專利名稱：一種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法
—種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
紅曲色素在中國有悠久的歷史，色素有安全性高、對熱穩(wěn)定、對物質(zhì)染色能力好、 色調(diào)鮮紅、質(zhì)量穩(wěn)定和價格低廉的優(yōu)點，是人工合成色素和其它天然色素所不能比的。但是，紅曲色素生產(chǎn)的過程中會有桔霉素伴隨產(chǎn)生，桔霉素是一種真菌毒素，具有腎毒性，毒性比較明顯，可引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等癥狀。因此，產(chǎn)銅生產(chǎn)工藝顯然降低了天然紅曲色素的安全性。
目前，降低桔霉素的方法主要集中在發(fā)酵工藝優(yōu)化，菌種誘變篩選，基因工程三個層面。Blanc等首先研究了不同的氮源對桔霉素影響，但是降低桔霉素的同時也影響了色素的產(chǎn)生。Hassan等將紅曲酶在不同的通氣和攪拌條件下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)隨著通氣量的增加或攪拌速度的提高，菌體的生物量和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量都有所增加，而桔霉素的增加比例要大于紅曲色素的增加比例。近年來，科研人員逐步將重點放在對紅曲桔霉素合成的相關(guān)基因和酶的研究上，這樣有利于深入理解紅曲桔霉素的合成途徑，為從根本上控制紅曲中桔霉素含量提供了基礎(chǔ)理論和技術(shù)手段。但是，從基因的手段控制桔霉素不可避免的要對紅曲的基因進(jìn)行改造，這就使原本安全的天然色素變成了現(xiàn)在比較敏感的轉(zhuǎn)基因色素。另外，還有部分研究人員利用化學(xué)方法脫去桔霉素，例如采用H2O2進(jìn)行脫毒，雖然通過處理可以完全脫毒，但也會不同程度影響紅曲色素的質(zhì)量。如果找到能刺激紅曲霉細(xì)胞釋放活性氧，并在胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中產(chǎn)生復(fù)合酶的轉(zhuǎn)化劑，而又不影響色素紅曲質(zhì)量和安全性，從而可以從根本上解決色素紅曲桔霉素污染的瓶頸問題。發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明通過比較紅曲霉菌細(xì)胞中活性氧釋放和胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的SOD酶活性變化，研究活性氧的產(chǎn)生與色素、桔霉素合成的關(guān)系，得到轉(zhuǎn)化劑抑制桔霉素生成或促進(jìn)桔霉素?zé)o毒轉(zhuǎn)化的機(jī)理，從而提供一種桔霉素含量低的食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，包括將紅曲霉菌進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，液體種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入轉(zhuǎn)化劑，所述的轉(zhuǎn)化劑選自如下的一種或多種 胡蘿卜素、維生素C、黃腐酸、EDTA-2Na。
優(yōu)選地，所述食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，其中在發(fā)酵培養(yǎng)24h - 96h后，按 O. 2-100mg/L的比例在發(fā)酵液中分次加入所述轉(zhuǎn)化劑。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述斜面種子培養(yǎng)的步驟為將紅曲霉菌接種于固體斜面培養(yǎng)基， 于32°C恒溫培養(yǎng)5天，得到斜面一級種子；所述固體斜面培養(yǎng)基的配方為葡萄糖6%，蛋白胨 2%，瓊脂 3%, ρΗ5· 5 6。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述液體種子培養(yǎng)的步驟為取培養(yǎng)后的斜面種子管一支，用生理鹽水將菌體及孢子洗脫至IOOmL生理鹽水中，按10%的接種量接種到二級液體種子培養(yǎng)基， 在250ml三角瓶，裝液量為100ml，加20顆玻璃珠，于200rpm，28°C - 32°C培養(yǎng)24h_48h， 得液體二級種子；所述二級液體種子培養(yǎng)基的配方為大米粉3%，硝酸鈉O. 5%，磷酸二氫鉀 O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的步驟為將液體二級種子按6-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在250ml三角瓶，裝液量為IOOml，于32°C，200rpm培養(yǎng)6d_8d ;在發(fā)酵培養(yǎng)24h - 96h后，按O. 2-100mg/L的比例在發(fā)酵液中分次加入所述轉(zhuǎn)化劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為大米粉9%，硝酸鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%。
本發(fā)明首次進(jìn)行了紅曲菌株發(fā)酵過程中桔霉素定向轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究，在發(fā)酵過程中分別分次添加轉(zhuǎn)化劑，檢測了不同發(fā)酵時間細(xì)胞產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物色素、桔霉素和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶及自由基的產(chǎn)生情況，闡明了這些轉(zhuǎn)化因子引起細(xì)胞內(nèi)酶活的變化及其細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物桔霉素降低的原因。通過對比加入不同轉(zhuǎn)化因子的發(fā)酵液色價及桔霉素的檢測值，比較發(fā)現(xiàn)三種轉(zhuǎn)化因子對色價都有不同程度的提高，其中加入轉(zhuǎn)化因子B 和C，色價分別提高了 50%左右。幾種轉(zhuǎn)化因子對桔霉素含量的影響很明顯，桔霉素分別下降了 94. 77%,94. 26%,96. 23%，達(dá)到了理想的效果，實現(xiàn)了食品安全型紅曲色素的定向轉(zhuǎn)化。 經(jīng)過對紅曲霉細(xì)胞內(nèi)SOD酶活性和產(chǎn)生的自由基的測定，比較發(fā)現(xiàn)添加了轉(zhuǎn)化劑A、B和C 的發(fā)酵液SOD酶活性相對較高，自由基大幅度的增加，這與桔霉素大幅度的降低現(xiàn)象相符， 說明轉(zhuǎn)化劑的添加，刺激紅曲霉細(xì)胞釋放活性氧，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生更多的自由基，起到了類似激發(fā)子的作用，改變了胞內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，從而表現(xiàn)為培養(yǎng)過程中產(chǎn)生較多的 SOD酶，促使了桔霉素的合成量減少，由于轉(zhuǎn)化劑為食品添加劑，安全無毒，且不同程度提高了色素紅曲的色價，保證了紅曲色素的質(zhì)量和安全性，從而從根本上了解決色素紅曲桔霉素污染的瓶頸問題。
現(xiàn)有的降低桔霉素的方法有基因敲除，酸堿處理等，與這些方法相比，本發(fā)明及的紅曲色素生產(chǎn)方法制取的紅曲色素中桔霉素含量大幅度降低，具有有安全性高，操作簡便， 簡單易行，高效等優(yōu)點。


圖I.紅曲霉菌細(xì)胞內(nèi)S0D、自由基對桔霉素的影響曲線圖。
圖2.實施例I中轉(zhuǎn)化劑A對紅曲細(xì)胞內(nèi)S0D、自由基及桔霉素的影響曲線圖。
圖3.實施例2中轉(zhuǎn)化劑B對紅曲細(xì)胞內(nèi)S0D、自由基及桔霉素的影響曲線圖。
圖4.實施例3中轉(zhuǎn)化劑C對紅曲細(xì)胞內(nèi)S0D、自由基及桔霉素的影響曲線圖。
圖5.實施例4中轉(zhuǎn)化劑D對紅曲細(xì)胞內(nèi)S0D、自由基及桔霉素的影響曲線圖。
具體實施實例本發(fā)明所用原料大米為早秈稻，菌種為實驗室從紅曲米中篩選出的菌種，轉(zhuǎn)化劑A為胡蘿卜素，轉(zhuǎn)化劑B為維生素C，轉(zhuǎn)化劑C為黃腐酸，轉(zhuǎn)化劑D為EDTA-2Na。以下通過實施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例I(1)將紅曲霉菌接種于固體斜面培養(yǎng)基，于32°C恒溫培養(yǎng)5天，得到斜面一級種子，固體斜面培養(yǎng)基葡萄糖6%，蛋白胨2%，瓊脂3%，pH5. 5飛；(2)取培養(yǎng)后的斜面種子一支，用生理鹽水將菌體及孢子洗脫至IOOml生理鹽水中， 按10%的接種量接種到二級液體種子培養(yǎng)基，在250ml三角瓶，裝液量為100ml，加20顆玻璃珠，于200rpm，32°C培養(yǎng)24h_48小時，二級種子培養(yǎng)基為大米粉3%，硝酸鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%，乳酸調(diào)ρΗ5· 5 6 ；(3)將培養(yǎng)48h后的二級液體種子按6-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在300ml 三角瓶，裝液量為100ml，于32°C，200rpm培養(yǎng)6d，發(fā)酵培養(yǎng)基為大米粉9%，硝酸鈉O. 5%， 磷酸二氫鉀O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%，乳酸調(diào)pH5. 5飛；(4)將培養(yǎng)24h后的發(fā)酵液中分次加入IOOPL100mg/ml的轉(zhuǎn)化劑A ；(5)在發(fā)酵過程中，分別在12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h 取出樣品測定色價、桔霉素、超氧化物歧化酶(SOD)和自由基。結(jié)果參見圖2。
實施例2步驟(I)- (3)與實施例I的方法中(I)- (3)相同。
(4)將培養(yǎng)24h后的發(fā)酵液中分次加入100μ1 2mg/ml的轉(zhuǎn)化劑B ；(5)在發(fā)酵過程中，分別在 1211、3611、6011、8411、10811、13211、14411、15611、16811、19211取出樣品測定色價、桔霉素、超氧化物歧化酶(SOD)和自由基。結(jié)果參見圖3。
實施例3步驟(I) - (3)與實施例I的方法中(I) - (3)相同。結(jié)果參見圖4。
(4)將培養(yǎng)24h后的發(fā)酵液中分次加入IOOul 5mg/ml轉(zhuǎn)化劑C。
(5)在發(fā)酵過程中，分別在 12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h 各取出一瓶測定色價、桔霉素、超氧化物歧化酶(SOD)和自由基。結(jié)果參見圖4。
實施例4步驟(I)- (3)與實施例I的方法中(I)- (3)相同。
(4)將培養(yǎng)24h后的發(fā)酵液中分次加入IOOul 3. 72mg/ml轉(zhuǎn)化劑D。
(5)在發(fā)酵過程中，分別在 12h、36h、60h、84h、108h、132h、144h、156h、168h、192h 各取出一瓶測定色價、桔霉素、超氧化物歧化酶(SOD)和自由基。結(jié)果參見圖5。
對比實施例除了在發(fā)酵培養(yǎng)過程中不加入任何轉(zhuǎn)化劑，其他步驟均同于實施例I。
紅曲發(fā)酵液色價的測定采用分光光度計法；桔霉素含量測定依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009. 222 - 2008)，采用反相高效液相HPLC-熒光檢測器(RP-HPLC-FLD)檢測。超氧化物歧化酶的測定采用氮藍(lán)四唑還原法；自由基的測定采用羥胺氧化的方法。
不同的轉(zhuǎn)化劑對紅曲發(fā)酵過程影響不同，通過對比加入不同轉(zhuǎn)化劑的發(fā)酵液色價及桔霉素的檢測值(見表1)，可以很明顯的看到四種轉(zhuǎn)化劑對紅曲色素都有所提高，其中加入轉(zhuǎn)化劑A，B，C的效果都很好，色價提高了將近50%左右，但加入D的色價卻降了一點。另外，幾種轉(zhuǎn)化劑對桔霉素含量的影響都很明顯，分別下降了 82. 1%、95. 32%,93. 36%,91. 69%。 綜合考慮桔霉素及色價，確定轉(zhuǎn)化劑B為最優(yōu)轉(zhuǎn)化劑。
表I.色價及桔霉素測定結(jié)果(發(fā)酵144h)
權(quán)利要求
1.一種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，包括將紅曲霉菌進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，液體種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入轉(zhuǎn)化劑，所述的轉(zhuǎn)化劑選自如下的一種或多種胡蘿卜素、維生素C、黃腐酸、EDTA-2Na。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)24h-96h后，按O. 2-100mg/L的比例在發(fā)酵液中分次加入所述轉(zhuǎn)化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，其特征在于所述斜面種子培養(yǎng)的步驟為將紅曲霉菌接種于固體斜面培養(yǎng)基，于32°C恒溫培養(yǎng)5天，得到斜面一級種子；所述固體斜面培養(yǎng)基的配方為葡萄糖6%，蛋白胨2%，瓊脂3%，pH5. 5 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，其特征在于所述液體種子培養(yǎng)的步驟為取培養(yǎng)后的斜面種子管一支，用生理鹽水將菌體及孢子洗脫至IOOmL生理鹽水中，按10%的接種量接種到二級液體種子培養(yǎng)基，在250ml三角瓶，裝液量為100ml， 加20顆玻璃珠，于200rpm，28°C - 32°C培養(yǎng)24h_48h，得液體二級種子；所述二級液體種子培養(yǎng)基的配方為大米粉3%，硝酸鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的步驟為將液體二級種子按6-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在250ml三角瓶，裝液量為100ml，于32°C，200rpm培養(yǎng)6d-8d ;在發(fā)酵培養(yǎng)24h - 96h后，按O. 2-100mg/L的比例在發(fā)酵液中分次加入所述轉(zhuǎn)化劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為大米粉9%，硝酸鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 25%，七水硫酸鎂O. 1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食品安全型紅曲色素的生產(chǎn)方法，包括將紅曲霉菌進(jìn)行斜面種子培養(yǎng)，液體種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)過程中加入轉(zhuǎn)化劑，所述的轉(zhuǎn)化劑選自如下的一種或多種胡蘿卜素、維生素C、黃腐酸、EDTA-2Na。本發(fā)明方法制取的紅曲色素中桔霉素含量大幅度降低，具有安全性高，操作簡便，簡單易行，高效等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/645GK102911969SQ20121041978
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者王偉平, 張華山, 朱宏軍 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)