專(zhuān)利名稱(chēng)：一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺組織受到微生物感染而引起的一種炎癥，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，該病廣泛存在于世界各地，為奶牛常見(jiàn)病、多發(fā)病，是造成乳制品業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌為主，這三種細(xì)菌引起的奶牛乳房炎占總發(fā)病率的90%以上。
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當(dāng)前奶牛乳房炎的治療方法主要是采用抗生素治療，抗生素用于治療奶牛乳房炎已有50多年的歷史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于長(zhǎng)期單一的、大劑量的不科學(xué)使用抗生素，引起了敏感性細(xì)菌的消除，耐藥性細(xì)菌逐漸占了主流，尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致了抗生素治療收效甚微。利用疫苗來(lái)防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預(yù)防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的嚴(yán)重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不會(huì)存在乳汁中抗生素殘留問(wèn)題；最后是操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉。當(dāng)前，研制成功的疫苗很少，絕大多數(shù)為第一代完整菌體疫苗，效果不明顯。因此，研制一種新型的奶牛乳房炎疫苗，預(yù)防和治療奶牛乳房炎是目前亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法。本發(fā)明的一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、金黃色葡萄球菌毒素制備a、用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得培養(yǎng)液；吸取IOii L的培養(yǎng)液于血液瓊脂平板培養(yǎng)基上涂布均勻，在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h后,挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；挑取一接種環(huán)金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在37°C條件下振蕩培養(yǎng)18^24h,即為種子液；b、將步驟a得到的種子液按體積百分含量為1% 3%的接種量接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基內(nèi)，然后在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為18(T250r/min的條件下培養(yǎng)18 24h后，在3000r/min的條件下離心30min,同時(shí)收集上清液與沉淀,收集的上清液即為金黃色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，備用；二、金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素制備C、取步驟一制得的金黃色葡萄球菌毒素，以IN的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5 8. 5，然后加甲醛至甲醛體積濃度為0. 2%5%，置于37°C培養(yǎng)箱中解毒3 7d，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液；d、將步驟c得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液用濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中加入醫(yī)用氯化鈉至氯化鈉質(zhì)量濃度為10% 20%，然后以2N的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2. (T4. 0，靜置過(guò)夜；e、將步驟d過(guò)夜處理后的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀再用無(wú)菌重蒸水離心洗滌沉淀f 2次，收集洗滌后的沉淀溶于pH為6. 5^8. 5的磷酸緩沖液中，再次在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀并向沉淀中加入質(zhì)量濃度為I %的硫柳汞溶液至硫柳汞質(zhì)量濃度為0. 01%，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素；其中，磷酸緩沖液與金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液體積比為1:15 30 ；三、金黃色葡萄球菌菌體蛋白的制備 取步驟一中收集的沉淀，用0 4°C無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，取上清，收集沉淀，將收集的沉淀和無(wú)菌玻璃珠按質(zhì)量比為1:3飛的比例放入無(wú)菌勻漿杯中混合，再加入(T4°C無(wú)菌生理鹽水至杯滿(mǎn)，采用勻漿器在溫度為5°C，轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下振動(dòng)12min，然后在轉(zhuǎn)速為14000r/min，溫度為5°C的條件下離心40min，收集上清液，用0. 5N的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至3. (T5. 0，再次在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為5°C的條件下離心30min,收集沉淀，裝入透析袋中，經(jīng)48、6h流水透析，即得金黃色葡萄球菌菌體蛋白；四、無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備制備菌量為I. 5^3. O X IO9的無(wú)乳鏈球菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆?；五、大腸桿菌菌苗的制備制備菌量為I. 5^3. O X IO9的大腸桿菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫涣?、奶牛乳房炎疫苗的制備將步驟二得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素、步驟三得到的金黃色葡萄球菌菌體蛋白、步驟四得到的無(wú)乳鏈球菌菌苗和步驟五得到的大腸桿菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素的效價(jià)為1(T30U，金黃色葡萄球菌菌體蛋白的蛋白質(zhì)含量為20(T400 u g，無(wú)乳鏈球菌的菌數(shù)為I. 5^3. O X IO9,大腸桿菌的菌數(shù)為I. 5 3. O XlO9。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用引起奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株，將提取、精制而成的有效功能成分金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素及菌體蛋白、無(wú)乳鏈球菌菌苗、大腸桿菌菌苗合理配伍，構(gòu)建成一種新型奶牛乳房炎疫苗。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明研制的疫苗具有安全、無(wú)毒、較高的免疫力等特點(diǎn)，對(duì)金黃色葡萄球菌攻毒組小白鼠的保護(hù)率達(dá)到了 93.3%，對(duì)無(wú)乳鏈球菌及大腸桿菌攻毒組小白鼠的保護(hù)率也在80%以上，且新型疫苗的免疫力效果均好于單一組分疫苗的免疫力效果(金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素疫苗保護(hù)率為73. 3% ;金黃色葡萄球菌菌體蛋白疫苗保護(hù)率為56. 7% ;無(wú)乳鏈球菌菌苗保護(hù)率為66. 7% ;大腸桿菌菌苗保護(hù)率為70%)。這也充分證實(shí)了金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素和菌體蛋白配伍，可顯著提高機(jī)體產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌抗體的水平，而且類(lèi)毒素和菌體蛋白不僅具有特異性免疫效果(針對(duì)金黃色葡萄球菌)，還具有非特異性免疫效果(通過(guò)增加白細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌產(chǎn)生吞噬、清理等作用)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、金黃色葡萄球菌毒素制備a、用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得培 養(yǎng)液；吸取IOii L的培養(yǎng)液于血液瓊脂平板培養(yǎng)基上涂布均勻，在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h后,挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；挑取一接種環(huán)金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在37°C條件下振蕩培養(yǎng)18^24h,即為種子液山、將步驟a得到的種子液按體積百分含量為1% 3%的接種量接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基內(nèi)，然后在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為18(T250r/min的條件下培養(yǎng)18 24h后，在3000r/min的條件下離心30min,同時(shí)收集上清液與沉淀，收集的上清液即為金黃色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，備用；二、金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素制備C、取步驟一制得的金黃色葡萄球菌毒素，以IN的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5 8. 5，然后加甲醛至甲醛體積濃度為0. 2%5%，置于37°C培養(yǎng)箱中解毒3 7d，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液；d、將步驟c得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液用濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中加入醫(yī)用氯化鈉至氯化鈉質(zhì)量濃度為10% 20%，然后以2N的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2. (T4. 0,靜置過(guò)夜；e、將步驟d過(guò)夜處理后的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀再用無(wú)菌重蒸水離心洗滌沉淀f 2次，收集洗滌后的沉淀溶于pH為6. 5 8. 5的磷酸緩沖液中，再次在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀并向沉淀中加入質(zhì)量濃度為I %的硫柳汞溶液至硫柳汞質(zhì)量濃度為0. 01%，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素；其中，磷酸緩沖液與金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液體積比為1:15 30 ；三、金黃色葡萄球菌菌體蛋白的制備取步驟一中收集的沉淀，用0 4°C無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，取上清，收集沉淀，將收集的沉淀和無(wú)菌玻璃珠按質(zhì)量比為1:3飛的比例放入無(wú)菌勻漿杯中混合，再加入(T4°C無(wú)菌生理鹽水至杯滿(mǎn)，采用勻漿器在溫度為5°C，轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下振動(dòng)12min，然后在轉(zhuǎn)速為14000r/min，溫度為5°C的條件下離心40min，收集上清液，用0. 5N的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至3. (T5. 0，再次在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為5°C的條件下離心30min,收集沉淀，裝入透析袋中，經(jīng)48、6h流水透析，即得金黃色葡萄球菌菌體蛋白；四、無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備制備菌量為I. 5^3. OX IO9的無(wú)乳鏈球菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫?五、大腸桿菌菌苗的制備制備菌量為I. 5^3. OX IO9的大腸桿菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆?；六、奶牛乳房炎疫苗的制備將步驟二得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素、步驟三得到的金黃色葡萄球菌菌體蛋白、步驟四得到的無(wú)乳鏈球菌菌苗和步驟五得到的大腸桿菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素的效價(jià)為1(T30U，金黃色葡萄球菌菌體蛋白的蛋白質(zhì)含量為20(T400 u g，無(wú)乳鏈球菌的菌數(shù)為I. 5^3. 0 X IO9,大腸桿菌的菌數(shù)為I. 5^3. OXlO90
本實(shí)施方式采用引起奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株，將提取、精制而成的有效功能成分金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素及菌體蛋白、無(wú)乳鏈球菌菌苗、大腸桿菌菌苗合理配伍，構(gòu)建成一種新型奶牛乳房炎疫苗。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明研制的疫苗具有安全、無(wú)毒、較高的免疫力等特點(diǎn)，對(duì)金黃色葡萄球菌攻毒組小白鼠的保護(hù)率達(dá)到了 93. 3 %，對(duì)無(wú)乳鏈球菌及大腸桿菌攻毒組小白鼠的保護(hù)率也在80%以上，且新型疫苗的免疫力效果均好于單一組分疫苗的免疫力效果(金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素疫苗保護(hù)率為73. 3% ;金黃色葡萄球菌菌體蛋白疫苗保護(hù)率為56. 7% ;無(wú)乳鏈球菌菌苗保護(hù)率為66. 7% ;大腸桿菌菌苗保護(hù)率為70%)。這也充分證實(shí)了金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素和菌體蛋白配伍，可顯著提高機(jī)體產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌抗體的水平，而且類(lèi)毒素和菌體蛋白不僅具有特異性免疫效果(針對(duì)金黃色葡萄球菌)，還具有非特異性免疫效果(通過(guò)增加白細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌產(chǎn)生吞噬、清理等作用)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一至步驟六所進(jìn)行的操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至二不同的是步驟一中所述的金黃色葡萄球菌毒素效價(jià)為1024 4096。其它與具體實(shí)施方式
一至二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟二中所述的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素效價(jià)為128 256。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟三中所述的金黃色葡萄球菌菌體蛋白中蛋白質(zhì)含量為l(T50mg/mL。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟三中所述的無(wú)菌玻璃珠為00.17~0.18mm。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟一中所述的產(chǎn)酸培養(yǎng)基組分為0. 3g的MgSO4 7H20、0. 2g的KCl, 3. Og的K2HPO4 3H20、2. Og的葡萄糖、2mL質(zhì)量濃度為10%的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制備方法為將牛肉絞碎，稱(chēng)取IOOOg,加入蒸懼水1500mL、l. 5g的Na2C03、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37°C培養(yǎng)箱中，用質(zhì)量濃度為4%的NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，消化36h，再用2N的HCL調(diào)節(jié)pH至4. 5，加熱至90°C，然后用雙層棉布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入體積濃度為2%氯仿混勻，即得牛肉消化液。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟四中所述的無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備方法如下a、取一接種環(huán)無(wú)乳鏈球菌，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基,然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,取無(wú)乳鏈球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL,接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上,涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h，即得無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物；b、用濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟a得到的無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至甲醛體積濃度為1.0% 1.2%，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f7d后，加入苯酚至終濃度為5. Og/L,最后置于4°C的冰箱中保存。其它與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟五中所述的大腸桿菌菌苗的制備方法如下a、取大腸桿菌一接種環(huán)，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,取一接種環(huán)大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL，接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h，即得大腸桿菌菌苗山、濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟a得到的大腸桿菌菌苗洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至甲醛體積濃度為1.0% 1.2%，置于37°C培養(yǎng)箱中f7d后，加入苯酚至終濃度為5.(^/1，最后置于41的冰箱中保存。其它與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。通過(guò)以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果本試驗(yàn)的一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、金黃色葡萄球菌毒素制備
a、用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得培養(yǎng)液；吸取IOii L的培養(yǎng)液于血液瓊脂平板培養(yǎng)基涂布均勻，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h后，得金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；取一接種環(huán)金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在37°C條件下振蕩培養(yǎng)24h，即為種子液山、將步驟a得到的種子液按體積百分含量為I %的接種量接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基內(nèi)，然后在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h后，在3000r/min的條件下離心30min，同時(shí)收集上清液與沉淀，收集的上清液即得金黃色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，備用；二、金黃色葡萄球菌毒素效價(jià)的測(cè)定取96孔酶標(biāo)板，在第一行的每孔中均加入0. ImL無(wú)菌生理鹽水，再吸取步驟一得到的金黃色葡萄球菌毒素0. ImL加入第I孔，用加樣槍反復(fù)吸打混合后，吸取0. ImL加入第2孔中，再次吸打混合均勻，以此方法倍比稀釋至第12孔，然后分別向每孔中加入用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次的濃度為I %新鮮兔紅血球0. lmL，置37°C培養(yǎng)箱中l(wèi)h，取出觀察，完全溶血的最大稀釋倍數(shù)，即為毒素效價(jià)，取效價(jià)大于等于1024單位的金黃色葡萄球菌毒，備用；三、金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素制備C、取步驟二制得的金黃色葡萄球菌毒素，以IN的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，然后加甲醛至甲醛體積濃度為0. 4%，置于37°C培養(yǎng)箱中解毒7d，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液；d、將步驟c得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液用濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中加入醫(yī)用氯化鈉至氯化鈉質(zhì)量濃度為15%，然后以2N的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，靜置過(guò)夜；e、將步驟d過(guò)夜處理后的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀再用無(wú)菌重蒸水離心洗滌沉淀I次，收集洗滌后的沉淀溶于pH為8. 0的磷酸緩沖液中，再次在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心IOmin,收集沉淀并向沉淀中加入質(zhì)量濃度為I %的硫柳萊溶液至硫柳汞質(zhì)量濃度為0.01%，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素；其中，磷酸緩沖液與金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液體積比為1:20 ;四、金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素效價(jià)的測(cè)定⑴抗毒血清制備選體重2公斤以上的健康家兔3飛只，從耳靜脈采血3mL，分離血清，測(cè)基礎(chǔ)抗體小于I :8的家兔進(jìn)行以下試驗(yàn)，在家兔后腿肌肉注射步驟三得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素ImL (效價(jià)10U)，以后每隔3天注射I次，共注射3次，7d后從耳靜脈采血3mL，分離血清，備用；
⑵抗毒血清效價(jià)測(cè)定取96孔酶標(biāo)板，向第一行的每孔中均加入0. ImL的無(wú)菌生理鹽水，在第I孔中加入步驟⑴分離的血清0. lmL，用加樣槍反復(fù)吸打混合后，吸取0. ImL加入第2孔中，再次吸打混合均勻，以此方法倍比稀釋至第12孔，然后向每孔中再加0. ImL金黃色葡萄球菌毒素(2U/mL),輕微震蕩混勻，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,然后向每孔中加用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次的體積濃度為I %新鮮兔紅血球0. lmL，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min后觀察，完全不溶血的最大稀釋倍數(shù)即為血清效價(jià)，重復(fù)測(cè)定一次，取效價(jià)為1:128以上的免疫家兔頸動(dòng)脈放血，分離血清，即為抗毒血清，加質(zhì)量濃度為0. 01%的硫柳汞，置于-20°C冰柜中保存?zhèn)溆?；⑶?lèi)毒素效價(jià)測(cè)定取96孔酶標(biāo)板，向第一行的每孔中均加入0. ImL無(wú)菌生理鹽水，再向第I孔中加入步驟三得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素0. lmL，用加樣槍反復(fù)吸打混合后，吸取0. ImL加入第2孔中，再次吸打混合均勻，以此方法倍比稀釋至第12孔，分別向每孔中加入步驟⑵得到的抗毒血清(2U/mL) 0. lmL，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，再向每孔中各加入0. ImL金黃色葡萄球菌毒素(2U/mL),輕微震蕩混勻,置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，再向每孔中加入用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次的體積濃度為I %新鮮兔紅血球0. lmL，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min后觀察，完全溶血的最大稀釋倍數(shù)即為金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素效價(jià)，取效價(jià)為128以上的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素，備用；五、金黃色葡萄球菌菌體蛋白的制備取步驟一中收集的沉淀，用4°C無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，取上清，收集沉淀，將收集的沉淀和無(wú)菌玻璃珠按質(zhì)量比為1:5的比例放入無(wú)菌勻漿杯中混合，再加入4°C無(wú)菌生理鹽水至杯滿(mǎn)，采用勻漿器在溫度為5°C，轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下振動(dòng)12min，然后在轉(zhuǎn)速為14000r/min，溫度為5°C的條件下離心40min，收集上清液，用0. 5N的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4. 5，再次在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為5°C的條件下離心30min，收集沉淀，裝入透析袋中，經(jīng)72h流水透析，即得金黃色葡萄球菌菌體蛋白；六、金黃色葡萄球菌菌體蛋白含量的測(cè)定用凱氏定氮法對(duì)菌體蛋白進(jìn)行含氮量的測(cè)定，取金黃色葡萄球菌菌體蛋白的蛋白質(zhì)含量為30mg/mL以上的金黃色葡萄球菌菌體蛋白備用；七、無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備f、取一接種環(huán)無(wú)乳鏈球菌，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,挑取一接種環(huán)直徑大于1_的單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取無(wú)乳鏈球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL,接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，即得無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物；g、用濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟f 得到的無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至體積濃度為I. 0 %，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，加入苯酚至濃度為5. Og/L，最后置于4°C的冰箱中保存；八、大腸桿菌菌苗的制備h、取大腸桿菌一接種環(huán)，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,挑取一接種環(huán)直徑大于1_的單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取一接種環(huán)大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL,接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，即得大腸桿菌菌苗；i、用濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟h得到的大腸桿菌菌苗洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至體積濃度為1.0%，置于37°C培養(yǎng)箱中7d后，加入苯酚至濃度為
5.Og/L,最后直于4 C的冰箱中保存；
九、奶牛乳房炎疫苗的制備將步驟二得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素、步驟三得到的金黃色葡萄球菌菌體蛋白、步驟四得到的無(wú)乳鏈球菌菌苗和步驟五得到的大腸桿菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，奶牛乳房炎疫苗每毫升含金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素效價(jià)為15U，金黃色葡萄球菌菌體蛋白的蛋白質(zhì)含量為375 u g，無(wú)乳鏈球菌菌數(shù)含量為2. 7 X IO9,大腸桿菌菌數(shù)含量為
2.7X109。 本試驗(yàn)從步驟一至步驟九均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
本試驗(yàn)步驟一中所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基組分為0. 3g的MgSO4 *7H20,0. 2g的KC1，3. Og的K2HPO4 3H20、2. Og的葡萄糖、2mL質(zhì)量百分含量為10 %的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制備方法為將牛肉絞碎，稱(chēng)取1000g，加入蒸餾水1500mL、l. 5g的Na2C03、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37°C培養(yǎng)箱中，用質(zhì)量濃度為4%的NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，消化36h，再用2N的HCL調(diào)節(jié)pH至4. 5，加熱至90°C，然后用雙層棉布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入體積濃度為2%氯仿混勻，即得牛肉消化液。產(chǎn)毒培養(yǎng)基制法將上述成分混合，加熱至完全熔化，調(diào)節(jié)pH值至7. 6,煮沸過(guò)濾，加活性炭2. Og,混均后分裝于250mL錐形瓶中，60mL /瓶，置于高壓蒸氣滅菌器內(nèi)，在115°C溫度下滅菌20min。本試驗(yàn)步驟七和步驟八中的無(wú)菌玻璃瓶和無(wú)菌絹布均是在180°C高溫滅菌2h使用的，目的是為了除去熱原質(zhì)。
本試驗(yàn)步驟五中加入4°C無(wú)菌生理鹽水至杯滿(mǎn)是為了使沉淀和無(wú)菌玻璃珠充分混勻，對(duì)加入的無(wú)菌生理鹽水量以及杯的體積無(wú)要求。本試驗(yàn)的營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)買(mǎi)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；血液瓊脂平板培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。本試驗(yàn)的金黃色葡萄球菌購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為ATCC25923 ;無(wú)乳鏈球菌購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為ATCC12386 ;大腸桿菌購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為ATCC25922。本試驗(yàn)的金黃色葡萄球菌毒素共生產(chǎn)8批，8批毒素的效價(jià)，最高者達(dá)到了 4096，最低者2048也遠(yuǎn)超過(guò)1024的標(biāo)準(zhǔn)，充分說(shuō)明了本項(xiàng)目在制備金黃色葡萄球菌毒素方面的技術(shù)是很成熟、穩(wěn)定的。本試驗(yàn)的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素共生產(chǎn)8批，8批類(lèi)毒素效價(jià)經(jīng)測(cè)定均為128或256，充分說(shuō)明了本項(xiàng)目在制備金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素方面的技術(shù)是很成熟、穩(wěn)定的。對(duì)本試驗(yàn)制得的奶牛乳房炎疫苗進(jìn)行檢定I)無(wú)菌試驗(yàn)在無(wú)菌環(huán)境下，分別向3組硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基內(nèi)接入奶牛乳房炎疫苗各lmL，在200C 25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4d，然后移種至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基各移種2管，每管0. 5mL ;取上述移種后的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基各I管置于30°C 35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其余各管置于20°C 25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)14d，觀察有無(wú)染菌情況；其中，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基組分為胰酪蛋白胨15g，酵母浸出粉5g，葡萄糖5g，氯化鈉2. 5g，L-胱氨酸0. 5g，硫乙醇酸鈉0. 5g，瓊脂0. 7g，0.2%美藍(lán)溶液I. OmL，蒸餾水lOOOmL。將上述組分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至7. 1，分裝，置于高壓蒸氣滅菌器內(nèi)，在115°C條件下滅菌20min后使用；改良馬丁培養(yǎng)基組分為葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，K2HPO4 3H201g,MgSO4 7H20 0. 5g，蒸餾水lOOOmL。制法將上述組分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至6. 4，分裝，置于高壓蒸氣滅菌器內(nèi)，在115°C條件下滅菌20min后使用；血液瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。 試驗(yàn)結(jié)果表明，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基中均沒(méi)有菌生長(zhǎng)，由此可知本發(fā)明的奶牛乳房炎疫苗無(wú)菌試驗(yàn)合格。2)安全試驗(yàn)選取體重為18 20g的健康小白鼠5只，在無(wú)菌環(huán)境下，向每只小鼠皮下注射奶牛乳房炎疫苗0. 5mL，逐日觀察至第7d，應(yīng)無(wú)由毒性物質(zhì)而引起的癥狀或死亡為合格。試驗(yàn)結(jié)果表明，全部試驗(yàn)小白鼠均無(wú)由毒性物質(zhì)而引起的癥狀，全部健存，由此可知，本發(fā)明的奶牛乳房炎疫苗具有安全可靠性。3)異常毒性試驗(yàn)選取體重為18 20g小白鼠5只，注射前稱(chēng)取每只小白鼠體重，在無(wú)菌環(huán)境下，向每只小鼠腹腔注射0. 5mL奶牛乳房炎疫苗，觀察7d，7d后每只小白鼠體重增加，即為合格的奶牛乳房炎疫苗。試驗(yàn)結(jié)果表明，在觀察期內(nèi)，試驗(yàn)小白鼠全部健存，無(wú)異常反應(yīng)，7d后每只小白鼠體重均增加，增加范圍在8 15g之間，由此可知，本發(fā)明的奶牛乳房炎疫苗疫苗異常毒性試驗(yàn)合格。4)熱原質(zhì)試驗(yàn)選取3只健康無(wú)傷、雌性無(wú)孕及體重為I. 5kg的家兔，試驗(yàn)所用的注射器、針頭及其他與供試液接觸的器皿洗凈后經(jīng)180°C高溫滅菌2h除去熱原質(zhì)，試驗(yàn)前家兔禁食2h以上，然后將家兔固定，3(T60min后開(kāi)始測(cè)量正常體溫，連續(xù)測(cè)量?jī)纱?，每次間隔60min，兩次溫差不得大于0. 2°C，以這兩次體溫的平均值為該兔的正常體溫；取奶牛乳房炎疫苗，在注射前預(yù)熱至38°C，測(cè)家兔達(dá)到正常體溫15min內(nèi)，向家兔耳靜脈緩緩注入3mL的奶牛乳房炎疫苗，每隔30min測(cè)量體溫一次，連測(cè)6次。試驗(yàn)結(jié)果表明，熱原質(zhì)試驗(yàn)3只家兔升溫均低于0. 6°C，并且3只兔升溫總和不超過(guò)I. 4°C，由此可知本發(fā)明的奶牛乳房炎疫苗疫苗熱原質(zhì)試驗(yàn)合格。5)奶牛乳房炎疫苗的免疫力試驗(yàn)免疫組I :經(jīng)奶牛乳房炎疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；免疫組2 :經(jīng)金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；免疫組3 :經(jīng)金黃色葡萄球菌菌體蛋白疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；免疫組4 :經(jīng)無(wú)乳鏈球菌菌苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；
免疫組5 :經(jīng)大腸桿菌菌苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；免疫組6 :經(jīng)奶牛乳房炎疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；免疫組7 :經(jīng)奶牛乳房炎疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠30只；對(duì)照組同批次未經(jīng)疫苗免疫、體重為14 16g小白鼠9組海組5只)。在無(wú)菌環(huán)境下，用上述疫苗分別免疫對(duì)應(yīng)組小白鼠，每只皮下注射0.5mL，連續(xù)注射2次，每次間隔7d，末次免疫10天后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)向免疫組I、免疫組2、免疫組3小白鼠每只腹腔注射IMLD (MLD為最小致死量，即在一定條件下足以使動(dòng)物死亡的最小量)的金黃色葡萄球菌(含于0. 5mL中)；向免疫組4小白鼠每只腹腔注射IMLD的無(wú)乳鏈球菌(含于0. 5mL中)；向免疫組5小白鼠每只腹腔注射IMLD的大腸桿菌(含于0. 5mL中)；向免疫組6小白鼠每只腹腔注射IMLD的無(wú)乳鏈球菌(含于0. 5mL中);向免疫組7小白鼠每只腹腔注射IMLD的大腸桿菌(含于0. 5mL中);分別向9組對(duì)照組小鼠腹腔分別注射2MLD、1MLD和 1/2MLD的毒菌(金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、大腸桿菌)，觀察3d。表I免疫力試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于奶牛乳房炎疫苗的制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的 一、金黃色葡萄球菌毒素制備 a、用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得培養(yǎng)液；吸取IOii L的培養(yǎng)液于血液瓊脂平板培養(yǎng)基上涂布均勻，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h后,挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h，得金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；挑取一接種環(huán)金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在37°C條件下振蕩培養(yǎng)18^24h,即為種子液；b、將步驟a得到的種子液按體積百分含量為1% ^3%的接種量接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基內(nèi)，然后在溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為18(T250r/min的條件下培養(yǎng)18 24h后，在3000r/min的條件下離心30min,同時(shí)收集上清液與沉淀，收集的上清液即為金黃色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，備用； 二、金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素制備 C、取步驟一制得的金黃色葡萄球菌毒素，以IN的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5 8. 5，然后加甲醛至甲醛體積濃度為0. 2% 0. 5%，置于37°C培養(yǎng)箱中解毒3 7d，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液；d、將步驟c得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液用濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中加入醫(yī)用氯化鈉至氯化鈉質(zhì)量濃度為10% 20%，然后以2N的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2. 0^4. 0，靜置過(guò)夜；e、將步驟d過(guò)夜處理后的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀再用無(wú)菌重蒸水離心洗滌沉淀f 2次，收集洗滌后的沉淀溶于pH為6.5^8. 5的磷酸緩沖液中，再次在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀并向沉淀中加入質(zhì)量濃度為I %的硫柳汞溶液至硫柳汞質(zhì)量濃度為0. 01%，即得金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素；其中，磷酸緩沖液與金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素原液體積比為1:15 30 ； 三、金黃色葡萄球菌菌體蛋白的制備 取步驟一中收集的沉淀，用0 4°C無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，取上清，收集沉淀，將收集的沉淀和無(wú)菌玻璃珠按質(zhì)量比為1:3飛的比例放入無(wú)菌勻漿杯中混合，再加入(T4°C無(wú)菌生理鹽水至杯滿(mǎn)，采用勻漿器在溫度為5°C，轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下振動(dòng)12min，然后在轉(zhuǎn)速為14000r/min，溫度為5°C的條件下離心40min，收集上清液，用0. 5N的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至3. (T5. 0，再次在轉(zhuǎn)速為7000r/min，溫度為5°C的條件下離心30min，收集沉淀，裝入透析袋中，經(jīng)48、6h流水透析，即得金黃色葡萄球菌菌體蛋白； 四、無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備 制備菌量為I. 5^3. OX IO9的無(wú)乳鏈球菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫? 五、大腸桿菌菌苗的制備 制備菌量為I. 5^3. OX IO9的大腸桿菌菌苗，置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆茫? 六、奶牛乳房炎疫苗的制備 將步驟二得到的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素、步驟三得到的金黃色葡萄球菌菌體蛋白、步驟四得到的無(wú)乳鏈球菌菌苗和步驟五得到的大腸桿菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素的效價(jià)為1(T30U，金黃色葡萄球菌菌體蛋白的蛋白質(zhì)含量為20(T400 u g，無(wú)乳鏈球菌的菌數(shù)為I. 5^3. 0 X IO9,大腸桿菌的菌數(shù)為 I. 5^3. OXlO90
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟一至步驟六所進(jìn)行的操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟一中所述的金黃色葡萄球菌毒素效價(jià)為1024 4096。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟二中所述的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素效價(jià)為128 256。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟三中所述的金黃色葡萄球菌菌體蛋白中蛋白質(zhì)含量為l(T50mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟三中所述的無(wú)菌玻璃珠為00.17-0.1 Smnu
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟一中所述的產(chǎn)酸培養(yǎng)基組分為:0. 3g 的 MgSO4 7H20、0. 2g 的 KCl, 3. Og 的 K2HPO4 3H20、2. Og 的葡萄糖、2mL質(zhì)量濃度為10%的胱氨酸、700mL的牛肉浸液和300mL的牛肉消化液；其中，牛肉消化液制備方法為將牛肉絞碎，稱(chēng)取IOOOg,加入蒸懼水1500mL、l. 5g的Na2C03、6g的胰酶和30mL的氯仿，置于37°C培養(yǎng)箱中，用質(zhì)量濃度為4%的NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，消化36h，再用2N的HCL調(diào)節(jié)pH至4. 5，加熱至90°C，然后用雙層棉布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入體積濃度為2%氯仿混勻，即得牛肉消化液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟四中所述的無(wú)乳鏈球菌菌苗的制備方法如下a、取一接種環(huán)無(wú)乳鏈球菌，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基，然后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,挑取一接種環(huán)直徑大于1_的單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,取無(wú)乳鏈球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL，接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h，即得無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物；b、用濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟a得到的無(wú)乳鏈球菌血液瓊脂斜面培養(yǎng)物洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至甲醛體積濃度為1.0% 1.2%，置于371培養(yǎng)箱中培養(yǎng)f7d后，加入苯酚至終濃度為5. Og/L，最后置于4°C的冰箱中保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟五中所述的大腸桿菌菌苗的制備方法如下a、取大腸桿菌一接種環(huán)，用分區(qū)劃線接種法接種于血液瓊脂平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,挑取一接種環(huán)直徑大于Imm的單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h,取一接種環(huán)大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物2mL,接種于血液瓊脂斜面培養(yǎng)基上，涂布均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h，即得大腸桿菌菌苗山、濃度為0. 02、. 2mol/L的無(wú)菌磷酸鹽生理鹽水將步驟a得到的大腸桿菌菌苗洗入無(wú)菌玻璃瓶中，然后用無(wú)菌絹布過(guò)濾，加入甲醛溶液至甲醛體積濃度為I. 0% I. 2%，置于37°C培養(yǎng)箱中f7d后，加入苯酚至終濃度為5. Og/L，最后置于4°C的冰箱中保存。
全文摘要
一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，它涉及一種疫苗的制備方法。本發(fā)明提供一種奶牛乳房炎疫苗的制備方法，方法為制備效價(jià)為1024以上的金黃色葡萄球菌毒素，效價(jià)為128以上的金黃色葡萄球菌類(lèi)毒素，金黃色葡萄球菌菌體蛋白，無(wú)乳鏈球菌菌苗和大腸桿菌菌苗，經(jīng)配伍后得到奶牛乳房炎疫苗。本發(fā)明的奶牛乳房炎疫苗是安全、無(wú)毒的，對(duì)攻毒組小白鼠的保護(hù)率達(dá)到了91.7％。本發(fā)明應(yīng)用于奶牛乳房炎防治領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/445GK102716475SQ20121022197
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者于沖, 夏海華, 孫建華, 曲曉軍, 李思明, 王金英 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所