通過(guò)在釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)生可分泌抗體的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)在釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)生可分泌抗體的方法
[0001] 發(fā)明豐題 本發(fā)明涉及用于在釀酒酵母（cererisiae)細(xì)胞的表面上產(chǎn)生和非共 價(jià)表面呈遞抗體和衍生片段以及基于其的分子文庫(kù)的方法。表面呈遞的非共價(jià)方式使得可 能借助高通量篩選選擇特定變體和隨后所選結(jié)合分子可切換分泌至培養(yǎng)上清液用于生化 表征。
[0002] 本發(fā)明還涉及用于在酵母細(xì)胞的表面上呈遞抗體或抗體文庫(kù)和篩選這些文庫(kù)的 具有特別期望特性的免疫球蛋白的方法。
[0003] 發(fā)明背景 單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)從雜交瘤技術(shù)進(jìn)化，在其幫助下，可以以特異性方式產(chǎn)生具有 特定特異性和親和力的抗體。由其開(kāi)發(fā)的組合文庫(kù)，包括篩選和選擇方法，已經(jīng)發(fā)展成標(biāo)準(zhǔn) 工具，用于通常修飾蛋白的結(jié)合特性。
[0004] 用于生成和篩選抗體文庫(kù)的最普遍的技術(shù)曾經(jīng)是"噬菌體呈遞"方法，并且在一些 情況下仍然是"噬菌體呈遞"方法，其中特定目標(biāo)蛋白可以在噬菌體外殼蛋白上表達(dá)為融合 多肽，并且通過(guò)結(jié)合至固定或可溶性生物素化的配體而選擇。已經(jīng)以這種方式構(gòu)建的噬菌 體可被視為緊湊遺傳單元，其已經(jīng)在表型和基因型特性?xún)烧叻矫孀陨斫M合。抗體、抗體片 段、酶、DNA結(jié)合蛋白等上已經(jīng)非常成功地使用噬菌體呈遞。通過(guò)在稱(chēng)為"淘選"的過(guò)程中結(jié) 合至固定抗原選擇具有期望結(jié)合特性的抗體。洗出含有非特異性抗體的噬菌體，將結(jié)合的 噬菌體分離且在大腸桿菌中擴(kuò)增。該設(shè)置已用于生成大量抗原特異性抗體。盡管如此，噬 菌體呈遞技術(shù)具有一些基本缺陷和困難，其限制了其用途，特別是在真核蛋白的產(chǎn)生中。因 此，例如，可以分離非常高親和力的抗體，并且僅困難地通過(guò)"淘選"進(jìn)一步處理。此外，可 以影響抗體的特異性和親和力的翻譯后修飾，諸如例如糖基化，用噬菌體呈遞方法是不可 能的。
[0005] -種替代方案是使用低等真核系統(tǒng)，諸如酵母。與在絲狀噬菌體的情況下相比， B細(xì)胞呈遞抗體和酵母細(xì)胞呈遞抗體之間的結(jié)構(gòu)相似性使得更接近類(lèi)似于體內(nèi)"親和力成 熟"。因?yàn)榫唧w地真核細(xì)胞諸如酵母能夠產(chǎn)生糖基化蛋白，而絲狀噬菌體不能做到這一點(diǎn)， 來(lái)自真核宿主細(xì)胞的單克隆抗體應(yīng)當(dāng)具有比來(lái)自噬菌體的抗體更類(lèi)似于人或哺乳動(dòng)物的 特性。此外，在酵母中克隆、表達(dá)和修飾抗體特別已經(jīng)證明在方法和實(shí)用性方面是有效和簡(jiǎn) 單的。US 6, 699, 658描述了，例如，酵母細(xì)胞表面呈遞方法，在其幫助下，組合抗體文庫(kù)的篩 選和生產(chǎn)已經(jīng)變得可能。所述"酵母表面呈遞"技術(shù)基于用表達(dá)融合至酵母細(xì)胞壁蛋白的 免疫球蛋白的載體轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞，采用誘變以便生成免疫球蛋白變體的多樣性且以便然后 根據(jù)期望表型特性選擇這些細(xì)胞。該技術(shù)由Boder和Wittrup在1997年建立。他們首次 成功地在酵母細(xì)胞的表面上功能呈遞組合文庫(kù)的scFv片段，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選它們，并 且分離對(duì)于抗原具有增加親和力的scFv片段。基因型和表型的穩(wěn)定偶聯(lián)使其變得可能，因 為scFv片段被呈遞為具有酵母固有的細(xì)胞壁蛋白的融合蛋白。據(jù)推測(cè)，通過(guò)使用基于酵母 的呈遞技術(shù)實(shí)現(xiàn)的最重要成就是熒光激活的細(xì)胞分選（FACS)的直接適用性，這在有效篩 選大變體文庫(kù)中是決定性的。穩(wěn)定的基因型-表型偶聯(lián)通過(guò)異源蛋白與釀酒酵母的外細(xì) 胞壁的蛋白的融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。由此實(shí)現(xiàn)的蛋白暴露是與抗原相互作用的前提條件。
[0006] 然而，如Wittrup和Boder開(kāi)發(fā)的剛剛描述的酵母表面呈遞特別具有一些實(shí)際缺 點(diǎn)。一個(gè)缺點(diǎn)是，例如，各種表達(dá)的蛋白無(wú)法獲得，或者只能用相同的酵母細(xì)胞不令人滿意 地獲得。此外，通過(guò)Wittrup的方法，期望的免疫球蛋白共價(jià)結(jié)合至細(xì)胞壁蛋白，并且必須 通過(guò)另外的方法步驟進(jìn)行分離。
[0007] W0 2010/005863描述了基于巴斯德畢赤酵母種的酵母細(xì)胞的相應(yīng)酵母表面呈遞 系統(tǒng)，其中免疫球蛋白非共價(jià)地結(jié)合至蛋白A的ZZ結(jié)構(gòu)域，其中當(dāng)用于表達(dá)所述蛋白的相 應(yīng)多種啟動(dòng)子以正確的時(shí)間順序開(kāi)啟或關(guān)閉時(shí)，包含細(xì)胞壁蛋白凝集素或其亞單位和ZZ 結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白的融合蛋白僅在酵母細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)且分泌，以便被呈遞在細(xì)胞表面 上。
[0008] 發(fā)明概沐 本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)用于在酵母種釀酒酵母細(xì)胞的表面上非共價(jià)表面呈遞抗體和衍生片 段以及基于其的分子文庫(kù)的方法。表面呈遞的非共價(jià)方式意欲使得可能借助高通量篩選選 擇特定變體和隨后所選結(jié)合分子可切換分泌至培養(yǎng)上清液用于生化表征。
[0009] 焦點(diǎn)是選擇和生產(chǎn)的成功組合，其節(jié)約時(shí)間地省略亞克隆和重新格式化步驟，諸 如在已知相當(dāng)方法中必需的步驟，諸如例如噬菌體上的蛋白表面呈遞。該組合導(dǎo)致抗體的 活性成分發(fā)現(xiàn)中的后續(xù)過(guò)程的簡(jiǎn)化和加速。通過(guò)本身已知的使用Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域、優(yōu)選來(lái)自 金黃色葡萄球菌蛋白A的ZZ結(jié)構(gòu)域作為表面呈遞的介體，可以在酵母細(xì)胞上成功地呈遞抗 體、生物活性抗體片段和抗體結(jié)構(gòu)域，諸如，例如，VHH-Fc融合蛋白（由兩條蛋白鏈組成）。
[0010] 令人驚訝地，通過(guò)使用酵母釀酒酵母作為宿主生物體，在表面呈遞過(guò)程中已經(jīng)選 擇蛋白的正確折疊、分泌和穩(wěn)定性，因?yàn)樽鳛檎婧松?，該酵母在蛋白合成過(guò)程中具有質(zhì)量 控制的機(jī)制。通過(guò)此處呈現(xiàn)的方法，可以在酵母細(xì)胞的表面上以對(duì)其用途特異性的最終形 式呈遞VHH-Fc融合蛋白和更復(fù)雜的蛋白，諸如整個(gè)抗體，并且以這種方式，能夠使用蛋白 工程改造的方法。其后，所選克隆可以直接用于產(chǎn)生蛋白。
[0011] 因此，本發(fā)明提供用于通過(guò)表達(dá)、分泌和將其呈遞在酵母細(xì)胞的表面上而產(chǎn)生多 種IgG分子，諸如抗體、生物活性抗體片段或具有特定特性的抗體結(jié)構(gòu)域的方法，其中根據(jù) 本發(fā)明的方法包括以下步驟： (a) 提供酵母種釀酒酵母的宿主細(xì)胞，其已經(jīng)用合適質(zhì)粒的形式的第一和第二核酸分 子轉(zhuǎn)染，其中所述第一核酸分子編碼融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含細(xì)胞表面錨定蛋 白、Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域和可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，所述可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子根據(jù)培養(yǎng)條件控制所述融合蛋白的 表達(dá)，并且所述第二核酸分子編碼所述抗體群體，所述抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域呈其輕鏈和 重鏈的形式，并且在永久活性啟動(dòng)子的控制下， (b) 通過(guò)在培養(yǎng)基中存在具有> 5, 000的分子量的聚乙二醇（PEG)的情況下在酵母細(xì) 胞中同時(shí)共表達(dá)多種抗體、抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域而表達(dá)所述融合蛋白，其中所述IgG分 子以及融合蛋白以可溶性形式從酵母細(xì)胞分泌， (c) 在所述酵母細(xì)胞的表面上呈遞多種抗體、抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域，其以非共價(jià)形 式結(jié)合至表達(dá)的錨定至細(xì)胞表面的融合蛋白的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域， (d) 根據(jù)結(jié)合至Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多種抗體、生物活性抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域的期望 的不同的表型或結(jié)合特性，在結(jié)合至融合蛋白或Ig分子或其中含有的檢測(cè)標(biāo)記的幫助下 選擇和分離酵母細(xì)胞， (e) 在不允許或基本不允許進(jìn)一步表達(dá)融合蛋白的培養(yǎng)條件下在特定選擇的酵母細(xì) 胞群體中表達(dá)多種抗體、生物活性抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域，和 (f) 從培養(yǎng)基分離具有所選表型或結(jié)合特性的多種抗體。
[0012] 與此相反，在根據(jù)W0 2010/0058863的方法中，在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)本身相 同的融合蛋白和免疫球蛋白不同時(shí)進(jìn)行：反而，該系統(tǒng)只有當(dāng)通過(guò)活化負(fù)責(zé)的啟動(dòng)子誘導(dǎo) 和操作細(xì)胞表面"捕獲"分子的表達(dá)才在一定程度上有效地發(fā)揮作用，而沒(méi)有同時(shí)發(fā)生免疫 球蛋白的輕鏈和重鏈的值得注意的表達(dá)。在捕獲分子的表達(dá)已經(jīng)由于經(jīng)由可調(diào)控啟動(dòng)子抑 制而停止之后，這僅在第二步驟中實(shí)現(xiàn)。
[0013] 令人驚訝地，這在根據(jù)本發(fā)明的方法中是不必要的。盡管初始活化Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的啟動(dòng)子，Ig分子的表達(dá)已經(jīng)可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在酵母細(xì)胞中充分表 達(dá)和分泌時(shí)，為了最終結(jié)合至細(xì)胞表面，且同時(shí)共表達(dá)和共分泌Ig，在Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟 動(dòng)子已經(jīng)關(guān)閉后，Ig分子的表達(dá)繼續(xù)發(fā)生，并且這些在其分泌后非共價(jià)結(jié)合至游離的Fc結(jié) 合結(jié)構(gòu)域。這完全更令人驚訝，因?yàn)樵赪0 2010/0058863中，原則上采用相同或非常相似的 細(xì)胞壁表面蛋白（作為錨定蛋白）和相同的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ZZ結(jié)構(gòu)域）。根據(jù)本發(fā)明的 方法中的差異因此似乎在于不同的酵母種（釀酒酵母相比于巴斯德畢赤酵母）和使用較高 分子量聚乙二醇。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用具有> 5, 000、特別是> 6, 000、特別是> 7, 000且優(yōu)選〉 8, 000的分子量的PEG導(dǎo)致細(xì)胞表面上遇到的Ig分子的顯著增加，其據(jù)推測(cè)伴隨由PEG增 加的分泌。令人驚訝地，如果省略PEG或采用具有較低分子量（〈5000,特別是〈7000,特別 是〈8000)的PEG，則在細(xì)胞表面上觀察到不足數(shù)目的結(jié)合的Ig分子，這可能也解釋與TO 2010/005863的方法的差異。通常，在釀酒酵母上特別是整個(gè)Ig分子的分泌和表面呈遞迄 今為止已被證明是復(fù)雜的。
[0014] 與來(lái)自W0 2010/005863的方法相反，在根據(jù)本發(fā)明的本方法中，僅蛋白（即細(xì)胞 壁蛋白和Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白）的表達(dá)已被調(diào)節(jié)，優(yōu)選通過(guò)GAL1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，而IgG 分子，例如VHH-Fc融合蛋白永久表達(dá)，也就是組成型表達(dá)，無(wú)論包含F(xiàn)c結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其它 蛋白的表達(dá)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，凝集素，特別是a_凝集素，被用作細(xì)胞壁錨定蛋白。這與其亞單位 agalp直接結(jié)合至細(xì)胞壁。在酵母細(xì)胞中表達(dá)且經(jīng)由二硫鍵結(jié)合至agalp的根據(jù)本發(fā)明的 融合蛋白包含凝集素的第二亞單位，aga2p，其C末端結(jié)合至來(lái)自蛋白A的ZZ結(jié)構(gòu)域。 [0016] 因此，本發(fā)明還提供了相應(yīng)的方法，其中細(xì)胞表面錨定蛋白是a _凝集素或a _凝 集素，且融合蛋白包含aga2p和Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選來(lái)自金黃色葡萄球菌的蛋白A的ZZ結(jié) 構(gòu)域。
[0017] 因此，本發(fā)明特別提供其中ZZ結(jié)構(gòu)域和aga2p的融合蛋白的表達(dá)（和分泌）受 GAL1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的方法。
[0018] 本發(fā)明還特別提供其中抗體、抗體片段或抗體結(jié)構(gòu)域的表達(dá)（和分泌）在GAPDH 啟動(dòng)子的控制下的方法，其中表達(dá)組成型發(fā)生，用于表達(dá)ZZ結(jié)構(gòu)域和aga2p亞單位的融合 蛋白。
[0019] 本發(fā)明還提供了相應(yīng)的方法，其中在表達(dá)/分泌中，在表達(dá)培養(yǎng)基中采用具有〉 5, 000、特別是> 7, 000 - 8, 000的分子量的PEG，優(yōu)選PEG8000。
[0020] 最后，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生用于生成和選擇具有所選表型或結(jié)合特性的整個(gè)抗 體、Fab片段或其它生物活性抗體結(jié)構(gòu)域的抗體文庫(kù)的相應(yīng)方法。
[0021] 發(fā)明詳沐 通常，根據(jù)本發(fā)明的方法中采用的免疫球蛋白是IgG、IgA、IgE或IgM分子，但優(yōu)選IgG 分子，其包括 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染（transf iz ieren) "、" 轉(zhuǎn)染（Transf ection) "、" 轉(zhuǎn)化 (transformieren) "或"轉(zhuǎn)化（Transformation) "同義使用，并且根據(jù)本發(fā)明意指將異源核 酸（DNA/RNA)引入進(jìn)真核細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，抗體片段被理解為意指優(yōu)選的單克隆抗體的功能部分，諸如Fc、Fab、 Fab'、Fv、F(ab'）2、 SCFv。根據(jù)本發(fā)明，相應(yīng)的生物活性片段被理解為意指能夠結(jié)合抗原的 那些抗體部分，諸如Fab、Fab'、Fv、F (ab'）2和scFv。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c結(jié)合結(jié)構(gòu)域被理解為意指分子或分子的部分，優(yōu)選蛋白或多肽，其 能夠共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合抗體的Fc部分或其區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)c結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選非共價(jià) 結(jié)合抗體或免疫球蛋白的Fc部分。
[0025] 本申請(qǐng)中呈現(xiàn)的用于酵母細(xì)胞上的非共價(jià)表面呈遞的方法已經(jīng)成功地用于 VHH-Fc蛋白和IgG分子的表面呈遞。ZZ結(jié)構(gòu)域和Fc部分之間的非共價(jià)相互作用的穩(wěn)定性 保證足夠穩(wěn)定的基因型-表型偶聯(lián)，并且以這種方式使得能夠?qū)⑺龇椒ㄓ糜谠诓煌?合物內(nèi)富集目標(biāo)細(xì)胞。所述方法的將來(lái)用途在于，例如，在蛋白工程領(lǐng)域中篩選IgG分子或 多種Fc融合蛋白的文庫(kù)用于鑒定具有期望特性的蛋白。使用已知含有滿足期望的功能要 求的變體的文庫(kù)包含在此處是有利的。由于所述方法在表面呈遞過(guò)程中可以描繪VHH結(jié)構(gòu) 域的親和力的甚至微小的差異，所以該方法特別適合于抗體的親和力成熟與隨后的可溶性 生產(chǎn)和生物物理表征。
[0026] 為了簡(jiǎn)化所述方法，使用可以嘗試使用替代錨定蛋白用于表面呈遞ZZ結(jié)構(gòu)域，因 為作為結(jié)果，所述使用不再限于使用酵母菌株EBY100。來(lái)自釀酒酵母的許多細(xì)胞壁蛋白原 則上適合于表面呈遞異源蛋白。文獻(xiàn)中為此描述了許多實(shí)施例 93' "。使用不同的錨定蛋白 使得可能獨(dú)立選擇表達(dá)菌株，因?yàn)椴辉俦仨毷褂镁哂蠥gal表達(dá)盒的染色體整合的菌株，諸 如EBY100。這額外打開(kāi)了生成和使用適合于異源蛋白的特定需求的表達(dá)菌株的可能性。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建顯示于圖36至39。這些通常只提供質(zhì)粒和質(zhì)粒構(gòu)建的實(shí) 例或優(yōu)選實(shí)例，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在任何時(shí)間替換為其它或其變體，只要采用本 發(fā)明必需的相應(yīng)的DNA序列且啟動(dòng)期望的功能。
[0028] 此外，以穩(wěn)定方式將ZZ結(jié)構(gòu)域整合至酵母基因組中以使得可能更靈活選擇標(biāo)記 用于可溶性分泌和更容易生成分子文庫(kù)也可以證明是有利的。為了增加分泌效率，進(jìn)一步 菌株操作是可建議的，因?yàn)檠趸€原酶roi的過(guò)表達(dá)沒(méi)有導(dǎo)致期望的蛋白產(chǎn)率。參與分泌 的進(jìn)一步ER-定位蛋白（諸如，例如，Erolp)的過(guò)表達(dá)對(duì)于實(shí)現(xiàn)期望的蛋白產(chǎn)率可能是必 要的。
[0029] 金昔色葡萄球菌蛋白A 在細(xì)菌的表面上，尤其發(fā)現(xiàn)存在可以以高親和力結(jié)合免疫球蛋白的蛋白61。它們?cè)谄?就宿主物種和它們可以結(jié)合的免疫球蛋白種類(lèi)而言的特異性方面不同。細(xì)菌的主要致病性 代表為葡萄球菌屬和鏈球菌屬。表面蛋白的生物功能包含用蛋白固有的蛋白掩蔽細(xì)菌細(xì) 胞，以便逃避宿主的免疫系統(tǒng)62。最好的已知免疫球蛋白結(jié)合細(xì)菌表面蛋白之一是被稱(chēng)為 SpA的金黃色葡萄球菌蛋白A。其用于生物技術(shù)中用于IgG分子和Fc融合蛋白的親和純 化，且由五個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，所有五個(gè)結(jié)構(gòu)域都有助于IgG結(jié)合，且也仍單獨(dú)具有IgG結(jié)合特 性 63。IgG分子的結(jié)合主要經(jīng)由Fc部分發(fā)生。此外已經(jīng)證明了 SpA與Fab片段的結(jié)合64。 SpA的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)顯示于圖I65。除了高序列同源性的五個(gè)結(jié)構(gòu)域（E、D、A、B和E)以外，還 存在兩個(gè)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域（X和M)(其介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁中SpA的錨定）和N末端信號(hào)肽（SP) (其將SpA導(dǎo)航至細(xì)胞壁）。SpA與Fc部分的結(jié)合是pH依賴(lài)的 61。最強(qiáng)的結(jié)合存在于8的 pH66。如已經(jīng)提到，結(jié)構(gòu)域E、D、A、B和E也可以單獨(dú)地介導(dǎo)Fc部分和Fab片段的結(jié)合。作 為結(jié)果，出現(xiàn)了尤其就這些結(jié)構(gòu)域的生物技術(shù)用途而言的優(yōu)點(diǎn)。由于與SpA相比更小的尺 寸，與SpA相比簡(jiǎn)化了單個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組產(chǎn)生。人工結(jié)構(gòu)域衍生自結(jié)構(gòu)域B且在1987年由 Nilsson和同事通過(guò)在位置29的氨基酸取代而生成 67。其就是所謂的Z結(jié)構(gòu)域，并且表現(xiàn) 出增加的化學(xué)穩(wěn)定性。此外，Z結(jié)構(gòu)域與Fab片段的結(jié)合的損失通過(guò)提到的氨基酸取代實(shí) 現(xiàn)。作為結(jié)果，Z結(jié)構(gòu)域排他地經(jīng)由Fc部分結(jié)合IgG分子 68。如結(jié)構(gòu)域B，Z結(jié)構(gòu)域還采取 三個(gè)a _螺旋的結(jié)構(gòu)69, 7°。通過(guò)使用重復(fù)的Z序列（ZZ結(jié)構(gòu)域），ZZ結(jié)構(gòu)域與Z結(jié)構(gòu)域相 比實(shí)現(xiàn)對(duì)于Fc部分的更強(qiáng)的結(jié)合。ZZ結(jié)構(gòu)域是二價(jià)分子，這意味著由于親合力作用導(dǎo)致的 與單價(jià)Z結(jié)構(gòu)域相比加劇了 Fc結(jié)合71。
[0030] 酵母細(xì)朐h的表而呈涕 酵母細(xì)胞的表面上的蛋白和肽文庫(kù)的暴露用作蛋白的定向進(jìn)化的技術(shù)，并且在文獻(xiàn)中 被稱(chēng)為"酵母表面呈遞"。該技術(shù)由Boder和Wittrup在1997年建立92。他們首次成功地 在酵母細(xì)胞的表面上功能呈遞組合文庫(kù)的scFv片段，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選它們，并且分離 對(duì)于抗原具有增加親和力的scFv片段 92?；蛐秃捅硇偷姆€(wěn)定偶聯(lián)使其變得可能，因?yàn)?scFv片段被呈遞為具有酵母固有的細(xì)胞壁蛋白的融合蛋白。據(jù)推測(cè)，通過(guò)使用基于酵母的 呈遞技術(shù)實(shí)現(xiàn)的最重要成就是熒光激活的細(xì)胞分選（FACS)的直接適用性，這在有效篩選 大變體文庫(kù)中是決定性的。穩(wěn)定的基因型-表型偶聯(lián)通過(guò)異源蛋白與釀酒酵母的外細(xì)胞 壁的蛋白的融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。由此實(shí)現(xiàn)的蛋白暴露是與抗原相互作用的前提條件。許多不同的 細(xì)胞壁蛋白原則上能夠?qū)愒吹鞍缀碗淖鳛槿诤习閭H暴露，例如a -凝集素和a-凝集素、 Cwplp和Flolp93,94。所有這些蛋白中，a-凝集素系統(tǒng)尤其變得確立。該系統(tǒng)目前用于從未 免疫、免疫的和合成的抗體文庫(kù)選擇抗體。在2003年，F(xiàn)eldhaus和同事證明從在釀酒酵母 的表面上呈遞的未免疫的人變體文庫(kù)選擇高親和力的scFv變體 95。也可能通過(guò)酵母細(xì)胞 上的Fab片段的表面呈遞成功地證明抗體片段的親和力成熟96。下面部分更詳細(xì)地解釋了 Boder和Wittrup在1997年建立的用于借助a-凝集素在酵母細(xì)胞上表面呈遞的系統(tǒng)。
[0031]a-凝集素系統(tǒng) 凝集素是釀酒酵母的外細(xì)胞壁的配對(duì)類(lèi)型特異性粘附蛋白，且介導(dǎo)在這些細(xì)胞與 dipolide接合子融合過(guò)程中的互補(bǔ)配對(duì)類(lèi)型的單倍體酵母細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞粘附。該 過(guò)程在文獻(xiàn)中被稱(chēng)為接合。具有配對(duì)類(lèi)型a的酵母細(xì)胞表達(dá)a-凝集素，且具有配對(duì)類(lèi)型a 的酵母細(xì)胞表達(dá)a -凝集素97。細(xì)胞壁蛋白a-凝集素由亞單位Agalp和Aga2p建立。亞 單位Agalp具有GPI錨定信號(hào)，并且通過(guò)0-葡聚糖的共價(jià)結(jié)合介導(dǎo)蛋白固定