專利名稱：一種腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及一種用于腫瘤治療的主動(dòng)靶向免疫脂質(zhì)體載體，具體涉及一種腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
臨床上常用于惡性腫瘤的治療方案包括外科手術(shù)、放射治療、藥物化療和基因(免疫)療法等。其中藥物化療應(yīng)用范圍較廣，不僅可以單獨(dú)用于治療，也可用于其它治療方案的輔助治療或鞏固治療?；熕幬锏囊话憬o藥形式進(jìn)入體內(nèi)后，半衰期較短，分布廣泛。為達(dá)到療效，有時(shí)只能采用大劑量沖擊的方式進(jìn)行治療，因此往往治療藥物在殺傷腫瘤的同時(shí)，對(duì)正常機(jī)體組織造成較大的損傷，帶來(lái)較大的毒副作用。為了實(shí)現(xiàn)降低毒副作用、提高化療藥物療效的目標(biāo)，一個(gè)有效的方式就是通過藥物劑型、藥物修飾等的手段實(shí)現(xiàn)化療藥物的靶向傳遞，即最大限度地增加特定部位(如腫瘤)的藥物濃度，減少化療藥物在正常組織器官中的分布。
腫瘤的靶向治療是利用腫瘤組織的某些生理特征或腫瘤細(xì)胞所具有的區(qū)別于正常細(xì)胞的某些特異性結(jié)構(gòu)分子作為靶點(diǎn)，使用特定的遞藥系統(tǒng)或能與靶分子特異結(jié)合的單抗、配體等靶向腫瘤的治療方法。腫瘤壞死治療(Tumor NecrosisTherapy，TNT)是靶向治療的有效方法之一。相對(duì)于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞增殖迅速并伴有異常分化，過快的細(xì)胞增殖引起瘤組織內(nèi)部的血供障礙，從而引發(fā)細(xì)胞變性壞死。腫瘤組織內(nèi)的微血管也因?yàn)榭焖僭鲩L(zhǎng)和瘤細(xì)胞某些分泌成分的作用，在結(jié)構(gòu)和功能上呈現(xiàn)出某些缺陷如細(xì)胞膜成分缺失，通透性增強(qiáng)等。這種缺陷有利于瘤組織的血流和營(yíng)養(yǎng)灌輸，也為靶向分子的通透并與靶點(diǎn)結(jié)合提供了幫助。在腫瘤壞死部位，細(xì)胞壞死后暴露出DNA和組蛋白，形成TNT治療的靶點(diǎn)(Sharifi J，et al.Hybridoma and Hybridomics.2001，20305-312；Gaffar SA，et al.Journal of Immunoassay.1991，121-14)。TNT治療的原理是利用腫瘤組織微血管和細(xì)胞膜“易漏”(leaky)的特點(diǎn)，利用能與細(xì)胞核抗原成分特異性結(jié)合的靶向分子將放射性核素、藥物或蛋白靶向至腫瘤壞死部位，殺傷與壞死細(xì)胞相鄰的腫瘤細(xì)胞，從而擴(kuò)大腫瘤細(xì)胞壞死的范圍，造成對(duì)腫瘤的特異性殺傷。
美國(guó)專利US6017514和US6071491公開了相關(guān)抗原為細(xì)胞內(nèi)DNA和組蛋白的腫瘤壞死靶向單抗的制備及其在壞死組織檢測(cè)和腫瘤治療的應(yīng)用。人鼠嵌合抗腫瘤細(xì)胞核單克隆單抗(chimeric Tumor Necrosis Therapy-3 monoclonalantibody，chTNT-3)是一種能特異性地結(jié)合腫瘤壞死區(qū)壞死細(xì)胞DNA的腫瘤壞死靶向單抗。chTNT-3是小鼠單抗可交區(qū)(Fv)基因與人單抗恒定區(qū)(Fc)基因的嵌合重組產(chǎn)物，人源部分占70％，鼠源部分占30％。由于采用人源化嵌合技術(shù)，chTNT-3大大降低了機(jī)體內(nèi)人抗鼠抗體(Human anti-mouse antibody，HAMA)的產(chǎn)生。常規(guī)腫瘤細(xì)胞單抗只對(duì)特定腫瘤的細(xì)胞膜抗原有特異性親和，對(duì)于不同種類的腫瘤，需要采用相對(duì)應(yīng)的不同品種的單抗進(jìn)行治療。chTNT-3避開了這一局限，其對(duì)應(yīng)的核抗原DNA、組蛋白等結(jié)構(gòu)成分是細(xì)胞中的基本成分，由于血管和細(xì)胞膜的選擇性通透作用，只有在壞死細(xì)胞或病變細(xì)胞中能與chTNT-3接觸作用。由于許多腫瘤細(xì)胞在快速增殖期都會(huì)出現(xiàn)壞死，因此chTNT-3對(duì)一系列腫瘤，如肝癌、肺癌、腦癌、結(jié)腸癌等均有效，具有一定的廣譜性(Spicer KM，etal.Journal of Nuclear Medicine.2000，41272P-272P)。
脂質(zhì)體是一種由磷脂雙分子層構(gòu)成的具有水相內(nèi)核的脂質(zhì)微囊。親水性藥物可以被包封在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中，親脂性藥物可以被包封在雙分子層中，兩親性藥物(弱酸或弱堿)可以通過遠(yuǎn)程載藥法包載藥物，如硫酸銨法包載阿霉素(HaranG，et al.Biochimica Et Biophysica Acta.1993，1151201-215)或pH梯度法包載長(zhǎng)春新堿(Boman NL，et al.Cancer Research.1994，542830-2833)。通過在脂質(zhì)體的表面修飾PEG等親水性高分子克服了普通脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)滯留時(shí)間短迅速被清除的缺點(diǎn)，使脂質(zhì)體能夠通過增強(qiáng)的通透性和滯留性(Enhanced Permeabilityand Retention，EPR)效應(yīng)在實(shí)體腫瘤部位蓄積；在長(zhǎng)循環(huán)的基礎(chǔ)上將特定的單抗或受體配基共價(jià)連接到脂質(zhì)體表面制得空間穩(wěn)定主動(dòng)靶向脂質(zhì)體，能識(shí)別相對(duì)應(yīng)的抗原或受體，提高脂質(zhì)體對(duì)腫瘤部位的選擇性，進(jìn)一步減少化療藥物對(duì)正常機(jī)體的損傷。
生物素(Biotin)又稱維生素H，分子量為244.31Da，等電點(diǎn)約3.5，其結(jié)構(gòu)中含一個(gè)咪唑環(huán)和一個(gè)噻吩環(huán)。親和素(Avidin，Av)是一種來(lái)源于雞蛋清的糖蛋白，分子量為約66kDa，等電點(diǎn)約10，由四個(gè)完全相同的亞基組成，每個(gè)亞基可通過其色氨酸與生物素分子中的咪唑酮環(huán)結(jié)合。親和素與生物素的親和力非常高(Kd為10-15mol/L)，遠(yuǎn)高于抗原-抗體的親和力(Kd為10-11mol/L)，兩者結(jié)合快且不可逆，并可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持高度穩(wěn)定性。鏈霉親和素(Streptavidin，SAv)來(lái)源于細(xì)菌Streptomyces avidinii，分子量60kDa。SAv與Av一樣由四個(gè)相同亞基組成，與生物素的親和力也與Av類似，但SAv不含糖基側(cè)鏈，是一種接近中性的蛋白(pH約5～6)，因此與帶電分子和細(xì)胞膜糖受體的非特異性結(jié)合均很低(Fan CZ.Pharmaceutical Sciences.2002，Master23-29；吳湖炳，et al.國(guó)外醫(yī)學(xué)·放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊(cè).1998，22248-251)。由于生物素與(鏈霉)親和素之間強(qiáng)烈的特異性結(jié)合作用，生物素-(鏈霉)親和素系統(tǒng)(Biotin-avidinsystem，BAS)被廣泛地應(yīng)用于生物分析和腫瘤放射免疫顯像。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，以提高抗腫瘤藥物治療效果。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括生物素化腫瘤壞死靶向單抗和表面PEG末端共價(jià)連接鏈霉親和素或親和素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。脂質(zhì)體內(nèi)水相中包載抗癌化療藥物。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)采用生物素化腫瘤壞死靶向單抗chTNT/B和鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，給藥時(shí)首先給予chTNT/B預(yù)定位于腫瘤壞死部位，后給予鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。
本發(fā)明所述的腫瘤壞死靶向單抗為人鼠嵌合抗腫瘤細(xì)胞核單克隆單抗chTNT-1、chTNT-2和chTNT-3中的一種，優(yōu)選為chTNT-3。
本發(fā)明所涉及的表面可連接鏈霉親和素或親和素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，其組分和摩爾含量百分比是高相變溫度磷脂酰膽堿48％～68％膽固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 1％～15％吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺0.2％～5％所述的高相變溫度磷脂酰膽堿為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)或氫化蛋磷脂酰膽堿(HEPC)。
所述的膽固醇(CHOL)級(jí)別為分析純或分析純以上。
所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)通式為mPEG-PE，其中mPEG為甲氧基聚乙二醇，PE為磷脂酰乙醇胺。其中mPEG分子量為1000～10000，更佳的分子量為2000～5000；PE是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、氫化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氫化蛋磷脂酰乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)或蛋磷脂酰乙醇胺(EPE)其中的一種，優(yōu)選DSPE或HSPE。
所述的吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)通式為PDP-PEG-PE，其中PDP為吡啶二硫丙酰基，PEG為聚乙二醇，PE為磷脂酰乙醇胺。涉及的PEG分子量為1000～10000，更佳的分子量為2000～5000；PE可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、氫化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氫化蛋磷脂酰乙醇胺(HEPE)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)或蛋磷脂酰乙醇胺(EPE)其中的一種，優(yōu)選DSPE或HSPE。
甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量有關(guān)，通常吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量要大于或等于甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量。本發(fā)明優(yōu)選甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量為2000，吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量為3350或2000。
本發(fā)明的主動(dòng)靶向免疫脂質(zhì)體的制備涉及表面含PDP活性基團(tuán)的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的制備，其方法如下將高相變溫度磷脂酰膽堿、膽固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸干成膜后置真空干燥器中繼續(xù)干燥超過2h。用緩沖液水化后，用高壓均質(zhì)機(jī)分別通過孔徑為200nm和100nm核孔膜，得到小單室脂質(zhì)體。
所用水化緩沖液為0.155mol/L硫酸銨溶液或50mmol/L鈣黃綠素水溶液。所用水化溫度為55℃～70℃。
本發(fā)明采用下述方法制備生物素化腫瘤壞死靶向單抗生物素氨基己糖酸-3-磺酸基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-NHS-LC-biotin)與chTNT-3按2～30摩爾比反應(yīng)，分離純化后得到生物素取代度為2～15的生物化腫瘤壞死靶向單抗(chTNT-3/B)。
腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)中脂質(zhì)體表面共價(jià)連接的蛋白可以是親和素或鏈霉親和素，優(yōu)選為鏈霉親和素。
表面共價(jià)連接鏈霉親和素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的制備方法如下鏈霉親和素經(jīng)琥珀酰亞胺馬來(lái)酰亞胺苯基丁酸酯(SMPB)衍生化得馬來(lái)酰亞胺苯基丁?；溍褂H和素(MPB-SAv)；PDP脂質(zhì)體經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)還原成表面帶巰基的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體后，與MPB-SAv反應(yīng)過夜，經(jīng)Sepharose CL-4B凝膠柱分離純化收集脂質(zhì)體組分，即得表面共價(jià)修飾鏈霉親和素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SAv-SL)。其平均粒徑為80nm～150nm。
本發(fā)明涉及的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)給藥時(shí)首先給予chTNT-3/B預(yù)定位于靶細(xì)胞或腫瘤壞死部位，間隔6～96h后給予SAv-SL，利用生物素和鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合作用將脂質(zhì)體靶向至腫瘤組織。優(yōu)選時(shí)間間隔為12h～48h。
本發(fā)明涉及的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的體外靶向性評(píng)價(jià)通過其與固定Raji細(xì)胞的結(jié)合量來(lái)驗(yàn)證。Raji細(xì)胞經(jīng)化學(xué)處理(多聚甲醛，丙酮固定)后細(xì)胞膜的選擇性通透特性被破壞，核抗原在細(xì)胞內(nèi)固定下來(lái)，但細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)仍然得到較完整的保留。試驗(yàn)結(jié)果表明，包載鈣黃綠素的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體均能夠特異性地靶向固定Raji細(xì)胞內(nèi)的核抗原，與固定Raji細(xì)胞的結(jié)合量均顯著高于陰性對(duì)照組，與腫瘤靶向壞死靶向單抗-空間穩(wěn)定脂質(zhì)體相當(dāng)。
包載化療藥物阿霉素的脂質(zhì)體對(duì)惡性腫瘤的治療作用與脂質(zhì)體在血循環(huán)中的滯留時(shí)間和在腫瘤部位的蓄積量直接相關(guān)。對(duì)于非主動(dòng)靶向的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體而言，由于其半衰期較長(zhǎng)，能夠通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位蓄積；主動(dòng)靶向脂質(zhì)體由于脂質(zhì)體表面修飾了單抗或鏈霉親和素，血中滯留時(shí)間與非主動(dòng)靶向的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體相比有所縮短，但由于對(duì)腫瘤壞死部位的主動(dòng)選擇性增強(qiáng)，因此其在腫瘤部位蓄積量高于空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，抗腫瘤活性亦高于后者。
本發(fā)明涉及的給藥系統(tǒng)能將化療藥物攜帶至腫瘤壞死部位，化療藥物殺傷腫瘤壞死部位周圍的腫瘤細(xì)胞，從而形成新的壞死區(qū)，周而復(fù)始，使腫瘤壞死區(qū)不斷擴(kuò)大，由此形成對(duì)整個(gè)腫瘤的殺傷作用。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)行為符合兩室模型，能顯著延長(zhǎng)阿霉素生物半衰期，其在腫瘤組織中積蓄是一個(gè)漸進(jìn)過程；以阿霉素為模型藥物，生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)抗皮下移植瘤藥效較好，抑瘤率61.9％，明顯高于非主動(dòng)靶向的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體抑瘤率49.1％。


圖1生物素化腫瘤壞死靶向單抗的免疫活性檢測(cè)其中，chTNT-3人鼠嵌合抗腫瘤細(xì)胞核單抗；MPB-chTNT-3馬來(lái)酰亞胺苯基丁?；鵦hTNT-3；chTNT-3/B(sub 3)生物素化chTNT-3，生物素取代度為3；chTNT-3/B(sub 5)生物素化chTNT-3，生物素取代度為5；chTNT-3/B(sub 8)生物素化chTNT-3，生物素取代度為8；IgG非特異性人源IgG。
圖2包載鈣黃綠素的生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體與固定Raji細(xì)胞的結(jié)合量其中，SL[Calc]包載鈣黃綠素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；SAv-SL[Calc]包載鈣黃綠素的鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3/B+SAv-SL[Calc]包載鈣黃綠素的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；Calc游離鈣黃綠素。
圖3生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)曲線其中，SL[DXR]包載阿霉素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；SAv-SL[DXR]包載阿霉素的鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；DXR游離阿霉素。
圖4靜脈注射生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體后荷H460移植瘤BALB/c裸鼠腫瘤中阿霉素的濃度其中，SL[DXR]包載阿霉素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體；DXR游離阿霉素。
圖5靜脈注射生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體后荷H460移植瘤BALB/c裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線其中，DXR游離阿霉素；SL[DXR]包載阿霉素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；IgG-SL[DXR]包載阿霉素的非特異性人源IgG修飾的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗-空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；SAv-SL[DXR]包載阿霉素的鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體；chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]包載阿霉素的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 生物素化腫瘤壞死靶向單抗制備精密吸取10mg/mL Sulfo-NHS-LC-biotin DMSO溶液，加入10mg/mLchTNT-3溶液中，輕微攪拌，室溫反應(yīng)2h。以pH 7.4的HEPES緩沖液(含25mmol/LHEPES和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中壓層析系統(tǒng)280nm處檢測(cè)衍生化單抗chTNT-3/B組分并收集。采用Amicon Ultra-4離心超濾管(超濾膜截留分子量50,000)對(duì)chTNT-3/B離心濃縮，BCA法定量其蛋白含量為5mg/mL；HABA/Avidin法測(cè)定chTNT-3/B中生物素取代度為2～15。
實(shí)施例2 表面含巰基的阿霉素空間穩(wěn)定脂質(zhì)體制備將脂質(zhì)體膜材(HSPC∶CHOL∶mPEG-HSPE∶PDP-PEG-HSPE＝5∶4∶0.2∶0.05，摩爾比)溶于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸除有機(jī)溶劑制得均勻磷脂膜，減壓干燥12h。加入一定體積155mmol/L硫酸銨緩沖液(pH 5.5)，使磷脂濃度為10mmol/L，65℃水浴振蕩2h，用高壓均質(zhì)機(jī)或微型擠壓器依次擠壓通過0.2、0.1和0.08μm的核孔膜，各10次，即得帶PDP活性基團(tuán)的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(PDP-SL)。將上述PDP-SL以123mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.5)洗脫通過Sepherose CL-4B凝膠柱更換外水相，加入阿霉素水溶液使最終其濃度為1mg/mL，65℃水浴振蕩20min。PDP-SL經(jīng)二巰基蘇糖醇還原后，以pH 6.7的HEPES-Mes緩沖液(含25mmol/LHEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(16mm×150mm)，收集得到表面帶有游離巰基的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(HS-SL)。
實(shí)施例3 鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體制備精密吸25m mol/L SMPB DMF溶液，加入10mg/mL SAv溶液中，使兩者摩爾比為20∶1，輕微攪拌，室溫反應(yīng)1h。以pH 6.7的HEPES-Mes緩沖液(含25mmol/L HEPES、25mmol/L Mes和140mmol/L NaCl)為洗脫液過Sephadex G-50凝膠柱(10mm×120mm)，流速1mL/min，AKTA中壓層析系統(tǒng)280nm處檢測(cè)衍生化鏈霉親和素組分(MPB-SAv)并收集。采用Amicon Ultra-4離心超濾管(超濾膜截留分子量10,000)離心濃縮MPB-SAv，BCA法定量其蛋白濃度。精密吸取MPB-SAv，加入HS-SL脂質(zhì)體中使其與HSPC的摩爾比為1∶1000，室溫反應(yīng)過夜。以pH 7.4的HEPES緩沖液(含25mmol/L HEPES和140mmol/LNaCl)為洗脫液過Sepharose CL-4B凝膠柱，除去游離的MPB-SAv，收集脂質(zhì)體組分，即得鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SAv-SL)。
實(shí)施例4 生物素化腫瘤壞死靶向單抗的免疫活性檢測(cè)離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，按常規(guī)方法提取核抗原。以ELISA酶標(biāo)法考察MPB-chTNT-3，chTNT-3/B和chTNT-3-SL中單抗的免疫活性，以chTNT-3為陽(yáng)性對(duì)照，非特異性人源IgG修飾的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(IgG-SL)和表面帶PDP活性基團(tuán)的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(PDP-SL)為陰性對(duì)照。
ELISA操作如下96孔板，每孔加入200μL 0.005％多聚賴氨酸，濕袋中4℃放置過夜；吸去多聚賴氨酸溶液，磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)洗1次后加200μL核抗原(2μg/mL)，2000rpm離心10min，吸去上清液，加100μL 0.05％戊二醛于4℃固定15min；吸去固定液，PBS洗3次，每孔加入200μL 5％BSA，于37℃封閉1h；0.1％Tween-PBS洗3次后，分別加入100μL倍比稀釋的chTNT-3-SL及對(duì)照(chTNT-3、MPB-chTNT-3、chTNT-3/B、IgG-SL和PDP-SL)，37℃溫育1h；0.1％Tween-PBS洗3次后，加50μL辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶2000)，37℃溫育1h；0.1％Tween-PBS洗3次，加底物TMB 100μL，室溫避光放置10min，加入50μL 2M H2SO4終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處(參比波長(zhǎng)630nm)測(cè)定吸收值。
實(shí)施例5 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的體外靶向性評(píng)價(jià)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，離心濃縮(4℃，1000r·min-1，5min)，PBS洗1次，2％多聚甲醛固定5～10min，PBS洗3次，-20℃丙酮處理3～10min，離心(4℃，1000r·min-1，10min)，PBS洗1次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，保存于含1％BSA、0.02％疊氮鈉的PBS中。
采用50mmol/L鈣黃綠素溶液水化脂質(zhì)體，MiniExtruder微型擠出器控制粒徑(80、100和200nm)，制備含有鈣黃綠素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SL[Calc])、空間穩(wěn)定免疫脂質(zhì)體(chTNT-3-SL[Calc]、IgG-SL[Calc])和鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SAv-SL[Calc])，其中磷脂濃度均為10mmol/L。
生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)與固定Raji細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)操作步驟如下(1)96孔白底熒光板，每孔加200μL 1％BSA，37℃封閉1h；(2)吸去封閉液，加100μL固定Raji細(xì)胞(3×106/mL)；(3)加入200μL 60μg/mL chTNT-3/B，室溫作用1h后離心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次離心(4℃，2000r·min-1，10min)后吸去上清液，加入200μL SAv-SL[Calc]，室溫作用1h；
(4)離心(4℃，2000r·min-1，10min)，吸去上清液，用含1％BSA的PBS洗2次，每次300μL，再次離心(4℃，2000r·min-1，10min)后吸去上清液。
(5)每孔加270μL PBS、30μL 2.5％Triton X-100，混勻，LS-55熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光吸收值F(激發(fā)波長(zhǎng)490nm，發(fā)射波長(zhǎng)520nm)。
實(shí)施例6 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究取15只SD大鼠，體重190～210g，隨機(jī)分成5組，乙醚麻醉后，按阿霉素5mg/kg體重的給藥劑量股靜脈注射游離阿霉素和各阿霉素脂質(zhì)體制劑空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SL[DXR])、腫瘤壞死靶向單抗-空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(chTNT-3-SL[DXR])、腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])、鏈霉親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(SAv-SL[DXR])，其中腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位空間穩(wěn)定脂質(zhì)體組在給藥前24h預(yù)先尾靜脈注射chTNT-3/B。分別于給藥后10min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h和72h尾靜脈取血0.5mL，置于檸檬酸鈉抗凝的塑料離心管中，3000r·min-1離心10min，取0.2mL血漿，置-20℃保存。樣品于測(cè)定前室溫解凍，HPLC法測(cè)定血樣中阿霉素濃度。
實(shí)施例7 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的組織分布研究挑選同一批次H460移植瘤體積為0.7～0.8cm3的裸小鼠48只，隨機(jī)分成4組，每組12只，分別按阿霉素5mg/kg體重的給藥劑量尾靜脈注射SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR](24h前預(yù)先靜注5mg/kg體重chTNT-3/B)、DXR。于給藥后4h、24h和48h眼眶取血，處死裸小鼠后，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，生理鹽水洗凈，用濾紙吸干，稱重。HPLC法測(cè)定樣品中阿霉素濃度。
實(shí)施例8 生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究88只雌性Balc/c-nu/nu裸小鼠接種H460腫瘤，1周后從中挑選出瘤體積相近的42只(平均瘤體積為0.083cm3)，隨機(jī)分成7組，每組6只。按阿霉素5mg/kg體重，于第1天、第8天給藥兩次，每次分別給予生理鹽水、DXR、SL[DXR]、IgG-SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]、SAv-SL[DXR]和chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]。
表1是給藥后定期測(cè)量瘤徑計(jì)算體積抑瘤率。
表1

*P＜0.05，**P＜0.01vs預(yù)定位組(chTNT-3/B+SAv-SL[DXR])
權(quán)利要求
1.一種腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于通過下述方法制備采用生物素化腫瘤壞死靶向單抗chTNT/B和鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，給藥時(shí)首先給予chTNT/B預(yù)定位于腫瘤壞死部位，后給予鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的脂質(zhì)體內(nèi)水相中包載抗癌化療藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的chTNT/B，chTNT與生物素以共價(jià)方式連接，chTNT/B中生物素取代度為2～15，其中chTNT選自人鼠嵌合抗腫瘤細(xì)胞核單抗chTNT-1、chTNT-2或chTNT-3中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體含有高相變溫度磷脂酰膽堿、膽固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、鏈霉親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和抗腫瘤藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，其組分和摩爾含量百分比是高相變溫度磷脂酰膽堿48％～68％膽固醇 30％～50％甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 1％～15％鏈霉親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺0.2％～5％其中高相變溫度磷脂酰膽堿選自氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、氫化大豆磷脂酰膽堿或氫化蛋磷脂酰膽堿；甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的通式為mPEG-PE，其中mPEG為單甲氧基聚乙二醇，PE為磷脂酰乙醇胺；鏈霉親和素或親和素-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的通式為SAv(Av)-PEG-PE，其中SAv為鏈霉親和素，Av為親和素，PEG為聚乙二醇，SAv或Av通過共價(jià)方式與PEG鏈末端連接，PE為磷脂酰乙醇胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的mPEG-PE中mPEG的分子量為1000～10000。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的mPEG-PE中mPEG的分子量為2000～5000。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的SAv(Av)-PEG-PE中的SAv或Av與PEG鏈末端通過馬來(lái)酰亞胺與游離巰基加成的方式共價(jià)連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量為1000～10000。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的SAv(Av)-PEG-PE中PEG的分子量為2000～5000。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的mPEG-PE和SAv(Av)-PEG-PE中PE選自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于所述的脂質(zhì)體內(nèi)水相中包載的抗癌化療藥物是阿霉素。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體平均粒徑為80nm～150nm。
14.權(quán)利要求1或2的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在制備抗腫瘤藥物中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的先、后給藥時(shí)間間隔為6h～96h。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的先、后給藥時(shí)間間隔為12h～48h。
全文摘要
本發(fā)明公開了生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)包括生物素化腫瘤壞死靶向單抗和PEG末端共價(jià)連接鏈霉親和素或親和素的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，通過一定時(shí)間間隔給藥。該脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在體外能特異性地靶向腫瘤細(xì)胞核抗原。通過生物素化腫瘤壞死靶向單抗預(yù)定位策略，包載阿霉素的鏈霉親和素或親和素化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體在腫瘤組織中能較好地靶向蓄積，抗腫瘤效果良好。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1883454SQ20061002722
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者陸偉躍, 潘弘, 姚明, 鐘高仁, 周光興 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)