基于組合合成技術(shù)合成可控的人源化抗體庫的方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其是組合合成技術(shù)，具體涉及一種基于組合合成技 術(shù)合成可控的人源化抗體庫的方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體是機(jī)體受抗原刺激后由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能特異性結(jié)合或識別入侵的病源微 生物，是體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布于血清中?？乖?具有多種不同抗原決定簇，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生多克隆抗體；這種抗體是不均一的，會(huì)影響檢 測抗原的特異性及敏感性，在臨床上應(yīng)用受到很大限制。
[0003] 20世紀(jì)70年代中期B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)問世，由此制備出的單克隆抗體是抗單 個(gè)抗原決定簇的抗體，具有高度的特異性和均一性，且親和力強(qiáng)、效價(jià)高，在臨床上發(fā)揮了 重要作用。然而，單克隆抗體在臨床和生產(chǎn)中也存在一些問題，主要包括單克隆抗體具有免 疫原性，半衰期短，生產(chǎn)復(fù)雜，價(jià)格較高等問題。
[0004] 隨著人們對抗體基因結(jié)構(gòu)與功能的深入了解和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用DNA 重組和蛋白質(zhì)工程技術(shù)可以按人們的意愿在基因水平上對抗體分子進(jìn)行切割，拼接或修 飾，重新組裝成新型抗體分子，并賦予抗體分子新的生物學(xué)活性。因此基因工程抗體比天然 抗體具有更廣闊的應(yīng)用前景。
[0005] 例如，為了解決抗體的穿透性問題，可對抗體進(jìn)行改造，保留其抗原結(jié)合位點(diǎn)，使 之成為小分子抗體如單鏈抗體：將抗體的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL)用連接肽 (linker)連接，形成具有抗原結(jié)合能力的單鏈抗體多肽，即所謂的單鏈抗體（singlechain variablefragment，ScFv)，單鏈抗體的大小僅為完整抗體的1/6,免疫原性弱，藥物動(dòng)力學(xué) 優(yōu)于Fab片段和完整抗體，能有效到達(dá)完整抗體無法到達(dá)的靶部位。因此單鏈抗體是目前 報(bào)道最多，也最有發(fā)展前景的基因工程抗體。
[0006] 單克隆抗體技術(shù)是21世紀(jì)以來生物醫(yī)藥領(lǐng)域最為熱門的研究方向之一，單抗類 藥物直接與抗原（致病因子、腫瘤細(xì)胞等）發(fā)生特異性結(jié)合，與傳統(tǒng)化學(xué)藥物給藥相比，其 在臨床上具有靶向性、副作用小、療效高、抗藥性小等優(yōu)勢。在過去十幾年中，全球單抗藥物 市場增長迅速，2012年全球單抗藥物上市品種46個(gè)，市場總額約570億美金，占同期全球 藥品市場份額的6. 7%。由于單抗藥物相對于化療藥物的優(yōu)勢明顯，靶向治療的理念越來越 被接受，其強(qiáng)勁的市場需求成為全球制藥企業(yè)爭奪的焦點(diǎn)，目前幾乎所有大型制藥公司都 有單克隆抗體研發(fā)項(xiàng)目。
[0007] 傳統(tǒng)單抗制備利用雜交瘤技術(shù)，通過脾細(xì)胞融合得到穩(wěn)定單抗株，至少需要花費(fèi) 數(shù)月時(shí)間，并且單抗篩選范圍相對窄，嚴(yán)重影響了高親和力人源單抗的制備。傳統(tǒng)單抗本身 都是鼠源單抗，鼠抗體的人源化雖然已有很多成功的報(bào)道，也有得到批準(zhǔn)上市的抗體，但仍 然存在以下問題：難以避免人抗鼠抗體反應(yīng)，并且在鼠抗人源化過程中親和力下降、穩(wěn)定性 降低。
[0008] 近幾年，隨著多種生物展示技術(shù)的發(fā)展，定制抗體庫技術(shù)得到了一個(gè)跳躍式的進(jìn) 步。因?yàn)槎ㄖ瓶贵w庫方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：定制抗體庫方法簡單快速，避免了因雜交瘤的不 穩(wěn)定而導(dǎo)致的反復(fù)亞克?。煌ㄟ^定制人源基因框架，完全避免了人源化改造的難題；具有 外篩選功能，那些因機(jī)體免疫耐受機(jī)制而不能反應(yīng)和增殖的針對自身抗原和毒性分子的抗 體，通過抗體庫來進(jìn)行研究和利用也成為了可能。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，定制抗體庫本身 的隨機(jī)化和庫容量大的特點(diǎn)也越來越完善，因此構(gòu)建庫容量相對較大，高親和力抗體含量 相對較高的人源化抗體庫將是各大藥廠和研究者的追求目標(biāo)。
[0009] 現(xiàn)在常用的定制抗體庫技術(shù)，對于庫容要求低，突變位點(diǎn)少的情況，利用簡并合成 結(jié)合有效的篩選手段即可達(dá)到要求。但是此方法會(huì)引入無關(guān)突變或者終止密碼子，造成需 要合成較長的序列時(shí)肽庫質(zhì)量明顯下降，因此無法應(yīng)用于突變位點(diǎn)多，或者簡并位點(diǎn)涉及 的氨基酸種類較多的情況，更無法滿足完全隨機(jī)化的要求。一些改進(jìn)的方案，例如（NNK) n、（NNB)n和（VNN)n方案，其中N=A、T、C或G;K=T或G;B=G、C或T;V=A、G或C， 在一定程度上增加了多樣性并減少了終止密碼子的參入，但因編碼氨基酸的各種密碼子在 各改進(jìn)方案中出現(xiàn)的頻率差異較大，在化學(xué)合成中各種亞磷酸酰胺單體在合成中會(huì)存在一 定的競爭活性差異，使得所合成序列的氨基酸組成偏向性難以控制，這種氨基酸組成偏向 性隨目的序列的長度增加而更為明顯。利用多核苷酸（雙核苷酸或三核苷酸）代替單核苷 酸單體合成，特別是三核苷酸的合成方式則優(yōu)點(diǎn)突出，它以三聯(lián)體密碼子為單位進(jìn)行合成， 形成20種合成單元，利用這20種三聯(lián)體合成單元的隨機(jī)組合進(jìn)行合成，就可以隨意調(diào)控 特定位點(diǎn)參入氨基酸的種類和數(shù)量，從而避免了序列隨機(jī)化以及無關(guān)氨基酸和終止密碼子 的加入，但這種方法中使用的三聯(lián)體原料非常昂貴，而且這種原料在化學(xué)合成中的耦合效 率很低，所以在實(shí)際操作中絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了基于組合合成技術(shù)合成可控的人源化抗體 庫的方法與應(yīng)用，基于組合合成（permutation)技術(shù)合成人源化基因工程抗體文庫，該技 術(shù)通過把組合合成數(shù)學(xué)模型應(yīng)用于基因合成過程，解決了常規(guī)合成過程中偏向性嚴(yán)重的問 題；可以根據(jù)特定的需求隨意的調(diào)整氨基酸的種類和數(shù)量，達(dá)到序列高度隨機(jī)化、訂制化的 需求，并且避免無關(guān)氨基酸和終止密碼子加入，這些特點(diǎn)使其成為一種靈活性和可控性都 很高的蛋白文庫合成方式。
[0011] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0012] 基于組合合成技術(shù)合成可控的人源化抗體庫的方法，其包括以下步驟：
[0013] 第一步：設(shè)計(jì)人源化抗體庫：在預(yù)構(gòu)建的人源化抗體庫中的合成序列中，在任意 位置或者任意比例引入氨基酸；
[0014] 第二步：組合合成隨機(jī)引物庫：在氨基酸變化區(qū)域，根據(jù)反向中心法則和DNA編碼 規(guī)則，設(shè)計(jì)對應(yīng)的DNA序列，通過DNA固相亞磷酰胺三酯法合成隨機(jī)的引物庫；
[0015] 第三步：構(gòu)建人源化重組抗體庫：在擴(kuò)增體系中加入第二步中獲得的引物庫中的 引物，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后連入載體，獲得人源化重組抗體庫；
[0016] 第二步中所述的組合合成隨機(jī)引物庫，包括以下幾步：
[0017] (1)按照DNA固相亞磷酰胺三酯法，合成3'端的一段序列，直至產(chǎn)生氨基酸變化 位點(diǎn)；
[0018] (2)將⑴中合成的中間產(chǎn)物全部收集起來；
[0019] (3)根據(jù)設(shè)計(jì)的序列要求混合，按比例分組，從而達(dá)到變化數(shù)量的可控性；
[0020] (4)再繼續(xù)合成相應(yīng)的密碼子堿基序列直至下一個(gè)氨基酸變化位點(diǎn)；
[0021] (5)根據(jù)氨基酸變化位點(diǎn)按照（2)-(4)中的收集、混合分組、合成方法完成所有氨 基酸變化位點(diǎn)；
[0022] (6)收集（5)中合成的中間產(chǎn)物后無需分組，直接合成5'端一段非氨基酸序列；
[0023] 根據(jù)設(shè)計(jì)的序列要求，按照所述（1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5'端全長 序列的合成。
[0024] 優(yōu)選地，第一步所述的設(shè)計(jì)人源化抗體庫，包括：
[0025] 合成人抗體重鏈可變區(qū)⑶R3的序列，構(gòu)建⑶R3庫在任意位置或者任意比例引 入氨基酸，引入氨基酸原則按照組合合成方式，將氨基酸平均分配或者根據(jù)需要的比例引 入；
[0026] 然后將所述氨基酸序列編碼后開始合成；
[0027] 再根據(jù)已經(jīng)公布的氨基酸在哺乳動(dòng)物、大腸桿菌和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中密碼子的偏 好性，選取密碼子出現(xiàn)頻率最高的作為編碼位點(diǎn)。
[0028] 優(yōu)選地，在哺乳動(dòng)物、大腸桿菌、酵母