專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水稻組蛋白脫乙酰化酶基因hdt701啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和水稻育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701編碼區(qū)上游啟動(dòng)子序列的克隆-水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子， 以及該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是指DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，通常位于編碼基因的上游。在啟動(dòng)子片段中存在大量的順式作用原件，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與順式作用原件結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄使基因具有時(shí)空表達(dá)特異性。所以啟動(dòng)子的分離和功能分析是基因工程研究的重要內(nèi)容。植物基因工程中常用到的啟動(dòng)子按其作用方式和功能分為3類(lèi)組成型、組織特異型以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在所有組織中都啟動(dòng)基因的表達(dá)，具有持續(xù)性、沒(méi)有時(shí)空特異性?；蚬こ讨谐Ｓ玫降挠心壳霸谥参锉磉_(dá)載體中常用的是組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子、玉米的WDiquitin啟動(dòng)子等。但是外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效地表達(dá)往往會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡。組織特異型啟動(dòng)子能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，增加局部表達(dá)量。這樣避免了基因過(guò)量表達(dá)對(duì)植物體造成的傷害，同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。所以近年組織特異型啟動(dòng)子的研究備受關(guān)注。近年來(lái)隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展獲得了很多轉(zhuǎn)基因植物包括很多糧食作物， 但是食品安全問(wèn)題卻制約了轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的推廣和發(fā)展。轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因在胚乳中表達(dá)致使外源蛋白在其中積累，是影響一些具有很好品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)展受限制的主要因素。針對(duì)這種現(xiàn)象，利用組織特異型啟動(dòng)子使外源基因只在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)而在人類(lèi)食用部分不表達(dá)以降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)是促進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物推廣的一個(gè)重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有組織特異性的水稻組蛋白脫乙?；富?HDT701啟動(dòng)子。本發(fā)明的水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子，其特征在于，其序列是下列核苷酸序列之一(a)序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)的DNA序列雜交并且具有相同功能的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)的DNA序列具有90%以上的同源性，并且也具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。本發(fā)明的如SEQ ID NO. 1所示的水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子，其順式作用原件分析如表1所示表1 水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子順式作用原件分析
類(lèi)位點(diǎn)名稱(chēng)信號(hào)序列功能個(gè)數(shù)型脅MYCCONSENSUSATCANNTGdehydration-responsive ^ABA18迫ACGTATERD1ACGTetiolation-induced, early responsive to dehydration8相CURECORECRGTACcopper-responseelement, oxygen-response14關(guān)GTl CONSENSUSGRWAAWlight-regulated,SA-inducible gene expression13響WRKY710STGACgibberellin signaling pathway,Pathogenesis-Related8應(yīng)GATABOXGATAlight regulated18元INRNTPSADBYTCANTYYLight-responsive7件BIHDIOSTGTCADisease Resistance Responses4組SORLIP1ATGCCACLight-Induced1織C.AC.TFTPPCA1YACTmesophyll,加強(qiáng) C4PEPC 酶活性35特DOFCOREZMAAAGendosperm specific;抑制 C4PEPC 啟動(dòng)子30異EBOXBNNAPACANNTGstorage-protein gene,anthocyanin biosynthesis18性ROOTMOTIFTAPOXlATATTactivate root-specific gene expression7相GTGANTG10GTGAanther/pollen-specific gene expression17關(guān)POLLEN1LELAT52AGAAApollen specific expression8元RYREPEATBNNAPACATGCAdeveloping plant embryos1件guard cell-specific植ADREACGTGADA-responsive2物ARRlATNGATTcytokinin-regulated20激MYBCORECNGTTRABA-independent4素WBOXATNPR1TTGAC(SA)-induced2響CGTCA-motifCGTCAJA-responsive1應(yīng)TCA-elementGAGAAGAATASA-responsive2元TGACG-motifTGACGJA-responsive0件 WBmBmBmsmsm.............................................................wrcmirffn^ggfflgsagsfflgg : .......................................................... ； ^mMVMVfmmxmxamxmmmfm^^^^mgmmmmmxmmn..-..-..-..-..-....................................................................
本發(fā)明將如SEQ ID NO. 1所示的水稻組蛋白脫乙酰化酶基因HDT701啟動(dòng)子插入到載體PCAMBIA1391Z的多克隆位點(diǎn)處形成由HDT701啟動(dòng)子啟動(dòng)⑶S基因表達(dá)的融合表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻成熟胚愈傷組織得到轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的 PCR檢測(cè)和⑶S染色，結(jié)果顯示我們已經(jīng)成功的把HDT701啟動(dòng)子整合到水稻基因中，并且 HDT701啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻除胚乳以外的器官中均有表達(dá)，由此說(shuō)明本發(fā)明的如SEQ ID NO. 1所示的序列是一個(gè)啟動(dòng)子，命名為水稻組蛋白脫乙酰化酶基因HDT701 啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻除胚乳以外的器官中均有表達(dá)，即在轉(zhuǎn)基因水稻中只是在部分器官組織中表達(dá)，由此說(shuō)明這個(gè)啟動(dòng)子有組織特異性，是一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體，其特征在于，含有水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種宿主菌，其特征在于，含有上述表達(dá)載體。所述的宿主菌優(yōu)選為農(nóng)桿菌EHA105。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子在啟動(dòng)下游目的基因在水稻中表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明從水稻中克隆出HDT701基因的啟動(dòng)子水稻組蛋白脫乙?；富?HDT701啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因在水稻中的部分器官中表達(dá)，是一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子，因此可將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程中，使的目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定的器官或組織部位積累，增加局部表達(dá)量，同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)，因此在轉(zhuǎn)基因工程中有良好的應(yīng)用前景。


圖1是HDT701啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物凝膠回收檢測(cè)圖，M為2KB分子量標(biāo)記，1為目的
產(chǎn)物條帶。圖2是雙元載體PCAMBIA1391Z的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是表達(dá)載體PCAMBIA1391Z-HDT701P構(gòu)建完成酶切檢測(cè)圖，M為2KB分子量標(biāo)記，1為Hindlll/spel酶切條帶，2為Hindlll/PstI酶切條帶。圖4是PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株圖，M為2KB分子量標(biāo)記，以1_8泳道為8棵轉(zhuǎn)基因植株葉片，野生型水稻葉片為第9泳道，轉(zhuǎn)基因的3、4、6、7號(hào)水稻都能得到399bp的 GUS目的條帶，野生型的作為陰性對(duì)照沒(méi)有得到目的條帶。圖5是HDT701基因在水稻幼根、幼葉、生殖期的根、生殖期的葉、莖以及穎殼中的半定量表達(dá)分析顯示圖，A為HDT701基因，B為Actin基因(登錄號(hào)為AK100267)，1為幼苗，2為莖，3為生殖期的葉，4為穎殼，5為生殖期的根，6為幼根。圖6是HDT701啟動(dòng)子融合⑶S染色轉(zhuǎn)基因材料的染色結(jié)果圖，1為莖，2為葉枕，3 為愈傷組織，4為穎殼，5為葉片，6為幼根，7為穎殼和花藥，8為生殖期的根，9為萌發(fā)不同天數(shù)的幼苗，10為成熟種子的穎殼，11為萌發(fā)的種子的胚乳。圖7是轉(zhuǎn)基因水稻幼根和幼葉半薄切片結(jié)果圖，1為幼根縱切圖，2為幼根橫切圖， 3為幼葉橫切圖。圖8是轉(zhuǎn)基因植株不同時(shí)期、不同組織器官⑶S蛋白相對(duì)活性比較圖。
圖9是轉(zhuǎn)基因植株不同器官受到冷脅迫后⑶S蛋白相對(duì)活性比較圖。圖10是轉(zhuǎn)基因植株受到各種脅迫后⑶S蛋白相對(duì)活性比較圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如質(zhì)粒的提取等是按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南或者按照制造商所建議的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，如DNA回收采用東盛生物公司的DNA凝膠回收試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)施例1 :0SHDT701基因的啟動(dòng)子HDT701啟動(dòng)子的克隆1、以水稻粳稻品種日本晴為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)CTAB法提取基因組DNA做為模板。2、根據(jù)NCBI上已知的水稻基因0SHDT701 (Genebank登錄號(hào)為AK072845)的序列， 取起始密碼子前面2KB設(shè)計(jì)引物，以粳稻品種日本晴的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物F 5，-TGAAGCTTTAAGGCGAATAAGCGAAAC-3，下游引物R 5，-CTCTGCAGGAAGAACCCTAGAAAAGAAA-3，PCR反應(yīng)按50ul體系進(jìn)行，反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58. 9 V 退火45s，72°C延伸2min，循環(huán)35次；72°C后延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離(圖1)后回收純化，然后克隆入載體PMD18-T中，在16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆進(jìn)行菌落 PCR鑒定，選取轉(zhuǎn)入了連有目的片段的pMDlS-Τ的陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到擴(kuò)增片段的序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示，片段大小為1844bp，將該序列命名為 HDT701。實(shí)施例2 :HDT701-GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆大量提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒和載體 PCAMBIA1391Z(其結(jié)構(gòu)如圖2所示)同時(shí)用HindIII和I^stI進(jìn)行酶切，回收目的片段、連接，即可得到以HDT701作為啟動(dòng)子，其下游基因?yàn)棰荢的表達(dá)載體PCAMBIA1391Z-HDT701P。 在HDT701P片段的700bp處有一個(gè)SpeI酶切位點(diǎn)，在PCAMBIA1391Z上沒(méi)有SpeI酶切位點(diǎn)， 所以用HindIII和SpeI酶切融合載體鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒會(huì)得到0. 7KB的小片段(圖3)。陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)入表達(dá)載體PCAMBIA1391Z-HDT701P的陽(yáng)性克隆用于水稻轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻成熟胚愈傷采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6 :27H82)將構(gòu)建好的植物融合表達(dá)載體PCAMBIA1391Z-HDT701P導(dǎo)入水稻粳稻品種中花11成熟胚的愈傷組織中獲得轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下1、愈傷組織誘導(dǎo)成熟的水稻種子去殼，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇處理lmin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的升汞溶液消毒15min ；滅菌水清洗種子3 5次，前幾次3-5min，最后一次lOmin。將消毒好的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上^TC暗室中培養(yǎng)2周。2、愈傷組織繼代接種兩周后將膨大的盾片從種子上切下來(lái)，轉(zhuǎn)入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，2周后挑選米黃色的顆粒狀的小愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周。3、預(yù)培養(yǎng)挑選一定大小的顆粒狀愈傷，放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上黑暗下預(yù)培養(yǎng)3天，溫度26。C。4、農(nóng)桿菌活化將實(shí)施例2的含構(gòu)建好的含有載體PCAMBIA1391Z-HDT701P的農(nóng)桿菌EHA105在帶有50mg/L卡那霉素和25mg/L硫酸鏈霉素的YM固體培養(yǎng)基(YM培養(yǎng)基屬于現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)基)上劃線，28°C倒置培養(yǎng)48小時(shí)；挑單菌落接種于含有相同抗生素的5ml YM液體培養(yǎng)基中搖床上培養(yǎng)Μ-4 ι，取Iml接種于30ml的相同抗生素的YM液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)使0D600 = 0. 6-0. 8，離心收集菌體，用加有200umol/L乙酰丁香酮(As)的AAM液體培養(yǎng)基重懸菌體，用于浸染。5、農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)3天的愈傷放入上述農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡15min，中間每隔幾分鐘震蕩一下，取出愈傷后用滅菌濾紙吸干多余菌液；然后接種在共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d，溫度22°C。6、愈傷的清洗和篩選用加有500mg/L頭孢霉素的滅菌水對(duì)共培養(yǎng)后的愈傷進(jìn)行清洗4_5次，前幾次每次4-5min，最后一次lOmin，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙吸干水分，將愈傷接入到篩選培養(yǎng)基上 ^TC暗培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。繼代兩次后在老愈傷上面會(huì)長(zhǎng)出新的抗性愈傷。7、分化及生根將長(zhǎng)到一定大小的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到加有ABA的預(yù)分化篩選培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7d,三層無(wú)菌濾紙上干燥3天后再轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基上，^TC光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至長(zhǎng)出小苗。將長(zhǎng)出的小苗轉(zhuǎn)入篩選生根培養(yǎng)基上生根。8、移栽將生根后的小苗拿到室溫條件下煉苗一周，然后種到花盆土中，正常管理。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定待轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)到一定大小后，剪取葉子CTAB法提取基因組DNA，并設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為F 5' -GGAGTGAAGAGTATCAGTGTGC-3’R 5，-GATAATCATCGCAAGACCG-3，。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸90s，循環(huán)30次；72°C后延lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. O %瓊脂糖凝膠電泳分離。預(yù)期PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)為399bp。結(jié)果如圖4所示，M為分子量標(biāo)記，以1-8泳道為8棵轉(zhuǎn)基因植株葉片，野生型水稻葉片為第9泳道，轉(zhuǎn)基因的3、4、6、7號(hào)水稻都能得到399bp的⑶S目的條帶(陽(yáng)性植株)，野生型的作為陰性對(duì)照沒(méi)有得到目的條帶。由此獲得轉(zhuǎn)入PCAMBIA1391Z-HDT701P 載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株。實(shí)施例5 半定量分析目的基因HDT701基因在水稻幼根、幼葉、生殖期的根、生殖期的葉、莖以及穎殼中的表達(dá)。
分別取水稻幼根、幼葉、生殖期的根、生殖期的葉、莖以及穎殼進(jìn)行RNA的提取，然后進(jìn)行半定量表達(dá)分析RNA的提取方法和半定量表達(dá)分析方法如下所用的引物序列F 5，-TGTGAGCCTGAAGATGAACG-3，，R 5' -GAGAGGGTTCCAATGACTAGC-3，1、RNA 的提取(Trizol 法)(1)取IOOmg各種器官組織，加液氮研磨成粉末狀。(2)加入Iml Trizol，室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。(3)加0. 2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)30s，室溫5min。(4) 12000rmp，4°C 離心，15min。(5)吸上層無(wú)色水相，移入另一 EP管中(約0. 5ml)。(6)加等體積異丙醇，-200C，30min。(7) 12000rmp，4°C離心，lOmin。在管底部可見(jiàn)微量RNA沉淀(8)棄上清，將離心管倒置于紙巾上，吸干水分；(9)加Iml 75%乙醇，棄上清(清洗兩次)，空氣干燥DNA ；(10)用含DNAaseI的水50 μ 1溶解，37°C放一小時(shí)，再加如550ul的DHPC水然后重復(fù)步驟3-11 ；(11)用 40 μ 1 DHPC 水溶解，-20°C，取 1 μ 1 加入 99 μ 1 DEPC 水測(cè) 0擬60/0擬80 ；(12)計(jì)算濃度與純度，-70°C保存。2、cDNA第一鏈的合成在RNase free的PCR管中配制下列溶液Total RNA1 μ gDEPC 處理 H2O補(bǔ)足 15. 5 μ 170°C水浴 lOmin，置冰上；再加入下列試劑
Oligo (dT)i5 Primer (0.5μ§/μ1)2μ1
dNTP Mix (IOmM)Ιμ
RNase inhibitor (40υ/μ1)0.5μ1
5 xM-MLV RT Buffer5μ1
M-MLV (200υ/μ1)Ιμ
DEPC處理H2O補(bǔ)足9.5μ1
8
上述混樣于37°C保溫lh，72°C IOmin滅酶活。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍用于PCR擴(kuò)增模板。3、PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系為
cDNA稀釋樣Iul
2 xMix Buffer10μ1
PrimerF (IOmM)Ιμ
PrimerR(IOmM)Ιμ
Taq polymerase(5U/ml)0.5μ1
ddWater至 20μ1RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性!Min ；94°C變性30sec，Tm值復(fù)性lmin，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳條帶經(jīng)密度掃描儀掃描得到待測(cè)基因與內(nèi)參基因條帶各自的峰面積積分值，計(jì)算各組樣品兩者的比值，結(jié)果如圖5所示，在所取得組織中目的基因 HDT701均有表達(dá)。實(shí)施例6 對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的⑶S染色分析分別取實(shí)施例4的轉(zhuǎn)入PCAMBIA1391Z-HDT701P載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉、 莖、根、穎殼以及萌發(fā)不同天數(shù)的種子浸入GUS染液中，37°C過(guò)夜，無(wú)水乙醇脫色后拍照觀察。如圖6所示，⑶S基因在水稻除胚乳以外的器官中均有表達(dá)。由此說(shuō)明，如SEQ ID NO. 1 所示序列的HDT701片段是一個(gè)啟動(dòng)子，命名為水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子， 該啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻除胚乳以外的器官中均有表達(dá)，即在轉(zhuǎn)基因水稻中該啟動(dòng)子只啟動(dòng)下游基因在部分器官組織中表達(dá)，由此說(shuō)明這個(gè)啟動(dòng)子具有組織特異性，是一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子。GUS 染液50mmol/L 磷酸鈉緩沖液(ρΗ7· 0)，5mmol/L K4Fe (CN) 6, 5mmol/L K3Fe(CN)6, IOmmo 1/L EDTA，0. 1% TritonX-100,1. Omg/mL X-Gluc0實(shí)施例7 對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行不同器官GUS蛋白相對(duì)活性的測(cè)定分別取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期的實(shí)施例4獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉、 葉鞘進(jìn)行GUS蛋白相對(duì)活性測(cè)定。⑶S蛋白相對(duì)活性測(cè)地方法如下(1)取0. Ig材料于1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末，加入600ul酶提取液。O) 13000rpm，4°C離心 lOmin，取上清。(3)取50ul的上清，加入50ul的滅菌去離子水中使終體積為lOOul，用考馬斯亮
藍(lán)法測(cè)定蛋白的含量。
(4)取50ul含⑶S的上清加入到450ul在37°C預(yù)熱的檢測(cè)液Qmrnol/L MUG溶液)中。迅速充分混勻，并立刻取出50ul加入到1950ul反應(yīng)終止液(0. 2mol/L Na2CO3), 將該管作為酶促反應(yīng)的0點(diǎn)。(5)然后分別在5min、10min、20min和30min分別取出50ul的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)入1950ul
的反應(yīng)終止液中。(6)用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值，計(jì)算反應(yīng)生成的MU的量；(7)計(jì)算樣品中GUS活性，GUS活性=單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位 pmolMU. mg-1. min-1)。GUS 酶提取液0. IM 磷酸緩沖液(PH7. 0)50ml，10 % SDS lml,0. 5M EDTA(ΡΗ8· 0) 2ml，甲醇 20ml，Triton X-100 IOOul, β -巰基乙醇 lOOul，ddH20 up to 100ml。⑶S檢測(cè)液(MUG溶液)MUG (C16H16O9 4_甲基傘型酮-β -葡萄糖醛酸苷)分子量 352. 3，將50mg MUG溶解到72ml的GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的濃度。反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3)配制 500ml 0. 2mol/L 的 Na2CO3 溶液Na2CO3 10. 6gH20 up to 500ml4-MU溶液配制4-MUG-甲基傘型酮)分子量176. 2，稱(chēng)0. 14096g 4-MU固體溶于 40ml反應(yīng)終止液(0. 2M Na2CO3)中，配制成20mM的4-MU溶液。然后再稀釋到ImM濃度，貯存于-20度，留待制備MU標(biāo)準(zhǔn)曲線。Bradford溶液配制稱(chēng)取IOOmg考馬斯亮藍(lán)藥品，溶解在100ml 85%磷酸和50ml 95%乙醇混合液中。染料溶解完全后，用冷水補(bǔ)足至1000ml，濾紙過(guò)濾，避光保存。結(jié)果如圖8所示，圖8顯示在不同器官中GUS蛋白相對(duì)活性均是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期大于生殖生長(zhǎng)期，而在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期在根中的表達(dá)量最強(qiáng)，在生殖生長(zhǎng)期是莖中的表達(dá)量最強(qiáng)。實(shí)施例8 不同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻的GUS蛋白相對(duì)活性測(cè)定將實(shí)施例4獲得的轉(zhuǎn)入PCAMBIA1391Z-HDT701P載體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因水稻， 4°C處理12小時(shí)后測(cè)定根、莖、葉、葉鞘的GUS蛋白相對(duì)活性，具體測(cè)定步驟參見(jiàn)實(shí)施例7，結(jié)果如圖9所示，各個(gè)器官在低溫處理后GUS蛋白相對(duì)活性均下降，只是下降的程度有差異。另外還測(cè)定了在不同脅迫條件下兩葉一心期轉(zhuǎn)基因水稻中的GUS蛋白的相對(duì)活性(幼根取0. 05g,幼葉取0. 05g)，其中冷脅迫處理是將轉(zhuǎn)基因植株于4°C處理12小時(shí)取樣，進(jìn)行測(cè)定；高溫處理是將轉(zhuǎn)基因植株于40°C處理12小時(shí)取樣，進(jìn)行測(cè)定；干旱脅迫是將轉(zhuǎn)基因植株用20%的PEG處理12小時(shí)取樣，進(jìn)行測(cè)定；黑暗處理是將轉(zhuǎn)基因植株放置于黑暗中處理12小時(shí)取樣，進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定步驟參見(jiàn)實(shí)施例7，每個(gè)處理重復(fù)3次。結(jié)果如圖10所示，高溫處理后⑶S蛋白相對(duì)活性會(huì)上升，而低溫處理、干旱處理和暗處理后⑶S蛋白的相對(duì)活性會(huì)下降。實(shí)施例9:半薄切片1、溶液的配制A液含2. 5%戊二醛和2%的多聚甲醛的磷酸緩沖液(0. lmol/L, pH7. 2)。B液含鋨酸的磷酸緩沖液(0. lmol/L, ρΗ7· 2)C 液磷酸緩沖液(0. lmol/L, ρΗ7· 2)
2、固定與包埋(1)固定將剪切的合適大小染色并脫過(guò)色的水稻幼苗的根和葉迅速投入A液中， 4°C固定過(guò)夜。(2)洗滌用C液4°C洗滌六次，每次20min。(3)再固定在溶液B中，4°C固定16小時(shí)。(4)洗滌用C液4°C洗滌6次，每次20min。(5)體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%系列的預(yù)冷乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)15min, 100%乙醇2次，每次30min。(6)環(huán)氧丙烷過(guò)渡，Epon812常規(guī)方法包埋。包埋好的材料可以進(jìn)行半薄切片，切成2um厚的切片，Carl Zeiss顯微鏡觀察拍照。結(jié)果如圖7所示，圖7顯示，在幼根及葉中⑶S主要集中在維管束的周?chē)磉_(dá)，推測(cè)HDT701啟動(dòng)子也許參入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。實(shí)施例10 為了更好的了解HDT701啟動(dòng)子的功能，將HDT701啟動(dòng)子放在PLACE上做了順式作用原件分析。其結(jié)果如表1所示。最后，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容導(dǎo)出或者聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。附涉及到轉(zhuǎn)基因水稻過(guò)程中用的培養(yǎng)基1)誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子，其特征在于，其序列是下列核苷酸序列之一(a)序列表中SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)的DNA序列雜交并且具有相同功能的核苷酸序列；(c)與(a)或(b)的DNA序列具有90%以上的同源性，并且也具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的水稻組蛋白脫乙?；富?HDT701啟動(dòng)子。
3.一種宿主菌，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌為農(nóng)桿菌EHA105。
5.權(quán)利要求1所述的水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子在啟動(dòng)下游目的基因在水稻中表達(dá)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻組蛋白脫乙酰化酶基因HDT701啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子的序列是下列核苷酸序列之一(a)序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與a)的DNA序列雜交并且具有相同功能的核苷酸序列；(c)與a)或b)的DNA序列具有90％以上的同源性，并且也具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。本發(fā)明從水稻中克隆出HDT701基因的啟動(dòng)子水稻組蛋白脫乙?；富騂DT701啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因在水稻中的部分器官中表達(dá)，是一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子，因此可將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程中，使的目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定的器官或組織部位積累，增加局部表達(dá)量，同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)，因此在轉(zhuǎn)基因工程中有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102363782SQ20111032787
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉夏, 張偉, 段俊, 趙金會(huì) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院華南植物園