一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其基因工程菌的構(gòu)建方法主要將油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2基因和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶vfDGAT2構(gòu)建融合表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)。與未轉(zhuǎn)基因粘紅酵母相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因粘紅酵母轉(zhuǎn)化子油脂含量提高2.76倍，亞油酸含量提高25.86%。
【專利說明】一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一種重要的工業(yè)菌株，可以生產(chǎn)微生物油脂和其他活性物質(zhì)，包括類胡蘿卜素、L-苯丙氨酸、過氧化物歧化酶，近年來日益受到營養(yǎng)學(xué)家和藥理學(xué)家的重視。
[0003]目前對于產(chǎn)油粘紅酵母基因工程改良的報(bào)道不多，特別是以提高亞油酸含量為目的，并且同時(shí)提高含油量的基因工程改良還未有報(bào)道，而亞油酸是人體的必需氨基酸，因此提高粘紅酵母油脂含量特別是亞油酸的含量有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，以提高粘紅酵母油脂及亞油酸的含量。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種粘紅酵母油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，將油桐油酸脫氫酶基因 vfFAD2基因和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶vfDGAT2構(gòu)建融合表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，其基因工程菌構(gòu)建的具體步驟如下:
[0006](I)采用同源序列克隆方法，以油桐基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收純化，進(jìn)行TA克隆，并測序，獲得目的基因 vfFAD2，vfDGAT2 ；
[0007](2)利用耦聯(lián)小肽將目的基因vfFAD2與vfDGAT2耦聯(lián)；
[0008](3)將vfFAD2-vfDGAT2與表達(dá)載體pCAMBIA1301重組，獲得重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2, PCR驗(yàn)證、酶切、測序驗(yàn)證重組載體；
[0009](4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2轉(zhuǎn)化粘紅酵母，將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含60 μ g.mL-1鏈霉素,200 μ g.mL_l頭孢霉素和100 μ g.mL_l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300 μ g.mL-1頭孢霉素，150 μ g.mL-1卡那霉素的SM II平板上劃線，培養(yǎng)3_5d后，能正常生長的初步認(rèn)定為陽性轉(zhuǎn)化子；
[0010](5)提取基因組DNA、PCR驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母轉(zhuǎn)化子的篩選方法，首先用60 μ g.mL-1鏈霉素，200 μ g.mL-1頭孢霉素和100 μ g.mL-1卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5d后，再將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300 μ g.mL-1頭孢霉素，150 μ g.mL-1卡那霉素的SM II平板上劃線篩選，最后提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，具體步驟如下:將粘紅酵母保藏斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按1:10的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵72h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體；種子培養(yǎng)基:15g.L-1葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉,2g.L—1 (NH4)2SO4, 7g.L-1KH2PO4, 2g.L-1Na2HPO4,1.5g.L^1MgSO4,PH5.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基:50g.L—1 葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉，2.5g.T1(NH4)2SO4Jg.L^1KH2PO4,2g.L-1Na2HPO4, 2g.L-1MgSO4,0.1g.L^1CaCl2j0.07g.L-1FeCl3, PH5.5。[0013]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在食品方面的應(yīng)用。
[0016]說明書附圖:
[0017]圖1.vfFAD2, vfDGAT2 基因的獲得；
[0018]圖2.重組質(zhì)粒 pCAMBIA1301-FAD2-2A-DGAT2 的 PCR 驗(yàn)證，I:FAD2 ；2:DGAT2 ；3:FAD2+2A+DGAT2 ；4:空載對照；5:DNA Marker ；
[0019]圖3.FAD2/DGAT2轉(zhuǎn)化子的抗生素篩選及PCR驗(yàn)證。a:SM I平板篩選；b:SM II平板篩選；c:使用 FAD2-F/R 引物；d:使用 DGAT2-F/R 引物；M:DNA marker2000 ;1_3:FAD2/DGAT2酵母轉(zhuǎn)化子；4:野生型酵母；
[0020]圖4.共表達(dá)酵母中FAD2與DGAT2基因的表達(dá)分析。a:FAD2基因的表達(dá)；d:DGAT2基因的表達(dá)；
[0021]圖5.FAD2/DGAT2共表達(dá)酵母的脂肪酸組成分析。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1、FAD2-DGAT2重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0023](I)基因的獲得
[0024]根據(jù)NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登錄號(hào):AF525534)，利用分子生物學(xué)分析軟件01igo6.0設(shè)計(jì)引物:
[0025]VF2a:5’ TATCTTCAGGTTGGGCAACGA3’ ；
[0026]VF2b:5’ CGATTGAACGGCCTACATTAT3’。
[0027]DGAT2-F:5’ -CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3’
[0028]DGAT2-R:5’ -TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3’
[0029]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 lmin，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。1%瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1。
[0030]目的片段回收及與pMD18_T simple vector連接:
[0031]將PCR擴(kuò)增得到的vfFAD2目的片段進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18_T simplevector 連接:
【權(quán)利要求】
1.一種粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2基因和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶vfDGAT2構(gòu)建融合表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，其基因工程菌構(gòu)建的具體步驟如下: (1)粘紅酵母進(jìn)行活化和培養(yǎng)； (2)利用同源克隆法，根據(jù)GenBank上已知序列，以油桐基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收純化，進(jìn)行TA克隆，并測序，獲得目的基因vfFAD2，vfDGAT2 ； (3)利用耦聯(lián)小肽，將vfFAD2與vfDGAT2耦聯(lián)，再與表達(dá)載體pCAMBIA1301重組，獲得重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2- vfDGAT2，酶切、測序驗(yàn)證重組載體； (4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2轉(zhuǎn)化粘紅酵母，將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL-l頭孢霉素和100 μ g*mL-l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300μ g*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線，培養(yǎng)3_5 d后，能正常生長的初步認(rèn)定為陽性轉(zhuǎn)化子；提取基因組DNA、PCR驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子； (5)氣相色譜法檢測結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因粘紅酵母相比，轉(zhuǎn)基因粘紅酵母轉(zhuǎn)化子油脂含量提高2.76倍，亞油酸含量提高25.86%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中擴(kuò)增引物為:
FAD2-Y:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；`
FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
DGA T2-V: 5，-CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3，
DGA T2-R: 5，-TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3， PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘紅酵母生產(chǎn)高亞油酸含量的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4) 60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL_l頭孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300μ g*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線篩選初步獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證進(jìn)一步鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。
4.一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，其特征在于，將粘紅酵母保藏斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按1:10的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體；種子培養(yǎng)基:15 g.!/1葡萄糖，I g.!/1酵母粉，2g*L^ (NH4)2SO4, 7 g.171 KH2PO4, 2 g*L^1Na2HPO4,1.5 g.171 MgSO4, PH 5.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基:50g.L—1 葡萄糖，1 8噸_1酵母粉,2.5 g.L—1 (NH4)2SO4, 7 g.L—1 KH2PO4, 2 g.L—1 Na2HPO4, 2 g.L—1MgSO4,0.1 g.1^CaCly0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。
5.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103509817SQ201310421519
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】汪陽東, 陳益存 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所