河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5e7及其輕、重鏈可變區(qū)基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及河豚毒素中和性單抗5E7雜交瘤細(xì)胞及輕鏈和重鏈可變區(qū)基因和由所述基因編碼的多肽和蛋白質(zhì)，以及所述基因、多肽和蛋白質(zhì)在疫苗研制、及制備用于診斷和治療河豚毒素或免疫毒素中毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人用一套設(shè)計(jì)的引物從河豚毒素中和性單抗5E7雜交瘤細(xì)胞克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)?；谏鲜鲆芽寺〉降暮与喽舅刂泻蛦慰箍勺儏^(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)多種生物活性分子，制備疫苗及用于河豚毒素檢測(cè)、河豚毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物。
【專利說(shuō)明】河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5E7及其輕、重鏈可變區(qū)基因與應(yīng)用
[0001]應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一株河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞(命名為5E7)的制備，具體涉及河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建和單抗編碼基因的釣取，還涉及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]河豚毒素(Tetoodo toxin, TTX)是ー種重要的海洋生物毒素，廣泛存在于海洋生物和陸棲等眾多生物中，并可通過(guò)食物鏈富集等途徑污染其它水產(chǎn)品。TTX中毒屢有發(fā)生，死亡率達(dá)40%以上。作為ー種潛在的軍用毒劑，TTX已被列入國(guó)際生物安全公約清単。目前針對(duì)TTX中毒，國(guó)內(nèi)外還沒有適用于人體的專用特效藥，因此迫切需要建立和發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)和防護(hù)用品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要內(nèi)容有以下4個(gè)。
[0005]1.抗河豚毒素單抗雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
[0006]1.1免疫抗原的制備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 15mg溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到15mg KLH/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應(yīng)1.5小時(shí)，用0.01M PBS 4°C進(jìn)行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白 ，檢測(cè)蛋白定量，既得TTX-KLH復(fù)合物即免疫原，分裝10支，Img/支，-20°C以下保存。
[0007]1.2檢測(cè)用抗原的制備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) IOmg溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到IOmg BSA/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應(yīng)1.5小時(shí)，用0.01M PBS 4°C進(jìn)行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，既得TTX-BSA復(fù)合物即免疫原，分裝20支，0.4mg/支，-20°C以下保存。
[0008]1.3抗TTX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建、篩選和鑒定:選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，分別用12.g TTX-KLH對(duì)小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射免疫，每三周免疫一次，共免疫4次，常規(guī)方法融合。用TTX-BSA間接ELISA篩選，陽(yáng)性細(xì)胞反復(fù)亞克隆直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽(yáng)性。于Balb/c小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水，ProteinA SepharoseCL4B 親和柱純化，SDS-PAG、間接 ELISA 鑒定。
[0009]2.抗TTX單抗的中和活性測(cè)定:選用4-6周齡的昆明小鼠100只，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為lmg/mL，用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)TTX的LD50。先將lmg/mL的單抗(對(duì)照組用蒸餾水)注入小鼠腹腔，然后注入1.62 u g/ml TTX溶液，動(dòng)態(tài)觀察并記錄小鼠的生存狀態(tài)2周。
[0010]3.雜交瘤細(xì)胞5E7輕、重鏈基因的釣取:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中和性單抗5E7細(xì)胞，用TRIzol提取RNA (圖1)，經(jīng)RT-PCR，用兩對(duì)特異性引物PHsl, PHs2 ;PLsl、PLs2釣取抗體的輕重鏈基因(圖2)。常規(guī)法連接入PGEM Teasy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109，于固體LB平板37°C孵箱12~18小時(shí)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。
[0011]4.單抗5E7輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定:用www.expasy.0rg在線軟件將核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1.兩株TTX單抗的檢測(cè)結(jié)果 [0013]圖2.TTX單抗雜交瘤細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果
[0014]圖3.TTX中和性單抗5E7雜交瘤細(xì)胞RNA提取結(jié)果
[0015]圖4.TTX中和性單抗5E7雜交瘤細(xì)胞輕重鏈基因的PCR結(jié)果I為輕鏈基因；2為DL2000 ；3為重鏈基因，基因大小大約為660bp。
[0016]【具體實(shí)施方式】通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)ー步說(shuō)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例ー抗TTX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
[0018]1.免疫抗原的制備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 15mg溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到15mg KLH/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)pH值到7.0，冰浴下加入I %戊二醛3ml，室溫反應(yīng)1.5小時(shí)，用0.01M PBS 4°C進(jìn)行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，檢測(cè)蛋白定量，既得TTX-KLH復(fù)合物即免疫原，分裝10支，Img/支，-20°C以下保存。
[0019]2.檢測(cè)用抗原的制備:河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) IOmg溶于pH5.0的檸檬酸緩沖液中，將此溶液緩慢滴加到IOmg BSA/0.01M PBS溶液中，邊加邊攪拌，調(diào)pH值到7.0，冰浴下加入1%戊二醛3ml，室溫反應(yīng)1.5小時(shí)，用0.01M PBS 4°C進(jìn)行透析兩天，期間多次換液，離心去除變性蛋白，既得TTX-BSA復(fù)合物即免疫原，分裝20支，0.4mg/支，-20°C以下保存。
[0020]3.Balb/c小鼠免疫選用4_6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，分別用12.5 y gTTX-KLH對(duì)小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射免疫，第一針加福氏完全佐劑(Sigma)，第2針加福氏不完全佐劑(Sigma)，每三周免疫一次，共免疫4次，第4次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況，融合前3天，以12.5 Ug TTX-KLH腹腔加強(qiáng)免疫一次，第3天融合。
[0021]4.細(xì)胞融合將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無(wú)菌摘取小鼠脾細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。具體方法:①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75%酒精浸泡3min，無(wú)菌取出脾臟，用200目鋼網(wǎng)研磨單個(gè)細(xì)胞懸液，無(wú)血清RPMI 1640 (Gibco)洗兩次并記數(shù)！②收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞(ATCC引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存)，用無(wú)血清RPMI 1640洗兩次并記數(shù)；③按SP2/0細(xì)胞:脾細(xì)胞=I: 5的比例混合兩種細(xì)胞，用RPMI 1640洗I次，棄盡上清，輕輕將細(xì)胞打散；@在Imin時(shí)間里緩慢加入Iml 50% PEG (MW 1500)溶液，置37°C水浴Imin ;?在 lmin、2min、2min、5min 時(shí)間內(nèi)加無(wú)血清 RPMI16401ml、5ml、10ml、IOml ;? 800r/min離心7min，棄上清，盡可能輕輕將細(xì)胞懸起；@加含20% FCS的HAT (Sigma)-RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X 106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞(I X IO4細(xì)胞/孔)96孔培養(yǎng)板(Gibco)中，IOOiU/孔，37°C 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。[0022]5.間接ELISA篩選抗河豚毒素單抗雜交瘤細(xì)胞純化后TTX單抗用TTX-BSA以40 u g/ml包被酶標(biāo)板，于4°C過(guò)夜并封閉。依次加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(37°C lh，PBST洗板 4 次)，及 I: 500 稀釋的 50 u L HRP-GAM(37°C 45min，PBST 洗板 4 次)。以 TMB (Sigma)底物顯色后，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定A值(圖1)。
[0023]6.雜交瘤細(xì)胞克隆化間接ELISA法篩選為陽(yáng)性的細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽(yáng)性。雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法:(I)在克隆化的當(dāng)天或前I天制備滋養(yǎng)細(xì)胞:脫頸處理昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無(wú)菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mL 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用20%胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.lml。
(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細(xì)胞移至另ー無(wú)菌試管中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。(3)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。(4)將培養(yǎng)板置于5% C02，37°C孵箱中培養(yǎng)，5天左右在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。
[0024]7.雜交瘤細(xì)胞的染色體核型分析在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02 u g/mL,在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后收集細(xì)胞，經(jīng)低滲裂解(加入預(yù)溫至37°C的0.075MKCL 8mL,輕輕打勻，37 °C 30-40分鐘)、預(yù)固定(甲醇:冰醋酸=3: I新鮮配制，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理后用少量固定液制備細(xì)胞懸液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10% Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖
2.)。
[0025]8.雜交瘤細(xì)胞免疫球蛋白亞型的確定用羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細(xì)胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，證明5E7雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0026]通過(guò)本部分工作，篩選到河豚毒素單抗5E7。雜交瘤細(xì)胞5E7染色體平均數(shù)目為106條，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0027]實(shí)施例二抗TTX中和性單抗雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定
[0028]1.TTX對(duì)小鼠半數(shù)致死劑量LD50的確定選用4_6周齡的昆明小鼠100只，雌雄各半，將TTX用雙蒸水溶解，原液濃度為lmg/mL，用雙蒸水稀釋為g/ml。將2 y g/ml濃度的TTX 0.5ml分別注入10只昆明小鼠腹腔后，小鼠于30分鐘內(nèi)全部死亡；分別用g/ml,1.8 u g/ml,1.6 u g/ml,1.4 u g/ml,1.48 y g/ml、0 y g/ml 濃度的 TTX測(cè)得 TTX 的 LD50 為1.62 u g/ml,即 40.5 u g/kg。
[0029]2.抗TTX單抗的中和活性測(cè)定將lmg/mL的TTX單抗(對(duì)照組用蒸餾水)0.5ml與1.62 u g/ml TTX 0.5ml混合后注入小鼠腹腔，隨時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組(各10只)小鼠的狀況，24小時(shí)后通過(guò)不斷追加2 u g/ml TTX,每次0.2ml/只，每30分鐘觀察一次，直至對(duì)照組小鼠全部死亡，存活小鼠正常飼養(yǎng)，每天觀察一次，記錄生長(zhǎng)情況，觀察2周。測(cè)得當(dāng)對(duì)照組小鼠全部死亡時(shí)，即2LD50時(shí)，TTX單抗對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的保護(hù)率為50%。
[0030]3.動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體制備河豚毒素單抗5E7接種雜交瘤細(xì)胞前10天，先給Balb/c小鼠(さ，8~12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為4X 107ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7~10天后，可見小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心lOmin，收集上清，加等量甘油，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0031]通過(guò)本部分工作，獲得了命名為5E7的河豚毒素中和性單抗交瘤細(xì)胞，測(cè)得河豚毒素中和性單抗5E7對(duì)小鼠的LD50為40.5 ii g/kg。河豚毒素中和性單抗在小鼠注射2倍致死計(jì)量的河豚毒素后對(duì)一半數(shù)量小鼠具有保護(hù)作用。
[0032]實(shí)施例三河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5E7輕、重鏈基因的釣取
[0033]1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中和性單抗5E7細(xì)胞5X IO6-1O7個(gè)，離心去除上清，將細(xì)胞均勻彈起。加入lml TRIzol (Invitrogen)反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解,振蕩5分鐘后,加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-8°C 12000r/min，離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500 ill異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-8 0C 12000r/min離心10分鐘。75%こ醇洗滌沉淀，干燥后，用20 ill無(wú)RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖3)。
[0034]2.取含 I U g 總 RNA 的溶液，依次加入 AMV 5X 緩沖液 4u I, Oligo (dT) (500ng/U 1)0.5u 1,2.5mmol/L dNTP2 u 1，Rnasin (50U/u 1)0.5 u I，去離子水補(bǔ)至 20 u 1、反轉(zhuǎn)錄酶2-5U，42°C延伸I小時(shí)。95°C變性5分鐘，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。用2對(duì)特異性引物PHsl、PHal和PLs 1、PLal，在20iU PCR反應(yīng)體系中，分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 yl，Taq酶IOXbuffer 2111，上下游引物各1111，2.5臟01/1 dNTP I yl，加Taq酶1-2U，去離子水補(bǔ)至20iil。95°C變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為:94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共30個(gè)循環(huán)，72°C后 延伸10分鐘(圖4)。
[0035]3.用分離出欲回收的DNA片段，在長(zhǎng)波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55°C水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒(OMEGA生物科技公司)回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶緩沖液中按2:1的比例(摩爾比)和載體PGEM Teasy (Promega公司)混合后，加入0.5U的T4DNA連接酶(New England Biolabs)于16°C連接過(guò)夜，連接反應(yīng)的總體積為10 u L0
[0036]4.取連接液10 U 1，加入200 U I感受態(tài)細(xì)菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，迅速轉(zhuǎn)入冰浴2分鐘，加800 u I LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37°C恒溫?fù)u床，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速度搖動(dòng)45分鐘，4000r/min離心I分鐘，棄去800 U I上清，取沉淀涂布于含Amp (終濃度為100 u g/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37°C孵箱12~18小吋。
[0037]5.在上述平板中挑取單個(gè)克隆，接種于含氨卞青霉素(IOOii g/mL)的LB培養(yǎng)基中。37°C恒溫?fù)u床170rpm,震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，1000Orpm離心lmin，棄上清。將沉淀菌體重懸于IOOii L溶液I中，加新鮮配制的溶液II 200 u L,輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150 u L溶液III，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時(shí)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4°C，12000rpm離心5min，取上清加至另ーEppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酹,劇烈震蕩后，12000rpm離心5min,將上層水相移至一新管中。再加入500 ii L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無(wú)水こ醇混勻，于-20°C放置3h。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，用70%こ醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40 y L無(wú)菌雙蒸水溶解，進(jìn)行DNA測(cè)序分析。
[0038]6.使用的引物序列如下:
[0039]PHsl:5，-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3，22[0040]PHs2:5，-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3，22
[0041]PLsl:5，-CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA-3，32
[0042]PLal:5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3，34
[0043]通過(guò)本部分工作，構(gòu)建了河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5E7輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測(cè)序分析、序列比對(duì)為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)。
[0044]實(shí)施例四河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5E7輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定用WWW, expasy.0rR在線軟件將編碼河豚毒素中和性單抗雜交瘤細(xì)胞5E7輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDRl (SEQ ID N0.5)、CDR2 (SEQ IDN0.6)和CDR3 (SEQ ID N0.7)。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDRl (SEQ ID N0.8)、CDR2(SEQID N0.9)和 CDR3(SEQ ID N0.10)。
[0045]參考文獻(xiàn):
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【權(quán)利要求】
1.一種雜交瘤細(xì)胞，特征在于染色體平均數(shù)目為106條，分泌的免疫球蛋白亞類為IgGl0分泌的免疫球蛋白可特異性結(jié)合河豚毒素，并部分中和河豚毒素的體內(nèi)毒性作用。
2.ー種蛋白質(zhì)分子，特征在于具有如序列表中SEQ ID N0.3/或SEQ ID N0.4所示的序列。
3.一種重組蛋白質(zhì)分子或肽，其特征在于具有如序列表中SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQID N0.7/或 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10 所示的 CDR1、CER2、CDR3 序列。
4.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)編碼基因，特征在于具有如序列表中SEQID N0.1或SEQID N0.2所示的核甘酸序列。
5.權(quán)利要求所述的細(xì)胞、蛋白質(zhì)分子或肽，在制備河豚毒素檢測(cè)、疫苗研制、河豚毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物`中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK103589687SQ201210509474
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月3日
【發(fā)明者】郭建巍, 秦力維 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院