人usp14基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了人USP14基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開(kāi)了人USP14基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人USP14基因小分子干擾RNA、人USP14基因干擾核酸構(gòu)建體、人USP14基因干擾慢病毒并公開(kāi)了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人USP14基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中USP14基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說(shuō)明】人USP14基因的用途及其相關(guān)藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及人USP14基因的用途及其相關(guān)藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]去泛素化酶主要有兩大類，包括泛素羧基端水解酶(ubiquitin C-terminalhydrolases, UCH)和泛素特異性加工酶(ubiquitin-specific processing proteases,UBP或USP)。去泛素化調(diào)節(jié)酶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的一系列生化反應(yīng)，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，腫瘤形成，細(xì)胞周期調(diào)控,轉(zhuǎn)錄激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等(Ramakrishna S, Suresh B, Baek KH.Therole of deubiquitinating enzymes in apoptosis.Cell Mol Life Sci 2011;68:15-26.Grillari J，Grillar1-Voglauer R，Jansen-Diirr P.Post-translational modificationof cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin—like molecules:role in cellularsenescence and aging.Adv Exp Med Biol 2010;694:172-196.)D
[0003]USP14(Ubiquitin-specific protease 14)，也稱為 tRNA 鳥(niǎo) _ 呤糖基轉(zhuǎn)移酶(tRNA-guanine transglycosylase, TGT)的一個(gè) 60KD 的亞基(USP14/TGT60kD)，屬于泛素特異性加工酶家族，位于人類染色體18pll區(qū)域(Deshpande KLj Seubert PHj TillmanDM, Farkas WR and Katze JR:Cloning and characterization of cDNA encoding therabbit tRNA-guanine tranSglycosyIase 60_kilodalton subunit.Arch BiochemBiophys 326:1-7,1996.)。有研究發(fā)現(xiàn)，USP14在白血病細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞中都有表達(dá)，誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化后，USP14的表達(dá)量會(huì)下降。(Ishiwata S，Katayama J，ShindoH,Ozawa Y，Itoh K and Mizugaki M:1ncreased expression of queuosine synthesizingenzyme, tRNA-guanine transglycosylase, and queuosine levels in tRNA of leukemiccells.J Biochem 129:13-17，2001.1shiwata Sj Ozawa Yj Katayama J，et al:Elevatedexpression level of 60-kDa subunit of tRNA-guanine transglycosylase in coloncancer.Cancer Lett 212:113-119，2004.)? Shinhi 等人通過(guò)免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，在正常的大腸上皮細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到USP14的表達(dá)，但是，在99例大腸癌病人中，有18例病人的大腸癌組織中能檢測(cè)到USP14的高表達(dá)，而且其表達(dá)量隨著病理學(xué)等級(jí)增加而增加(Shenji S，Naito Z，ISHIWATA S，et al.Ubiquitin-specific protease14 expression in colorectal canceris associated with liver and lymph nodemetastases.0ncology Reports.2006; 15:539-543.)。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，USP14 在肝內(nèi)膽管癌組織樣本中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常的樣本中只有很弱的表達(dá)(Chuensumran U，SaeleeP,Punyarit P，et al.Ubiquitin-specific Protease 14 Expression Associated withIntrahepaticCholangiocarcinoma Cell Differentiation.Asian Pacific J CancerPrev.2011;11:775-779.)。以上研究提示，USP14可能參與了大腸癌和膽管癌的發(fā)生和發(fā)展，有望成為大腸癌和膽管癌腫瘤基因治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。[0004]RNA干擾(RNA interference，RNAi)即用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。它可高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，導(dǎo)致其降解，從而引起生物體內(nèi)特異基因的沉默，使細(xì)胞表現(xiàn)出某種基因表型的缺失，是近年來(lái)新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。研究表明，長(zhǎng)度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotideintervals.Cell 2000;101:25-33.)。腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對(duì)腫瘤發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)的基因進(jìn)行干預(yù)，將能為腫瘤的治療開(kāi)辟新途徑。近年來(lái)，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤進(jìn)程(Uprichard, Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
[0005]為了深入研究USP14在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明選取肺癌和乳腺癌細(xì)胞模型，以RNAi為手段研究USP14在肺癌和乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于公開(kāi)與人USP14 (Ubiquitin-specific protease 14)基因相關(guān)的治療方法及藥物，以RNA干擾(RNAi)為手段研究USP14基因在腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡過(guò)程中的作用。
[0007]本發(fā)明第一方面，以RNA干擾為手段，研究了 USP14基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，公開(kāi)了一種抑制或降低腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細(xì)胞施用一種能夠特異性抑制USP14基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制USP14蛋白的表達(dá)或活性的分子，以此來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或存活。
[0008]所述腫瘤細(xì)胞選自其生長(zhǎng)與USP14蛋白的表達(dá)或活性相關(guān)的腫瘤細(xì)胞。較優(yōu)的，所述腫瘤細(xì)胞選自肺癌、乳腺癌之任一。
[0009]所述抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低USP14基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低USP14蛋白的表達(dá)或活性的劑量。進(jìn)一步的，所述USP14基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0010]所述分子可選自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0011]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0012]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有USP14基因的啟動(dòng)子序列或USP14基因的信息序列。
[0013]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA(siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與USP14基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結(jié)合靶序列所編碼的mRNA片段，并特異性沉默人USP14基因的表達(dá)。
[0014]進(jìn)一步的，所述小干擾RNA的第一鏈序列與USP14基因中的靶序列基本相同。較優(yōu)的，所述USP14基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1_5中之任一序列。
[0015]所述USP14基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默USP14基因表達(dá)時(shí)，與所述的小分子干擾RNA互補(bǔ)結(jié)合的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的USP14基因中的片段。
[0016] 較佳的，所述USP14基因來(lái)源于人。
[0017]本發(fā)明第一方面還公開(kāi)了一種分離的人USP14基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0018]進(jìn)一步的，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌之任一。
[0019]所述將分離的USP14基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容:其一，將USP14基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將USP14基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。
[0020]所述將USP14基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將USP14基因作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來(lái)研制針對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)USP14基因的表達(dá)水平。
[0021]所述將USP14基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將USP14基因作為作用對(duì)象，對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人USP14基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的USP14基因小分子干擾RNA (siRNA)即是以人USP14基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將USP14基因及其蛋白作為作用對(duì)象。
[0022]所述將USP14基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將USP14基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0023]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制USP14基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制USP14蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中USP14基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化和/或存活的目的。
[0024]所述通過(guò)分離的USP14基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0025]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0026]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人USP14基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低人USP14蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人USP14基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0027]采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過(guò)降低人USP14基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來(lái)達(dá)到治療的目的。具體的，治療時(shí)，將能有效降低人USP14基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。
[0028]本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種降低腫瘤細(xì)胞中USP14基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0029]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與USP14基因雜交的核苷酸序列；或者
[0030]b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與USP14基因雜交的核苷酸序列。[0031]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與USP14基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與USP14基因中19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與USP14基因中19、20或者21個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。
[0032]更進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與USP14基因中的靶序列基本相同。[0033]進(jìn)一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與USP14基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA (siRNA)進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源USP14基因表達(dá)的作用。
[0034]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與USP14基因中的靶序列基本相同。
[0035]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與USP14基因中的靶序列基本相同，所述USP14基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默USP14基因表達(dá)時(shí)，被所述siRNA識(shí)別并沉默的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的USP14基因中的片段。
[0036]較佳的，所述USP14基因中的靶序列含有SEQ IDNO: 1-5之任一序列。
[0037]進(jìn)一步的，所述USP14基因來(lái)源于人。
[0038]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長(zhǎng)度均為15-27個(gè)核苷酸；較佳的，長(zhǎng)度均為19-23個(gè)核苷酸；最佳的，長(zhǎng)度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。
[0039]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。更進(jìn)一步的，所述小干擾RNA第一鏈的序列如 SEQ ID NO:17 所示，具體為 5’ -CGCAGAGUUGAAAUAAUGGAA-3 ’。
[0040]SEQ ID NO: 17所示的siRNA為以SEQ ID NO: 3所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)的、針對(duì)人USP14基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補(bǔ)，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源USP14基因表達(dá)的作用。
[0041]進(jìn)一步的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042]更進(jìn)一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 18所示，具體為:5’ -CGCAGAGUUGAAAUAAUGGAAUUCAAGAGAUUCCAUUAUUUCAACUCUGCG-3，。
[0043]shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性人USP14基因表達(dá)的作用。
[0044]編碼本發(fā)明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQ ID NO: 1-5中之任一序列及其互補(bǔ)序列。
[0045]本發(fā)明第三方面，公開(kāi)了一種USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼本發(fā)明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA
[0046]所述的人USP14基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人USP14基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體為USP14基因干擾慢病毒載體。
[0047]本發(fā)明的USP14基因干擾慢病毒載體是將編碼前述USP14基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述USP14基因干擾慢病毒載體經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通過(guò)酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默USP14基因的表達(dá)。
[0048]進(jìn)一步的，所述USP14基因干擾慢病毒載體還含有啟動(dòng)子序列和/或編碼腫瘤細(xì)胞中可被檢測(cè)的標(biāo)記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測(cè)的標(biāo)記物如綠色熒光蛋白(GFP)0
[0049]進(jìn)一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-pur ο > pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0050]本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人USP14基因干擾慢病毒載體,命名為 pGCS IL-GFP-USP14-si RNA。
[0051 ] 本發(fā)明分離的核酸分子可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為肺癌或乳腺癌。
[0052]本發(fā)明的USP14基因siRNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。USP14基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述USP14基因siRNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時(shí)，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動(dòng)物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0053]本發(fā)明第四方面，公開(kāi)了一種USP14基因干擾慢病毒，由前述USP14基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生針對(duì)USP14基因的小分子干擾RNA，從而抑制肺癌或乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖。該USP14基因干擾慢病毒可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
[0054]本發(fā)明第五方面，公開(kāi)了一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有前述的分尚的核酸分子，USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或USP14基因干擾慢病毒。
[0055]進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有I~99wt%所述雙鏈RNA、shRNA、USP14基因干擾核酸構(gòu)建體或USP14基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0056]在制備這些組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤(rùn)劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
[0057]本發(fā)明還公開(kāi)了所述藥物組合物在制備治療肺癌、乳腺癌之任一的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0058]該藥物組合物的應(yīng)用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。進(jìn)一步的，所述腫瘤選自肺癌或乳腺癌。
[0059]所述藥物組合物用于預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤時(shí)，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。采用該方法，所述腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進(jìn)一步的，所述腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0060]本發(fā)明第六方面，公開(kāi)了一種用于降低腫瘤細(xì)胞中的USP14基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的所述分離的核酸分子，USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或所述的USP14基因干擾慢病毒。
[0061]綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)人USP14基因的5個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建相應(yīng)的USPHRNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO:3 的 RNAi 載體pGCSIL_GFP-USP14_siRNA 能夠顯著下調(diào)USP14基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)v)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCS IL-GFP-USP14-si RNA能夠靶向地將針對(duì)USP14基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人肺癌H1299細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞，降低USP14基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的USP14基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。 [0062]本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人USP14基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中USP14基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0063]圖1:pGCSIL_GFP 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0064]圖2:USP14-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，USP14mRNA的表達(dá)水平顯著降低
[0065]圖3:USP14-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制
[0066]圖4:USP14-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制
【具體實(shí)施方式】
[0067]本發(fā)明涉及了一組針對(duì)人USP14基因的小分子干擾RNA (siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人USP14 mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30 (優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過(guò)基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源USP14基因的表達(dá)。
[0068]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人USP14基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一研究成果表明USP14基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。發(fā)明人進(jìn)一步合成和測(cè)試了多種針對(duì)USP14基因的siRNA，篩選出了可有效抑制USP14的表達(dá)進(jìn)而抑制人肺癌H1299細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0069]本發(fā)明提供了一系列干擾人USP14基因的小干擾RNA (siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默USP14基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人USP14基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)USP14基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明USP14基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點(diǎn)。而且，通過(guò)RNAi方式沉默USP14基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。
[0070]本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為:
[0071]本發(fā)明通過(guò)如下方法來(lái)篩選獲得一種人USP14基因RNAi慢病毒:從Genbank中調(diào)取人USP14基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)USP14基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達(dá)USP14基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix, Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默USP14基因的慢病毒。
[0072]基于上述方法，本發(fā)明提供了 5個(gè)干擾USP14基因的有效靶點(diǎn)(具體如SEQ ID NO:1-5所示)，構(gòu)建了特異干擾人USP14基因的慢病毒。
[0073]同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)一種人USP14基因RNAi慢病毒(USPH-RNAi)及其制備與應(yīng)用。
[0074]本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低USP14基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，USP14基因是一個(gè)原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，USP14基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的USP14基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0075]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京:科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0076]實(shí)施例1針對(duì)人USP14基因RNAi慢病毒的制備
[0077]1.篩選針對(duì)人USP14基因的有效的siRNA靶點(diǎn)
[0078]從Genbank調(diào)取USP14 (NM_005151)基因信息；利用上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)USP14基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。在USP14基因的編碼序列(CDS)區(qū)域內(nèi)，每隔一個(gè)堿基起始獲得21個(gè)堿基的序列，表1列出了其中5條針對(duì)USP14基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。
[0079]表1靶向于人USP14基因的siRNA靶點(diǎn)序列
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的人USP14基因在制備或篩選肺癌、乳腺癌之任一腫瘤治療藥物中的用途。
2.一種降低腫瘤細(xì)胞中USP14基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含: a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與USP14基因雜交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與USP14基因雜交的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與USP14基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與USP14基因中的靶序列基本相同。
4.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述USP14基因的靶序列含有SEQ ID NO: 1-5 中任一序列。
5.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA，該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO:17所示。
6.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:18所示。
7.—種USP14基因干擾核酸構(gòu)建體,含有編碼權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA。
8.如權(quán)利要求7所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體為干擾慢病毒載體。
9.如權(quán)利要求8所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自:
pLK0.l-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,
pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、
pLK0.1-puro-CMV-TagYFP, pLK0.1-puro-CMV-TagRFP,pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、
pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP>pLK0.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO-puro-1PTG-lxLacO、
pLK0-puro-1PTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、
pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、
pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL_GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任
o
10.一種USP14基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求8-9任一權(quán)利要求所述干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。
11.一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求7-9任一權(quán)利要求所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求10所述的USP14基因干擾慢病毒。
12.權(quán)利要求11所述藥物組合物在制備治療肺癌或乳腺癌的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
13.一種用于降低腫瘤細(xì)胞中USP14基因表達(dá)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:存在于容器中的，權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求7-9任一權(quán)利要求所述USP14基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求10所述的USP14基因干擾慢病毒。`
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103623427SQ201210313795
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月29日
【發(fā)明者】朱向瑩, 孫琴, 高博, 謝勝華, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司