一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法。屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法利用銅鹽熱變性除去大部分雜蛋白，離心后經(jīng)過微濾除菌及雜質(zhì)，利用超濾進(jìn)行濃縮、除鹽及小分子雜蛋白，陰離子交換層析純化后，冷凍干燥，超氧化物歧化酶的純度可達(dá)到92％，活性為3170U/mg。本發(fā)明在分離過程中未使用有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，操作簡單，成本低廉，適于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法
(—)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)能及時有效地清除機(jī)體內(nèi)的超氧自由基，使生物體能夠避免氧化損傷，是生物體抵御活性氧毒害作用的第一道防線，具有抗輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥等功能。目前SOD酶已作為一種保健醫(yī)藥產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品等行業(yè)，具有非常廣闊的市場。
[0003]市場上流通的SOD大多是從動物血液中提取的，容易受到污染，產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素，引起熱源性問題，研制開發(fā)重組人超氧化物歧化酶不僅可解決人源SOD來源有限和因血制品污染而帶來的安全性問題，而且可避免異源SOD在臨床應(yīng)用時可能出現(xiàn)的免疫性過敏反應(yīng)。傳統(tǒng)的SOD純化方法較繁瑣且費(fèi)時費(fèi)力，SOD產(chǎn)率較低、生產(chǎn)成本昂貴，不利于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。因此開發(fā)其他更安全、更經(jīng)濟(jì)的提取或分離方法取代傳統(tǒng)SOD生產(chǎn)方法具有十分重要的意義。本發(fā)明將含有人源SOD基因的工程菌進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，高壓勻質(zhì)破碎后進(jìn)行熱變性，離心超濾后進(jìn)行層析，克服了以現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法。
[0005](四)技術(shù)方案
[0006]本發(fā)明涉及一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法。屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法利用銅鹽熱變性除去大部分雜蛋白，離心后經(jīng)過微濾除菌及雜質(zhì)，利用超濾進(jìn)行濃縮、除鹽及小分子雜蛋白，陰離子層析純化后，冷凍干燥。操作簡單，成本低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0007]具體操作步驟為:
[0008](I)將含有人源超氧化物歧化酶基因的大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液用管式離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速:16000r/min,流速:0.6-0.8mL/min,收集菌體,按照菌體濕重與純水體積1: 10比例懸浮，用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，破碎壓力為880bar，破碎一次；
[0009](2) 在破碎后混合液中加入2% -6%體積的lOmmol/L的CuCl2溶液，通入螺旋管加熱器中進(jìn)行熱變性，熱變性溫度65-80°C，時間:10-30min。離心，收集上清；
[0010](3)膜處理，將步驟2所得上清液依次通過5 μ m的預(yù)處理膜、0.22 μ m濾膜、6kDa超濾膜；
[0011](4) DEAE-SephadexA50 柱層析,用 2.5_50mmoL/L 的 pH 7.6 的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD活力的洗脫液，超濾濃縮后，冷凍干燥，用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性?！緦＠綀D】

【附圖說明】:
圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中CuCl2濃度對SOD活性影響的示意圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中熱變性溫度及時間對SOD活性的影響的示意圖。
(四)【具體實(shí)施方式】
[0012]下面通過具體實(shí)例應(yīng)用，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
[0013]實(shí)施例1: [0014]將60L發(fā)酵液用管式離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速:16000rpm,流速0.6-0.8mL/min,收集發(fā)酵后的菌體，按照菌體濕重與純水體積1: 10比例懸浮，用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，破碎壓力為880bar，破碎一次。在破碎后混合液中分別加入2%、3%、4%、5%、6%體積的10mmol/L的CuCl2后通入螺旋管加熱器中，65°C，20min。離心后，棄去沉淀。上清液進(jìn)行膜處理，首先通過5 μ m預(yù)處理膜除去雜質(zhì)，細(xì)胞碎片；然后過0.22 μ m濾膜，除去雜菌；最后用6kDa的超濾膜進(jìn)行處理，除鹽及小分子雜蛋白，濃縮至15L。濃縮液進(jìn)行DEAE-S印hadeXA50柱層析，用
2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD活力的洗脫液，超濾濃縮后，將所得溶液冷凍干燥得到SOD精品。從圖1中可以看出SOD活性可達(dá)到2700U/mg以上。
[0015]實(shí)施例2:
[0016]
[0017]
[0018]將60L發(fā)酵液用管式離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速:16000rpm,流速:0.6-0.8mL/min,收集發(fā)酵后的菌體，按照菌體濕重與純水體積1: 10比例懸浮，高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，破碎壓力為880bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5%體積的lOmmol/L的CuCl2后通入螺旋管加熱器中，設(shè)置溫度為650C、70°C、75°C ,80°C,控制蠕動泵速度，使其從進(jìn)到出時間分別控制為10min、15min、20min、25min、30min,離心后，棄去沉淀。上清液進(jìn)行膜處理，首先通過5 μ m預(yù)處理膜除去雜質(zhì)，細(xì)胞碎片；然后過0.22 μ m濾膜，除去雜菌；最后用6kDa的超濾膜進(jìn)行處理，除鹽及小分子雜蛋白，濃縮至15L。濃縮液進(jìn)行DEAE-S^hadex A50柱層析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD活力的洗脫液，超濾濃縮后，將所得溶液冷凍干燥得到SOD精品。從圖中看出熱變性溫度為70°C，時間為15min時，SOD活性最高為3170U/mg。
[0019]實(shí)施例3:
[0020]
[0021]
[0022]將60L發(fā)酵液用管式離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速:16000rpm,流速0.6-0.8mL/min:收集發(fā)酵后的菌體，按照菌體濕重與純水體積1: 10比例懸浮，高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，破碎壓力為800bar，破碎一次。在破碎后混合液中加入5%體積的lOmmol/L的CuCl2后通入螺旋管加熱器中，設(shè)置溫度為70°C，控制蠕動泵速度，使其從進(jìn)到出時間在15min，離心后，棄去沉淀。上清液進(jìn)行膜處理，首先通過5 μ m預(yù)處理膜除去雜質(zhì)，細(xì)胞碎片；然后過0.22 μ m濾膜，除去雜菌；最后用6kDa的超濾膜進(jìn)行處理，除鹽及小分子雜蛋白，濃縮至15L。濃縮液進(jìn)行分別用DEAE-32和DEAE-S印hadex A50柱層析，用2.5-50mmol/L的pH 7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD活力的洗脫液，超濾濃縮后，將所得溶液冷凍干燥得到SOD精品。活性可達(dá)到3170U/mg，純度92%以上。
[0023]層析純化效果比較
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法。將發(fā)酵后的菌體高壓勻質(zhì)破碎，熱變性后離心取上清、微濾及超濾濃縮、層析超濾濃縮，冷凍干燥得到超氧化物歧化酶產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:熱處理時加入5%體積的lOmmol/L的CuCl2溶液，熱變性溫度和時間分別為:70°C，15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:采用預(yù)5 μ m的柱子精密過濾，0.22 μ m的柱子微孔過濾、6kDa超濾膜超濾濃縮、除鹽及雜蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人源超氧化物歧化酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:利用DEAE-S印hadexA50柱層析，用2.5-50mmol/L的pH = 7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集具有SOD活力 的洗脫液，超濾濃縮后，冷凍干燥。
【文檔編號】C12R1/19GK103627683SQ201210312833
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月30日
【發(fā)明者】劉欽松, 王紹文, 劉勇, 尹萌萌, 王德金, 李小剛, 張叢叢, 劉孟剛, 尚艷艷, 李華利 申請人:山東博奧克生物科技有限公司