專利名稱：測(cè)定煙草中咖啡酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草的種植與栽培，具體來說，涉及測(cè)定煙草中咖啡酸含量的方法。
背景技術(shù)：
咖啡酸，又名3，4- 二羥基肉桂酸或3，4- 二羥基苯丙烯酸(3，4-dihydroxy-cinnamic acid),黃色結(jié)晶,是煙草中苯丙燒代謝途徑的中間產(chǎn)物,也是木質(zhì)素合成途徑代謝產(chǎn)物，主要以葡萄糖苷和酯的形式存在，是煙草中的酚類物質(zhì)。煙草酚類化合物是產(chǎn)生煙草香氣的重要成分之一，不僅直接影響煙葉顏色，對(duì)煙氣質(zhì)量 和香吃味也有間接影響，其降解產(chǎn)物還可以改善煙草制品的吸味，是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)。因此，測(cè)定煙草中的咖啡酸含量對(duì)于判斷煙葉的質(zhì)量和風(fēng)格特征有著重要的意義。經(jīng)過檢索，中國(guó)專利數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于煙草中咖啡酸測(cè)定方法的專利，而現(xiàn)有的技術(shù)文獻(xiàn)也鮮有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供測(cè)定煙草中咖啡酸含量的方法，以為探明煙葉特色形成提供一些理論支持。本發(fā)明提供的測(cè)定煙草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色譜法測(cè)定煙草中咖啡酸含量，包括以下步驟
第一步制備咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品
準(zhǔn)確稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；
第二步制備供試樣品溶液
(1)制備鮮煙葉樣品液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重(無水分)，再將其研磨成粉，備用；
(2)制備烤后煙葉樣品烤后煙葉粉碎過40目篩，備用；
(3)提取咖啡酸取鮮煙葉粉末0.6g或干煙葉粉末0. 05g，精密稱定，加入30mL的4mol/L的NaOH在搖床上震搖4h，抽濾后加入4mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動(dòng)相定容后過0. 22 m的濾膜后進(jìn)樣；
第三步測(cè)定咖啡酸含量
分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測(cè)煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出咖啡酸含量。上述咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司，純度彡98% ;上述乙腈、乙酸為天地公司生產(chǎn)的色譜純?cè)噭?，氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉、乙醚、乙酸乙酯為國(guó)產(chǎn)分析純。上述檢測(cè)煙葉色譜的色譜條件是色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 u m);流動(dòng)相A為水，B為乙腈，C為10%乙酸水溶液，梯度洗脫，柱溫35°C，流速I. OmL. mirT1，檢測(cè)波長(zhǎng)310nm,進(jìn)樣量2 y L。上述梯度洗脫條件如下
權(quán)利要求
1.測(cè)定煙葉中P-香豆酸咖啡酸含量的方法，其特征是采用超高效液相色譜法測(cè)定煙葉中咖啡酸含量，包括以下步驟 第一步制備咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品 準(zhǔn)確稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用； 第二步制備供試樣品溶液 (1)制備鮮煙葉樣品液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重即無水分時(shí)，再將其研磨成粉，備用； (2)制備烤后煙葉樣品烤后煙葉粉碎過40目篩，備用； (3)提取咖啡酸取鮮煙葉粉末0.6g或干烤后煙葉粉末0. 05g，精密稱定，加入30mL的4mol/L的NaOH在搖床上震搖4h，抽濾后加入64mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動(dòng)相定容后過0. 22 m的濾膜后進(jìn)樣； 第三步測(cè)定咖啡酸含量 分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測(cè)煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出咖啡酸含量； 包括 (1)制備P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品 準(zhǔn)確稱取p-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用； (2)制備供試樣品溶液 (1)鮮煙葉樣品制備液氮取樣，然后將鮮煙樣放入冷凍干燥儀中冷凍干燥直至恒重(無水分)，再將其研磨成粉備用； (2)烤后煙葉樣品制備烤后煙葉粉碎過40目篩備用； (3)取煙葉粉末0.6g，精密稱定，加入30mL的3mol/L的NaOH攪拌提取4h，抽濾后加入3mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2，然后分別用2OmL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(v: v)萃取5次，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后用流動(dòng)相定容后過0. 22 y m的濾膜后進(jìn)樣； 取事先干燥、粉碎的煙葉粉末0. 5g，精密稱定，加入30mL的80%的甲醇超聲萃取lh，然后離心取上清液濃縮至5mL，過0. 22 y m有機(jī)濾膜后進(jìn)樣； (3)含量測(cè)定 分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，檢測(cè)煙葉色譜，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出P-香豆酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述P-香豆酸咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度≥989%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)煙葉色譜的色譜條件是色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱,柱的大小為4. 6mmX 250mm, 5 u m ;流動(dòng)相A為水，B為乙腈,梯度洗脫，柱溫35 0C，流速I. OmL. min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)310nm,進(jìn)樣量2uL； 色譜柱用Waters C18 0DS2色譜柱(4. 6_X 250mm, 5 y m);流動(dòng)相為A (含2. 5%乙酸的水)-B (乙腈)，梯度洗脫，柱溫35 0C，流速I. OmL. min_l，檢測(cè)波長(zhǎng)310nm,進(jìn)樣量2uL0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述梯度洗脫條件如下
全文摘要
本發(fā)明公開了測(cè)定煙草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色譜法測(cè)定煙草中咖啡酸含量，該方法是第一步，制備咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液；第二步，制備供試樣品溶液，包括(1)制備鮮煙葉樣品，(2)制備烤后煙葉樣品，煙葉粉碎過40目篩，(3)提取咖啡酸；最后測(cè)定咖啡酸含量分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入超高效液相色譜儀，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出咖啡酸含量。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重復(fù)性好、測(cè)定快速等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于煙草鮮煙葉和烤后煙葉中咖啡酸含量的測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102749399SQ201210257078
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者丁福章, 任竹, 張捷, 潘文杰, 羅寶昌, 趙會(huì)納, 雷波 申請(qǐng)人:貴州省煙草科學(xué)研究所