣品，連續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μ L，記錄色譜圖，計算P-香豆酸含量的的RSD為4.76%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試樣品溶液，在0，4，12，24h進(jìn)樣，在上述色譜條件下測定，P-香豆酸峰面積的RSD為0.31%,結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加標(biāo)回收試驗(yàn):稱取已知量的煙草樣品0.3g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾后加入3moI/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，分別加入對照品，加入的對照品分另Ij為樣品中P-香豆酸含量的0.8、1.0和1.2倍)，然后分別用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(體積比)萃取5次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動相定容后過0.22 μ m的濾膜后，在上述色譜條件下測定，計算回收率，結(jié)果P-香豆酸平均回收率為99.2%。實(shí)施例3 檢測波長的選擇
在對供試樣品溶液進(jìn)行色譜條件摸索時，在19(T400nm進(jìn)行全波長掃描，其中在233和324nm處有最大吸收,但是在320nm處基線噪音影響較大,其中在310nm處分離度可以到達(dá)到指紋圖譜要求的標(biāo)準(zhǔn)，因此選310nm為最大檢測波長。實(shí)施例4流動相選擇
本試驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈-0.05%乙酸水溶液和乙腈-2.5%乙酸水溶液3中不同的梯度洗脫溶劑系統(tǒng)，以乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脫溶劑系統(tǒng)所得圖譜的峰形較好、分離度大，所以選用乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脫溶劑系統(tǒng)為本試驗(yàn)的流動相系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.測定煙草中P-香豆酸含量的方法，其特征包括: 第一步制備P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品 準(zhǔn)確稱取P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用； 第二步制備供試樣品溶液 (1)制備鮮煙葉樣品:液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重即無水分時，再將其研磨成粉，備用； (2)制備烤后煙葉樣品:烤后煙葉粉碎過40目篩備用； (3)提取P-香豆酸:取煙葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾后加入3mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用20mL體積比為1:1的乙醚/乙酸乙酯萃取5次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動相定容后過0.22 μ m的濾膜后進(jìn)樣； 第三步測定P-香豆酸含量 分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出P-香豆酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度>99%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測煙葉色譜的色譜條件是:色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱，規(guī)格為4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流動相A為含2.5%乙酸的水-B為乙腈，梯度洗脫，柱溫35°C，流速1.0mL.min—1，檢測波長310nm，進(jìn)樣量2 μ L。
全文摘要
本發(fā)明公開了測定煙葉中p-香豆酸含量的方法，該方法包括第一步，制備p-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確稱取p-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1mL用乙腈定容至10mL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；第二步，制備供試樣品溶液，包括制備鮮煙葉樣品、制備烤后煙葉樣品和提取p-香豆酸；第三步，測定p-香豆酸含量分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出p-香豆酸含量。本發(fā)明的方法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重復(fù)性好、測定快速等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于煙草鮮煙葉和烤后煙葉中p-香豆酸含量的測定。
文檔編號G01N30/02GK103149281SQ20121025638
公開日2013年6月12日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者趙會納, 雷波, 張捷, 任竹, 丁福章, 羅寶昌 申請人:貴州省煙草科學(xué)研究所