專利名稱：一種制備甲殼素脫乙酰酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備甲殼素脫乙酰酶的方法，具體涉及一種通過生物發(fā)酵工藝用短柄梨孢帚霉brevicaulis)制備甲殼素脫乙酰酶的方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖及其衍生物可被廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品、化工、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)、高分子材料等許多領(lǐng)域，其主要來源于甲殼動(dòng)物、植物、微生物等。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；漠a(chǎn)物，一般把脫乙酰度大于70%的甲殼素稱為殼聚糖。甲殼素脫乙酰制備殼聚糖，國(guó)內(nèi)外大都采用45%Na0H在較高溫度下脫去乙?；?，該方法堿耗量大，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，產(chǎn) 品殼聚糖的特性不穩(wěn)定(如脫乙酰度不均勻、分子量變化大、乙?；诘奈恢貌荒芄潭?br> O在甲殼素酶法脫乙酰制備殼聚糖的過程中，常用的酶有甲殼素酶、殼聚糖酶、甲殼素脫乙酰酶，從其作用機(jī)制分析，甲殼素脫乙酰酶是專一性的用于甲殼素脫去乙?；拿福诿撘阴５倪^程中，不會(huì)切斷殼聚糖分子的的糖鏈，因此該酶在作用過程中不會(huì)降解甲殼素和殼聚糖。而甲殼素酶和殼聚糖酶甲殼素脫乙酰基的非專一性酶，甲殼素酶是甲殼素降解的專一性酶，殼聚糖酶是殼聚糖降解的專一性酶，這兩種酶不適合于用來作為脫去甲殼素乙酰基的酶。甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase, E. C. 3. 5. 41,以下簡(jiǎn)稱CDA)可以水解脫掉甲殼素上的乙?；?，因此，可以利用它代替現(xiàn)有的濃堿熱解法生產(chǎn)高質(zhì)量的殼聚糖；這不但可以解決目前殼聚糖生產(chǎn)中的環(huán)境污染問題，而且可以生產(chǎn)出某些用化學(xué)法不能生產(chǎn)的殼聚糖產(chǎn)品，如乙?；潭染鶆颉⒎肿恿糠植挤秶臍ぞ厶钱a(chǎn)品，以及具有特定乙?；恢玫臍ぞ厶堑取Ｗ?974 年,Araki Y.等最初從接合菌綱{Zygomycetes')的ifocor rouxii 中發(fā)現(xiàn)甲殼素脫乙酰酶以來，1982年Kauss等又從半知菌綱iPeuteromycetes)飽ColIetotrichum/化而^^/從/細(xì)應(yīng)中發(fā)現(xiàn)該酶的存在。在對(duì)幾種真菌的深入研究發(fā)現(xiàn)ifocor rouxii (魯氏毛霉)、仙Wia coerulea (藍(lán)色犁頭霉)、nidulans (構(gòu)巢曲霉)、兩株Colletotrichum lindemuthianum (菜豆毛盤抱)，Rhizopus oryzae (米根霉)，Mucorracemosus (總狀毛霉)和 Rhizopus nigricans (黑豐艮霉)Scopulari op si s brevicaulis(短柄梨孢帚霉)，Metarhizium anisopIiae (金龜子綠僵菌),Uromyces (單胞銹菌屬)及Saccharomyces cerevisiae (啤酒酵母),具有產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的能力。另外還發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌KiArio alginolyticus (腸炎弧菌)及仰況i7i5■(枯草芽孢桿菌)也具有產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的能力。除上述微生物能產(chǎn)生甲殼素脫乙酰酶以外，有一些寄生在動(dòng)、植物體內(nèi)的生物體也具有產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的能力，給動(dòng)、植物的生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生影響。在甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)生菌的選擇方面，Vadake R.從城市下水道的污泥中分離得到了一株具有產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶活力的細(xì)菌；MawT.等人通過紫外誘變改良Gongronella butIeri (卵孢球托霉)，通過改良來提高該菌株產(chǎn)殼聚糖的能力，紫外誘變后獲得了三株誘變菌株，他們的甲殼素脫乙酰酶的活力及殼聚糖的產(chǎn)量均提高了兩倍；黃惠莉等人從海洋泥土中分離出產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)酶適宜培養(yǎng)條件為pH4.0，添加金屬離子Ca2+，培養(yǎng)時(shí)間為80h，溫度為35°C，所得甲殼素脫乙酰酶作用的最適溫度為40°C 50°C,最適pH為4. 5^5. O之間。在甲殼素脫乙酰酶基因工程菌的構(gòu)建方面，Ken T.等人在甲殼素酶的信號(hào)序列的共同作用下,將Iindemuthianum的甲殼素脫乙酰酶的基因克隆到coli的細(xì)胞中形成重組體，以N-乙酰氨基葡萄糖的五聚體作底物，對(duì)比了重組體的表達(dá)產(chǎn)物與出發(fā)菌的產(chǎn)物的酶學(xué)特性，同時(shí)對(duì)重組體的表達(dá)產(chǎn)物甲殼素脫乙酰酶的C-端和N-端分別接上6個(gè)組氨酸序列和12個(gè)氨基酸序列，對(duì)修飾后的酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)k-作了研究，發(fā)現(xiàn)他們的脫乙酰特性比原始酶有了很大的改善，但脫乙酰效果降低，Shrestha B. '\% ColIetotrichumlindemu thi anum的甲殼素脫乙酰酶的基因克隆到/7ZcAia pas tor is中，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶進(jìn)行了分離和純化；Kafetzopoulos D.等人將兩種細(xì)菌的cDNA克隆到Mucor rouxii編碼甲殼素脫乙酰酶的mRNA中，對(duì)他們表達(dá)產(chǎn)生的甲殼素脫乙酰酶進(jìn)行分 離及特性和酶序列的研究；Martinou A.等}Saccharomyces cereFisiae (啤酒酵母)的甲殼素脫乙酰酶基因克隆到coli的細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)、純化，表達(dá)產(chǎn)生的酶的分子量為35 kDa，該酶以膠體甲殼素作為底物使，其最適溫度和pH分別為50°C和8. 0，催化脫乙酰的底物最小聚合度為2，催化活性被乙酸抑制，CoCl2可促進(jìn)酶的催化活力，從酶的N-末端切去12個(gè)氨基酸殘基或從C-末端切去27個(gè)氨基酸殘基，該酶徹底失去活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的能產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及參數(shù)，以及提供一種甲殼素脫乙酰酶的分離純化方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)反復(fù)研究，最終獲得了如下工藝路線
一種制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于將短柄梨孢帚霉(5bo/w/7aribrevicaulis)klCC 36840在PDA培養(yǎng)基的試管斜面上經(jīng)活化后，將其接入到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，使其在PH6. 5-7. 0，溫度27-29°C、轉(zhuǎn)速200_240rpm的搖床上發(fā)酵90-100小時(shí)，然后經(jīng)分離、鹽析、純化得甲殼素脫乙酰酶。上述制備甲殼素脫乙酰酶的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為3，6-0-羧甲基甲殼素2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%、K2HPO4 0. 1%、KC10. 05%、MgSO4 0. 05%、ZnSO4 0. 05%。上述制備甲殼素脫乙酰酶的方法，優(yōu)選地，所述分離、鹽析、純化步驟是將發(fā)酵產(chǎn)物離心分離出后用硫酸銨鹽析，再將鹽析產(chǎn)物離心分離后用Sephadex G_25和SephadexG-100純化。上述制備甲殼素脫乙酰酶的方法，所述發(fā)酵容器為300ml容積的三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為80ml。上述制備甲殼素脫乙酰酶的方法，發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的溫度為29°C，發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的初始PH值為6. 5-7. 0，產(chǎn)菌絲體的溫度為27'菌體繁殖的初始pH值為
6.50上述制備甲殼素脫乙酰酶的方法，所述發(fā)酵時(shí)間為96小時(shí)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備甲殼素脫乙酰酶的方法具有如下顯著的進(jìn)步性
I)經(jīng)檢測(cè)表明，經(jīng)本發(fā)明的發(fā)酵工藝使得短柄梨孢帚霉產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的效價(jià)高，每ml發(fā)酵液的活力單位最高可達(dá)36U，一個(gè)酶活單位(U)確定為以N-乙酰氨基殼六糖為底物，每分鐘產(chǎn)生l/^moI乙酰基為一個(gè)單位。2 )本發(fā)明通過大量試驗(yàn)篩選獲得了短柄梨孢帚霉產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的最佳條件，包括其最適碳源、氮源、主要原料分別為蔗糖、蛋白胨、3，6-0-羧甲基甲殼素，最適培養(yǎng)基 組成為(g/100ml) :3,6-0-羧甲基甲殼素 2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%, K2HPO4
0.1%, KCl 0. 05%,MgSO4 0.05%、ZnSO4 0.05%。它們的最適用量分別為 1%、0. 4%、2% ;最適產(chǎn)酶條件為溫度為29°C、初始pH為7. 0，在300ml三角瓶中最適培養(yǎng)基加量為80ml，最佳發(fā)酵時(shí)間為96h。3)采用了簡(jiǎn)單的三步法分離純化甲殼素脫乙酰酶，即(NH4)2SO4鹽析、SephadexG-25和S印hadex G-100分離純化，酶的純化倍數(shù)為74倍，酶的收率為37. 8%。4)本發(fā)明還提供了短柄梨孢帚霉甲殼素脫乙酰酶催化黑曲霉中甲殼素制備殼聚糖的工藝方法，且殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度80%以上。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I短柄梨孢帚霉(5bo/w/7ari發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶 將短柄梨孢帚霉iScopulariopsis brevicaulis ) ATCC 36840在含有PDA固體培
養(yǎng)基(培養(yǎng)基的制備及組成取新鮮未發(fā)芽的土豆200g,去皮,切成3mmX3mm的塊狀,加A 800-1000ml水，煮沸30min，然后用紗布過濾，濾液中加入蔗糖(或葡萄糖)20g，瓊脂15-20g,溶化后補(bǔ)水至1000ml,自然pH，分裝到試管中(每管5ml), 121°C滅菌30min,制成斜面)的試管斜面上，在27°C活化兩次。取一支活化的斜面菌種用3-5ml的無菌水洗下孢子，將孢子懸液接入到含有80ml發(fā)酵培養(yǎng)基(每IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基組成為3，6_0_羧甲基甲殼素 2g、蔗糖 lg、蛋白胨 0. 4g、NaNO3 0. 2g、K2HPO4 0. lg、KCl 0. 05g、MgSO4 0. 05g、ZnSO4
0.05g)的容積為300ml的三角瓶中，于29°C、200rpm的搖床上發(fā)酵96小時(shí)。測(cè)定發(fā)酵液中甲殼素脫乙酰酶的活力為36U/ml。發(fā)酵液中甲殼素脫乙酰酶的活力測(cè)定方法在試管中加入100// I 50mM pH7. 5Tris-HCl緩沖液，然后加入100// I含100// g N-乙酰氨基殼六糖的水溶液及50// I經(jīng)離心分離的發(fā)酵上清液，于30°C下反應(yīng)30min，加入250// I 5%KHS04終止反應(yīng)。在反應(yīng)液中加入250// I 5% NaNO2,間斷地?fù)u動(dòng) 15min，再加入 250// I 12. 5% (NH4) 2S04, 5min 后加入 250// I
0.5%3-甲基-苯并噻唑腙(MBTH),并在沸水中加熱3min,冷卻后加入250// I 0. 5% FeCl3,30min后于650nm處測(cè)定吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)氨基葡萄糖鹽酸鹽作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一個(gè)酶活單位為以N-乙酰氨基殼六糖為底物，每分鐘產(chǎn)生I// mo I乙?；鶠橐粋€(gè)單位。實(shí)施例2短柄梨孢帚霉(5bo/w/7ariopsis發(fā)酵液中甲殼素脫乙酰酶的分離純化
將上述發(fā)酵液1000ml，在4°C的條件下，于10，OOOXg離心30min，收集上清液800ml，向上清液中加入280g (NH4)2SO4,使(NH4)2SO4的濃度達(dá)到35% (W/V),待(NH4)2SO4完全溶解后靜置2h，于18，OOOXg離心30min，收集上清液750ml，向上清液中繼續(xù)加入337. 5g(NH4)2SO4,使溶液中(NH4)2SO4的濃度達(dá)到80%(W/V)，靜置18h后于20，OOOXg離心30min，收集沉淀物，沉淀物溶解到200ml的去離子水中，于20，OOOXg離心30 min去除不溶性固形物，收集上清液，上清液通過16mm X 80cm的Sephadex G_25柱脫鹽,上柱流速5ml/min,收集流出液至400ml,流出液經(jīng)過16mm X80cm的Sephadex G-100柱分離各種蛋白組分,分離柱用50mmol Tris-HCl洗脫,分段收集洗脫液,用蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)儀在280nm的條件下檢測(cè)每部分洗脫液的蛋白質(zhì)含量，測(cè)定每一組分甲殼素脫乙酰酶活力，將甲殼素脫乙酰酶活力較高的組分混合在一起，用IOOOOkDa的透析袋透析72h，透析后的酶液冷凍干燥即得酶粉。 實(shí)施例3短柄梨孢帚霉甲殼素脫乙酰酶催化黑曲霉中甲殼素制備殼聚糖
將15g黑曲霉中的甲殼素分散到800 ml 50 mmol Tris-HCl pH 7. 5的緩沖溶液中，加入0. 15-0. 30g上述甲殼素脫乙酰酶，在55°C下連續(xù)攪拌8h，在IOOOOXg的條件下離心20min收集固形物，固形物用IOOml的去離子水洗滌3次后，加入100ml 2% (W/V)醋酸溶液，在30°C下連續(xù)攪拌16h，在IOOOOXg的條件下離心20min收集上清液，向上清液中加入40%(ff/V) NaOH調(diào)整pH到9. 0，在12000 X g的條件下離心20min收集固形物，固形物分別用IOOml去離子水洗滌3次后，再用95% (V/V)乙醇洗滌3次并冷凍干燥即得殼聚糖，殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度80%以上。
權(quán)利要求
1.一種制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于將短柄梨孢帚霉(5bo/w/7aribrevicaulis)klCC 36840在PDA培養(yǎng)基的試管斜面上經(jīng)活化后，將其接入到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，使其在PH6. 5-7. 0，溫度27-29°C、轉(zhuǎn)速200_240rpm的搖床上發(fā)酵90-100小時(shí)，然后經(jīng)分離、鹽析、純化得甲殼素脫乙酰酶。
2.如權(quán)利要求I的制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為.3，6-0-羧甲基甲殼素 2%、蔗糖 1%、蛋白胨 0. 4%、NaNO3 0. 2%、K2HPO4 0. 1%、KC10. 05%、MgSO4.0.05%、ZnSO4 0. 05%。
3.如權(quán)利要求I的制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于所述分離、鹽析、純化步驟是將發(fā)酵產(chǎn)物離心分離出后用硫酸銨鹽析，再將鹽析產(chǎn)物離心分離后用Sephadex G_25和 Sephadex G-100 純化。
4.如權(quán)利要求I的制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵容器為300ml容積的三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為80ml。
5.如權(quán)利要求I的制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的溫度為29°C，發(fā)酵產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的初始pH值為6. 5-7. 0，產(chǎn)菌絲體的溫度為27°C，菌體繁殖的初始pH值為6.5。
6.如權(quán)利要求I的制備甲殼素脫乙酰酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵時(shí)間為96小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備甲殼素脫乙酰酶的方法，該方法用短柄梨孢帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)作甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)生菌，經(jīng)活化后將其接入到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，使其在pH值為6.5-7.0之間，溫度在27-29oC、轉(zhuǎn)速200-240rpm的搖床上發(fā)酵90-100小時(shí)，發(fā)酵液經(jīng)分離、鹽析、純化得甲殼素脫乙酰酶產(chǎn)品。利用本發(fā)明的方法制備的甲殼素脫乙酰酶每ml發(fā)酵液的活力單位最高可達(dá)36U。
文檔編號(hào)C12N9/80GK102676485SQ20121013496
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者王常高, 蔡俊, 鄭化 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)