專利名稱：旋毛蟲與腫瘤相關(guān)蛋白基因制備方法和醫(yī)用用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤相關(guān)蛋白基因及其制備方法，本發(fā)明還提供了該蛋白的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
旋毛蟲是一種寄生于人和多種動(dòng)物體內(nèi)的線蟲，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但對(duì)其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據(jù)報(bào)導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)異體鑒識(shí)物比較敏感， 異體抗原物所產(chǎn)生的免疫細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤具有抵抗力。旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因蛋白能產(chǎn)生針對(duì)腫瘤強(qiáng)的特異性和非特異性免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因，為一種新的蛋白基因物質(zhì)，具有生物活性。本發(fā)明還提供了該相關(guān)基因蛋白的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該蛋白的醫(yī)用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。本發(fā)明公開的旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因，如SEQ ID NO. 1所示。具有以下表征
本基因蛋白是通過(guò)利用抗SP2/0高免血清對(duì)旋毛蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選獲得的，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，得到全序列長(zhǎng)有569bp，含有411bp的開放性閱讀框，起始密碼子ATG， 終止密碼子TGA，將其ORF命名為TS411。編碼136個(gè)氨基酸。推測(cè)它的分子量(MW)為15.6 KD。根據(jù)滴定曲線推測(cè)其等電點(diǎn)(pi Jsolectric Point)為10.56。測(cè)序結(jié)果經(jīng)登陸NCBI BLAST核酸同源性檢索為旋毛蟲基因，與旋毛蟲核糖體蛋白SM基因的同源性為99%。ORF中有兩個(gè)堿基存在差異，分別是地135位的C-A， 第327位達(dá)到A-G，對(duì)應(yīng)的氨基酸有一位存在差異，即45位的Asp-Glu，第109位是同義突變。應(yīng)用DNAMar軟件對(duì)TS411蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其存在六個(gè)潛在的抗原表位位點(diǎn)。本發(fā)明相關(guān)蛋白基因的制備方法如下
利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽(yáng)性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性血清間存在相關(guān)抗原；利用SP2/0 高免血清對(duì)旋毛蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到本相關(guān)蛋白基因。下述的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明蛋白基因具有顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，可以作為制備抗腫瘤藥物被應(yīng)用。旋毛蟲與腫瘤相關(guān)蛋白基因抗腫瘤效果
將18 22g的BalB/C小鼠隨機(jī)分為TS411原核表達(dá)蛋白肌肉免疫組、TS411原核表達(dá)蛋白腹腔免疫組、TS411真核質(zhì)粒免疫組、PBS對(duì)照組，免疫佐劑對(duì)照組，pVAX-Ι質(zhì)粒對(duì)照組，每組10只。分別將原核表達(dá)的相關(guān)抗原200μβ與等量的弗氏完全佐劑乳化均勻，肌肉/腹腔免疫。將真核質(zhì)粒IOOPg (WgAi)與等量的司本甘油佐劑均勻混合，肌肉注射。兩周后，分別以加入等體積的弗氏不完全佐劑進(jìn)行第二次肌肉/ 腹腔免疫。將真核質(zhì)粒IOOPg (WgAi)與等量的司本甘油佐劑均勻混合，肌肉注射。各照組則與實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行首免和第二次免疫。按分組情況，第二次免疫后三天于每只小鼠的右后肢皮下注射接種1 X IO6個(gè)SP2/0細(xì)胞。荷瘤30d后，頸椎脫白處死各個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠，并進(jìn)行腫瘤體積、重量等物理指標(biāo)的測(cè)定以及⑶3+、⑶4+、⑶8+、⑶19+等免疫指標(biāo)的檢測(cè)。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均利用SPSS 14.0 for Windows軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)差異顯著性?？鼓[瘤試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明
TS411基因真核質(zhì)粒免疫組、TS411基因原核表達(dá)蛋白腹腔免疫組、TS411基因原核表達(dá)蛋白肌肉免疫組的體內(nèi)平均抑瘤率分別為28. 3%, 24. 7%, 21. 3%。接種相關(guān)蛋白基因?qū)嶒?yàn)組的瘤重顯著低于空白對(duì)照組(P<0. 01)，各組蛋白基因的抗腫瘤情況見表1)。方差分析結(jié)果表明各組瘤重有顯著差異。組間檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同免疫途徑的抑瘤率沒(méi)有顯著差異。表1相關(guān)蛋白基因?qū)P2/0骨髓瘤細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤重量和腫瘤體積的影響( 士 s，n=10)
權(quán)利要求
1.一種旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因，如SEQ ID NO. 1所示。
2.如權(quán)利要求1所述相關(guān)基因蛋白的制備方法，包括以下步驟利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽(yáng)性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性血清間存在相關(guān)抗原；利用SP2/0高免血清對(duì)旋毛蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到相關(guān)蛋白基因。
3.旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因用于制備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)確定腫瘤細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽(yáng)性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性血清間存在相關(guān)抗原；利用SP2/0 高免血清對(duì)旋毛蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到本相關(guān)蛋白基因。提供的旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因，為一種新的蛋白基因物質(zhì)；腫瘤細(xì)胞對(duì)異體鑒識(shí)物比較敏感，旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因能產(chǎn)生針對(duì)腫瘤強(qiáng)的特異性和非特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原易于制備和工業(yè)化。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102433343SQ20111042199
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者任保彥, 宮鵬濤, 張國(guó)才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 程柏淇, 陳玉江 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)