專利名稱：一種粘紅酵母油脂基因工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種粘紅酵母高產油脂基因工程菌的構建方法。
背景技術：
粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres. ) Harrison)是一種重要的產油微生物，可以產生微生物油脂和其他活性物質，類胡蘿卜素，L-苯丙氨酸，SOD等，并在一定條件下，產生a-丙氨酸和谷氨酸。由于其營養(yǎng)要求簡單、粗放，可用蔗渣、廢糖蜜等作為培養(yǎng)基質，成本較低。尤其是其脂質含量明顯高于其他產油微生物，近年來人們越來越專注于其產油功能的開發(fā)研究，并對其發(fā)酵工藝進行了研究，使粘紅酵母產油量獲得了一定的提高。但是 靠外在的生長環(huán)境的改變使其產油量獲得更高的提升顯然不現(xiàn)實。目前對于產油粘紅酵母基因工程改造方面的研究較為匱乏，還未見有文獻報道將產油相關基因導入粘紅酵母內表達，對于粘紅酵母基因工程改造的資料也幾乎處于空白。產油微生物油脂合成代謝調控過程有兩個關鍵酶，檸檬酸裂解酶(ACL)和蘋果酸酶(ME) (Adams IP,et al. The distinctiveness of ATP:citratelyase fromAspergillus nidulans. Biochem Biophys Acta, 2002),大量研究表明，產油微生物油月旨積累的多少與ME的代謝調控有關，如果ME受到抑制，則油脂積累下降。這是因為雖然微生物代謝途徑中有許多生成NADPH的過程，但FAS幾乎只能利用由ME產生的NADPH(Wynn JP,etal. The role ofmalic enzymein the regulation of lipid accumulationin filamentous fungi. Microbiology, 1999)。研究表明，以卷枝毛霉為模式有機體，在蘋果酸酶活性的特異性抑制劑芝麻酚的作用下，其脂肪積累量從25%下降到2%，而其菌體生長沒有任何負面的影響(Song Y，et al. A pregenetic study of the isoformsof malic enzyme associated with lipid accumulation in Mucor circinelloides.Microbiology, 2001.)。進一步證實了 ME的活性與脂肪積累量之間存在直接的相關性。因此，如果能鑒定和分離產油微生物的ME基因，就可以利用基因工程手段甚至化學生物學手段選擇性調控蘋果酸酶的活性，提高微生物產油能力。rDNA在酵母基因組中有100-200個重復單兀(Scopione RC, et al. A new promoter probe vector for Saccharomteescerevisiae using fungal glucoamylase cDNA as the reporter gene. Yeast, 1993.),以rDNA為同源整合的靶順序構建的載體，既克服了通常整合載體只有單拷貝或幾個拷貝的局限，同時又保留整合載體穩(wěn)定性好的特點，所以是一類用于表達外源基因理想的載體系統(tǒng)。目前這種策略已成功在多種微生物中構建并實現(xiàn)表達應用，如Bacillus subtilis、Saccharomy cerevisiae、Pichia pastoris、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Phaffa rhodozyma、Hansenula Polymorpha、Arxula adeninivorans 等(Jens K, CornelisPH, etal. Integration of heterologous genes in several yeast species usingvectors containing a Hansenula polymorpha-derived rDNA-targeting element.FEMS Yeast Research, 2003 ；Mahadtanapuk S,etal. Cloning of antifungal gene fromBacillus licheniformis by application of low energy ion beam bombardment.Surface&Coatings Technology,2009.)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種粘紅酵母野生菌株(Rhodotorulaglutinis)。本發(fā)明的目的還在于提供一種粘紅酵母野生菌株的構建方法，以提高粘紅酵母的
產油量。本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母野生菌株的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了粘紅酵母GM4 (Rhodotorulaglutinis GM4)，于2012年6月5日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2012203。 本發(fā)明的技術方案還在于采用了一種粘紅酵母高產油脂基因工程菌的構建方法，利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強啟動子基因PGKl和卷枝毛霉的蘋果酸酶基因ME構建成表達載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內獲得高效表達，其基因工程菌的構建的具體步驟如下A、目的基因的獲取(I)采用珠磨與酚氯仿結合法提取粘紅酵母的總基因組DNA ;將提取的總DNA純化后點樣于1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，此基因組模板分裝后于_20°C保存，并用于后序的PCR反應；根據(jù)粘紅酵母基因組中rDNA的保守序列設計了兩對引物擴增26SrDNA D1/D2片段和5. 8SrDNA-ITS 片段；(2)以卷枝毛霉基因組為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中蘋果酸酶同源保守的氨基酸序列設計簡并引物，引物設計如下Fr5’ -AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3’ 如 SEQ IDN0. 2 所示Rr5’ -CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3’ 如 SEQ IDN0. 3 所示PCR擴增得到大小為2. Ikb的ME基因片段，通過A-T克隆插入pMD_T質粒載體，獲得pMD-ME，轉入E. coli DH5 a，篩選陽性轉化子，經XhoI和NotI消化轉入pPICZ-E，構建pPICZ-ME載體；(3)強啟動子PGKl的獲取及載體的構建提取釀酒酵母YS58基因組DNA，根據(jù)PGKl基因保守序列設計引物擴增啟動子PGKl基因，引物設計如下Fr :5’ -ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3’ 如 SEQ IDN0. 4 所示EcoRIRr :5’ -TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3’ 如 SEQ IDN0. 5 所示BamHI將PCR擴增的PGKI基因純化后直接與PMD18-T載體連接，連接產物經乙醇沉淀純化后電轉化感受態(tài)細胞DH5a，經驗證結果為陽性的克隆再抽提質粒進行酶切驗證；B、同源重組表達載體pPICZ-rD-ME的構建將ME基因酶切連接到質粒pPICZ-rD上，構建多順反子并與抗性基因Zeocin共用一個PGKl啟動子和CYCl終止子；構建的同源重組載體pPICZ-rD-ME轉化粘紅酵母菌，能整合到染色體上，便可同時表達ME基因和抗性基因。步驟(I)擴增26SrDNA D1/D2片段的一對引物為26SrDNA D1/D2 NL-I :5，-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3，如 SEQ IDN0. 6 所示26SrDNA D1/D2 NL-4 :5，-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3，。如 SEQ IDN0. 7 所
示步驟(I)擴增5. 8SrDNA-ITS片段的一對引物為5. 8SrDNA-ITS(l):5，-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ 如 SEQ IDN0. 8 所示5. 8SrDNA-ITS(2): 5’ -GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。如 SEQ IDN0. 9 所示所述的A中步驟3)中在含有氨節(jié)青霉素、x_Gal、IPTG的LB平板上篩選白色菌落進行菌落PCR驗證，驗證結果為陽性的克隆。rDNA的PCR擴增條件94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，此過程共計35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。rDNA的PCR擴增反應體系
反應物川S (ML)
10Xl>CR huITer2.5
dNTPs ( 2, SiiiboLL-I )4
丨物 I ( IOjj iiol. L-I)I
引物 2 ( IOm mol. I-I)I
粘紅酵_.墻園泔校板I
TaqDNA 聚 ( BI. }j L-1)0. 3
dd"2015. 2
總體枳25B. PGKl的PCR擴增條件為94°C 預變性 4min，94°C變性 lmin，54°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，30 個循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin。PGKl的PCR擴增反應體系為反應物fflS (M i-)
IOXFCR buffer5
dNTPs5
上游引物0.7 下游引物0.7
隨灑_母基_組模扳0.4
TaqIMA 聚合_0.4
ddH2037.8
總體積50C. ME基因的PCR擴增條件為94°C 預變性 5min，94°C 變性 lmin，544°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，30 個循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin。ME基因的 PCR擴增反應體系為
反應物用量(M L)
IOXPCR bufferS
dM'Ps5
.l-r游引物0.7
下游引物0.7
卷枝毛霉0. 4TaqDNA 聚合_(J. 4
ddH2037,8
總體積50。同源重組載體pPICZ-rD-ME的基因序列表如SEQ IDNO. I所示。首先通過利用XhoI和NotI雙酶切同源重組載體pPICZ-rD-ME。表I重組載體pPICZ-rD-ME的雙酶切體系反應物用量(M L)
pPICZ-rD-ME (25ng. p L-1)15
Xhol2
NotI2
IOXK buffer6
0. 1%BSA5
總體積24
酶切反應在37°C水浴反應3h。載體pPICZ-rD-ME雙酶切體系的回收純化采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和PCR產物直接純化試劑盒純化回收。本發(fā)明的技術方案還采用了一種粘紅酵母的篩選和培養(yǎng)方法，其方法的具體步驟如下I)粘紅酵母篩選菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用Yro培養(yǎng)基，并通過蘇丹黑染色法進行產油量的初篩；通過熱酸-有機溶劑法進一步定量確定候選菌株的產油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產油脂菌株，通過形態(tài)學生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過測定其26SrDNADl/D2區(qū)域序列，進一步確定該微生物為粘紅酵母；2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵96h，發(fā)酵結束經離心收集菌體。所述粘紅酵母篩選過程中26SrDNADl/D2區(qū)域序列為序列表中的SEQ IDN0. I。所述粘紅酵母培養(yǎng)中活化培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH值為6. 8 7. 2。所述粘紅酵母培養(yǎng)中液體種子培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH2PO4O. 7%, Na2HPO4O. 25%, MgSO4. 7H200. 15%, pH 值為 6. 8 7. 2。所述粘紅酵母培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH2PO4O. 7%，Na2HPO4O. 25%, MgSO4. 7H200. 15%, CaCl2O. 015%, FeCl3. 6H200. 015%, ZnSO4. 7H200. 002%, MnSO4.H2OO. 006%, (MM)2SO4O. 05%, pH6. 0。本發(fā)明的技術方案還采用了一種粘紅酵母高產油脂基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產微生物油脂方面的應用。另夕卜，本發(fā)明的技術方案還采用了一種粘紅酵母高產油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產功能性油脂方面的應用。通過5L發(fā)酵罐小試培養(yǎng)，表明導入ME和PGKl后的粘紅酵母菌，相對于野生菌株，其蘋果酸酶活性提高了 3. 6倍，脂質含量從27%提高到68%，生物量從15%提高到33%。同時，脂質積累的穩(wěn)定期，轉化菌株較野生菌株提前5. 5小時，而脂質積累的穩(wěn)定期也相對野生菌株延長了 2小時。轉化菌株的脂肪酸代謝中不飽和脂肪酸含量尤其是Y-亞麻酸的含量增加顯著，提高了 13%。轉化菌株在非選擇培養(yǎng)條件下，連續(xù)生長50世代質粒穩(wěn)定性為99. 86%。由此可見，該基因工程菌株能夠在強啟動子PGKl帶動下穩(wěn)定地表達外源基因ME，從而實現(xiàn)脂質在粘紅酵母內的快速積累。發(fā)酵罐小試培養(yǎng)的具體的實驗操作過程①首先發(fā)酵培養(yǎng)基的配制酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，pH6. 0，裝樣量為4L。②對發(fā)酵培養(yǎng)基進行滅菌處理，121°C滅菌30min。③滅菌結束，設定培養(yǎng)條件30°C，180rpm,空氣流量為每分鐘0. 5個罐體體積。并通過2mol. L-I的KOH或2mol. L-I的HCl自動添加使pH維持在5. 5 6. 5。④按10%接種量的接種量接入粘紅酵母種子培養(yǎng)液。培養(yǎng)96h。⑤發(fā)酵結束，管式離心機18000rpm離心收集菌體。測定生物量和脂質含量。本發(fā)明主要根據(jù)酵母較易發(fā)生同源重組的特點，利用染色體DNA中多拷貝串聯(lián)的 兩段rDNA單位序列作為整合載體同源重組靶位點，以提高外源基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，構建出兼具多拷貝數(shù)和高穩(wěn)定性雙重優(yōu)點的新型整合型載體。通過本發(fā)明的提供了一種構建rDNA介導的多拷貝整合表達載體，以適用對粘紅酵母野生株的分子生物學操作，提高外源基因的穩(wěn)定性和表達水平。在了解微生物油脂合成代謝的基礎上，通過導入脂質合成代謝的關鍵酶基因和強啟動子，能夠調控脂質代謝，提高油脂產量。本發(fā)明的粘紅酵母高產油脂基因工程菌是應用粘紅酵母工程菌株生產微生物油脂微生物油脂可以廣泛應用于生物柴油的生產。生物柴油是以動植物油脂為原料生產的柴油替代品，基本成分是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。來源麥麩、秸桿、玉米等有機農作物。生物柴油燃料是一種高脂酸甲烷，它是通過以不飽和油酸C18為主要成分的甘油脂分解而獲得的。與常規(guī)柴油相比，生物柴油具有下述無法比擬的性能(I)具有優(yōu)良的環(huán)保特性(2)具有較好的低溫發(fā)動機啟動性能(3)具有較好的潤滑性能(4)具有較好的安全性能(5)具有良好的燃料性能(6)具有可再生性能(7)無須改動柴油機，可直接添加使用，同時無需另添設加油設備、儲存設備及人員的特殊技術訓練(8)生物柴油以一定比例與石化柴油調和使用，可以降低油耗、提高動力性，并降低尾氣污染另外，本發(fā)明的粘紅酵母高產油脂基因工程菌應用粘紅酵母工程菌株生產功能性油脂，可制成相關保健品和藥品功能性油脂是一類對人體健康具有重要作用的脂質，主要是一些多不飽和脂肪酸，目前多不飽和脂肪酸主要來源于動植物油脂，因而產量不高，受到季節(jié)，原料和生長周期等的影響較大。而微生物油脂因其生產和提取較為便捷，生產方便，成本低廉，克服了動植物油脂來源單一和高昂的缺點。說明書附I為粘紅酵母菌落圖(孟加拉紅平板)；圖2為粘紅酵母菌落圖(LB平板)；圖3為膠回收載體pPICZ-rD-ME雙酶切目的片段；圖中1、2、3為目的片段，經測定，其大小為2. Ikb左右，與ME基因大小相吻合?？梢源_定該目的基因ME也成功插入載體；圖4為載體構建流程圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明作具體的說明。實施例I本發(fā)明所用的微生物為粘紅酵母野生菌株，為本發(fā)明人從自然界篩選獲得，其具體的篩選方法為菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基(蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂(MgSO4 *7H20)0. 5g,瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液IOOmL,蒸餾水IOOOmL,氯霉素0. Igo )，發(fā)酵培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，并通過蘇丹黑染色法 進行產油量的初篩；通過熱酸-有機溶劑法進一步定量確定候選菌株的產油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產油脂菌株，通過形態(tài)學生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過測定其26SrDNA D1/D2區(qū)域序列，進一步確定該微生物為粘紅酵母。I)粘紅酵母生理生化特性在孟加拉紅培養(yǎng)基(圖I)上生長，菌體形態(tài)為卵圓形，菌落凸起，邊緣整齊，菌落橙紅或微帶橘紅色，表面可由光滑到褶皺，有光澤，菌落正背面顏色一致。多邊芽殖，有明顯的紅色或黃色色素，因生莢膜而形成粘質狀菌落，無酒精發(fā)酵能力，可產生脂肪。2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨I0/?！咸烟?%，瓊脂2%，自然pH)上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，自然pH)的250mL三角瓶中，28°C振蕩(150rpm)培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，PH6. 0)的250mL三角瓶中，于28°C振蕩(150rpm)發(fā)酵96h。發(fā)酵結束經離心收集菌體并測定生物量和脂質含量。粘紅酵母生理生化特性在LB培養(yǎng)基(圖2)上生長，菌體形態(tài)為卵圓形，直徑3飛mm，菌落凸起，邊緣整齊，菌落橘紅色或黃色，表面可由光滑帶有光澤，菌落正背面顏色一致。在LB平板上生長的菌落相對于孟加拉紅平板上生長的菌落要小。多邊芽殖，有明顯的紅色或黃色色素，因生莢膜而形成粘質狀菌落，無酒精發(fā)酵能力，可產生脂肪。 發(fā)酵結束經離心收集菌體并測定生物量和脂質含量測定生物量和脂質含量
權利要求
1.一種粘紅酵母高產油脂基因工程菌GM4 (Rhodotorula glutinis),其特征在于保藏編號為CCTCC N0:M2012203。
2.一種如權利要求I所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌的構建方法，其特征在于利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強啟動子基因PGKl和卷枝毛霉的蘋果酸酶基因ME構建成表達載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內獲得高效表達，其基因工程菌構建的具體步驟如下 A、目的基因的獲取 (1)采用珠磨與酚氯仿結合法提取粘紅酵母的總基因組DNA;將提取的總DNA純化后點樣于1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，此基因組模板分裝后于-20°C保存，并用于后序的PCR反應；根據(jù)粘紅酵母基因組中rDNA的保守序列設計了兩對引物擴增26SrDNA D1/D2片段和.5.8SrDNA-ITS 片段； (2)以卷枝毛霉基因組為模板，根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中蘋果酸酶同源保守的氨基酸序列設計簡并引物，引物設計如下Frl 5’-AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3’Rrl 5’-CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3’ PCR擴增得到大小為2. Ikb的ME基因片段，通過A-T克隆插入pMD-T質粒載體，獲得PMD-ME，轉入E. coli DH5 a，篩選陽性轉化子，經XhoI和NotI消化轉入pPICZ-E,構建 pPICZ-ME 載體； (3)強啟動子PGKl的獲取及載體的構建 提取釀酒酵母YS58基因組DNA，根據(jù)PGKl基因保守序列設計引物擴增啟動子PGKl基因，引物設計如下Fr2 :5’-ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3’EcoRIRr2 :5’-TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3’BamHI 將PCR擴增的PGKI基因純化后直接與pMD18-T載體連接，連接產物經乙醇沉淀純化后電轉化感受態(tài)細胞DH5a，經驗證結果為陽性的克隆再抽提質粒進行酶切驗證； B、同源重組表達載體pPICZ-rD-ME的構建 將ME基因酶切連接到質粒pPICZ-rD上，構建多順反子并與抗性基因Zeocin共用一個PGKl啟動子和CYCl終止子；構建的同源重組載體pPICZ-rD-ME轉化粘紅酵母菌，能整合到染色體上，便可同時表達ME基因和抗性基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌的構建方法，其特征在于步驟(I)擴增26SrDNA D1/D2片段的一對引物為26SrDNA D1/D2 NL-I :5’-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3’26SrDNA D1/D2 NL-4 :5’-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3’。
4.根據(jù)權利要求2所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌的構建方法，其特征在于步驟(I)擴增5. 8SrDNA-ITS片段的一對引物為. 5.8SrDNA-ITS(l):.5’-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’.5.8SrDNA-ITS(2):.5’-GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 。
5.根據(jù)權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述的A中步驟(3)中在含有氨芐青霉素、x-Gal、IPTG的LB平板上篩選白色菌落進行菌落PCR驗證，驗證結果為陽性的克隆。
6.一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，其特征在于其方法的具體步驟如下 .1)粘紅酵母篩選菌株初篩采用孟加拉紅培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用Yro培養(yǎng)基，并通過蘇丹黑染色法進行產油量的初篩；通過熱酸-有機溶劑法進一步定量確定候選菌株的產油量高低；兩輪篩選之后，獲得一株高產油脂菌株，通過形態(tài)學生理生化鑒定，初步判斷這是一株酵母菌；通過測定其26SrDNADl/D2區(qū)域序列，進一步確定該微生物為粘紅酵母； .2)粘紅酵母培養(yǎng)條件將粘紅酵母保藏斜面移接到活化培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵96h，發(fā)酵結束經離心收集菌體。
7.根據(jù)權利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述粘紅酵母培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉 1%，蛋白胨 1%，葡萄糖 4%, KH2PO4O. 7%, Na2HPO4O. 25%,MgSO4. 7H200. 15%, CaCl2O. 015%,FeCl3. 6H200. 015%, ZnSO4. 7H200. 002%, MnSO4. H2OO. 006%, (NH4)2SO4O. 05%, pH6. 0。
8.—種如權利要求I所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產微生物油脂方面的應用。
9.一種如權利要求I所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產功能性油脂方面的應用。
10.一種如權利要求I所述的粘紅酵母高產油脂基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在食品方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種粘紅酵母油脂基因工程菌及其構建方法和應用，其基因工程菌的構建方法主要利用粘紅酵母rDNA為同源整合的靶序列，將釀酒酵母的強啟動子基因PGK1和卷毛枝霉的蘋果酸酶基因ME構建成表達載體引入粘紅酵母，使ME基因在粘紅酵母體內獲得高效表達，轉化株脂質含量較野生菌株提高2.5倍。本發(fā)明在了解微生物油脂合成代謝的基礎上，通過導入脂質合成代謝的關鍵酶基因和強啟動子，將為調控脂質代謝，提高油脂產量。該基因工程菌株可應用于微生物油脂的生產和功能性油脂相關產品的開發(fā)，如藥品，保健品等。
文檔編號A23L1/30GK102796675SQ201210222018
公開日2012年11月28日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年6月29日
發(fā)明者孫晗笑, 王一楊, 李智, 孫晗蓄, 馮麗霞, 孫長偉, 匡超, 周瑞秒 申請人:南陽奇?zhèn)ノ⑸鷳B(tài)基因科技開發(fā)有限公司