專利名稱：一種纖維素酶系的選擇性失活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素酶，具體涉及ー種纖維素酶系的選擇性失活方法
背景技術(shù)：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是研究和制備纖維素酶最常用的經(jīng)典菌株之一，通過(guò)底物的誘導(dǎo)和發(fā)酵調(diào)控作用它可以分泌出多種不同類型的聚糖水解酶蛋白組分，進(jìn)而組成不同的酶系或復(fù)合酶系；其中，纖維素酶系主要包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 4,簡(jiǎn)稱EG)、外切葡苷聚糖酶(exo-1, 4_β-D-glucanase, EC 3. 2. I. 91,又稱 CBH)和纖維 ニ糖酶(3-l，4-D-glucosidase，EC 3. 2. I. 21，又稱β -葡萄糖苷酶，簡(jiǎn)稱β-G或BG)三大酶系，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 8 個(gè) EG (EGI EGVIII)、2 個(gè) CBH (CBHI 和 CBHII)和 7 個(gè) BG (BGI BGVII)酶家族。在木質(zhì)纖維原料聚糖類的酶水解過(guò)程中，通過(guò)上述三大酶系的協(xié)同作用可以催化纖維素或半纖維素為聚糖最終水解生成單糖。隨著功能性多糖和低聚糖類在細(xì)胞生物合成和調(diào)控領(lǐng)域、食品、保健品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的快速發(fā)展，聚糖定向酶水解技術(shù)的研究和開發(fā)備受關(guān)注，對(duì)具有單一功能或催化活性的酶家族或酶組分的需求日益增長(zhǎng)。目前采用的主要技術(shù)途徑一是通過(guò)外源単一內(nèi)切酶或外切酶基因的重組表達(dá)，ニ是對(duì)天然酶制劑進(jìn)行蛋白質(zhì)拆分以控制和除去纖維素系中的BG酶組分，它們?cè)诖笠?guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)中存在著技術(shù)復(fù)雜、研發(fā)周期長(zhǎng)、設(shè)備及操作要求高、前期投入和運(yùn)行成本高等不足，因此尋求簡(jiǎn)單低廉的酶組分活力的定向控制技術(shù)和方法顯得尤其重要，具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶系的選擇性失活方法，以里氏木霉產(chǎn)天然纖維素酶及其他相關(guān)的復(fù)合酶系為材料，通過(guò)采用簡(jiǎn)單的PH值處理的方法對(duì)其三大酶系進(jìn)行選擇性失活處理，實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶系的簡(jiǎn)單、快速和選擇性失活。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種纖維素酶系的選擇性失活方法控溫5 40で，調(diào)節(jié)纖維酶液的pH不小于8，靜置處理l(T80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。所述的纖維素酶系為里氏木霉產(chǎn)的天然纖維素酶復(fù)合酶系及其他相關(guān)的復(fù)合酶系O用含有Na+的堿液或緩沖液,或用含有K+的堿液或緩沖液,調(diào)節(jié)纖維酶液pH。所述的ρΗ=8· 8 9. 2。有益效果本發(fā)明的纖維素酶系的選擇性失活方法，簡(jiǎn)單，快速，容易操作，僅需通過(guò)采用簡(jiǎn)單的pH值處理的方法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶系中的三大酶系進(jìn)行選擇性失活處理，是ー種簡(jiǎn)單低廉的酶組分活力的定向控制技術(shù)和方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值，有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。


圖I是纖維素酶系堿性失活的酶活力測(cè)定結(jié)果 圖2是處理溫度對(duì)纖維素酶系堿性失活的影響結(jié)果 圖3是處理時(shí)間對(duì)纖維素酶系堿性失活的影響結(jié)果 圖4是堿性條件下處理前后纖維素酶水解動(dòng)力學(xué)的比較結(jié)果圖；
圖5是堿處理纖維素酶定向水解紙漿的糖組成測(cè)定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的說(shuō)明。以下實(shí)施例是使用的纖維素酶系采用發(fā)酵制備，所使用的菌種為里氏木霉(Trichoderma reesei Rut C_30),方法為采用Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽添加12 g/L紙衆(zhòng)和蒸汽瀑破玉米秸桿混合底物為碳源，在250 mL玻璃搖瓶中裝液45 mL并接入5 mL活化后的里氏木霉菌絲體,于30°C和170 r/min振蕩發(fā)酵產(chǎn)酶96h得發(fā)酵液,經(jīng)4000 r/min離心10 min后取上清液即得到纖維素酶系原液，分裝后冷凍保藏備用。酶活力測(cè)定方法為采用雙平行實(shí)驗(yàn)，控制平行誤差< 5%。濾紙酶活力、內(nèi)切葡聚糖酶活力(CMCase)和外切葡聚糖酶活力(CBH)均采用DNS法測(cè)定，β -葡萄糖苷酶(BG)采用對(duì)硝基苯酚葡萄糖苷法測(cè)定。上述各種酶活力測(cè)定均采用O. 05 mol/L檸檬酸ー氫氧化鈉緩沖液體系(PH4.80)和50°C ±1。纖維素酶原液中上述各種酶活力值依次為5.81 FPIU/mL、38.01 IU/mL、3.60 IU/mI^P1.13 IU/mL。實(shí)施例I
在恒溫水浴和溫和攪拌的條件下，向纖維素原酶液中緩慢滴加少量NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至穩(wěn)定值，密封靜置處理后得處理后的酶液，再采用酶活力測(cè)定方法重新測(cè)定處理后酶液的三種酶組分的酶活力。采用雙平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酶系選擇性失活，控制平行誤差<5%。殘余酶活力的計(jì)算方法以處理前后酶液的各種酶活力測(cè)定值相對(duì)百分比來(lái)表示。堿性處理后纖維素酶液離心分離條件8000 r/min離心堿性處理后的纖維素酶液IOmin后完全傾出離心上清液，以10% (v/v)體積的檸檬酸緩沖液(pH4. 80)清洗離心管壁得離心沉淀物。在25°C的恒溫條件下直接添加4. 0% NaOH或KOH試劑或?qū)?yīng)的緩沖液(w/w)調(diào)節(jié)纖維酶系的PH值并靜置處理60min后，測(cè)定三大酶組分的酶活力。結(jié)果如圖I所示，在不同PH值的堿性處理?xiàng)l件下三大酶類的酶活力呈現(xiàn)出兩種不同類型的變化特征。以pH8.00以分界點(diǎn)，CMCase為兩段階梯式變化，而CBH和BG則為線性衰減。pH5. 00 7. 00的范圍內(nèi)，CMCase和CBH的酶活力相對(duì)較為穩(wěn)定,可保留90%以上，而BG酶類的酶活力穩(wěn)定性略低,繼續(xù)提高PH值導(dǎo)致CBH和BG的酶活力快速線性下降。在高于pH8. 00的環(huán)境中CMCase的酶活力相對(duì)較為穩(wěn)定。當(dāng)PH值增至9. 00吋，BG的殘余酶活力僅為5. 6%，而CMCase和CBH仍然可殘留57. 0%和52. 1%, CMCaseXBH與β -G的殘留酶活力的相對(duì)比率分別為10. 3和
9.4 ;至pH10. 00時(shí)，可以基本上消除BG和90%以上的CBH酶活力，但仍然可以保留48. 4%的CMCase酶活力，即可以得到幾乎不含BG酶活力的纖維素酶制劑。實(shí)施例2
在pH9. 00的條件下，將纖維素酶原液分別置于5 40°C ±1的恒溫水浴條件下同步靜置處理60min，測(cè)定三大酶組分的酶活力。結(jié)果如圖2所示，在pH9. 00的堿條件下，低于10°C的處理溫度對(duì)BG酶組分存在一定的保護(hù)作用，在15 30°C的溫度范圍內(nèi)堿性pH對(duì)纖維素酶液都起到較好的選擇性失活作用，但是超過(guò)30°C的溫度也會(huì)導(dǎo)致CMCase和CBH的殘余酶活呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。這有利于纖維素酶在常溫下進(jìn)行堿處理操作。圖3顯示不同處理時(shí)間(l(T80min)的結(jié)果，在pH9. 00和25°C ±1的條件下處理30min后，三種酶類的殘余酶活力就可以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，其中CMCase、CBH和BG的殘余酶活力分別為58. 8%,56. 6%和5. 7%，相對(duì)比例達(dá)到10. 3和9. 9，可實(shí)現(xiàn)選擇性失活的效果。堿處理時(shí)間超過(guò)70min后，CMCase和CBH的酶活力會(huì)表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，顯然，優(yōu)選使用2(T60min，更優(yōu)選使用30 60mino
實(shí)施例3
分別采用PH9. 00 土 O. 20和ρΗΙΟ. O ± O. 20的兩種堿性條件在25°C ± I處理纖維素酶液30min后得到處理后的酶液(方法同實(shí)施例1)，以纖維素酶原液為對(duì)照，在10 g/L紙漿的酶解體系中分別加入O. 1% (v/v)用量的三種酶液，進(jìn)行酶水解反應(yīng)
酶水解性能的檢測(cè)采用雙平行實(shí)驗(yàn)，控制平行誤差< 5%。在100 mL螺ロ玻璃三角瓶中進(jìn)行，加入O. 05mol/L朽1檬酸緩沖液(pH 4. 80)配制而成的10 g/L Whatman濾紙紙衆(zhòng)粉(20目)溶液25 mL作為酶解底物，再加入適量酶液并密封，于50°C ±1和100 r/mim振蕩反應(yīng)。定時(shí)取樣O. 5mL加入10 μ L的1% (v/v) H2S04終止酶反應(yīng)得酶水解產(chǎn)物，經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行色譜分析。酶解得率計(jì)算以水解反應(yīng)體系中所測(cè)定的產(chǎn)物糖的物質(zhì)濃度除以紙漿的初始物質(zhì)濃度再乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)O. 9。比較3種酶液的酶水解反應(yīng)歷程，結(jié)果如圖4所示，在低底物和較少酶用量的反應(yīng)條件下，與原酶液相比，經(jīng)過(guò)PH9. 00堿處理后的酶制劑仍然可保存50%以上的CMCase和CBH酶活力，二者對(duì)紙漿酶水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和總糖得率基本上相近。由于堿處理可選擇性地抑制酶系中BG酶活力(殘余酶活力5%左右)，因而可以有效地保護(hù)紙漿酶水解過(guò)程中生成的纖維低聚糖組分。O. 1%(ν/ν)用量的堿處理酶催化水解10g/L紙漿反應(yīng)24h后，反應(yīng)體系中各種酶解產(chǎn)物組成基本趨于穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)的總糖酶解得率為8. 60%，其中纖維低聚糖的酶解得率為6. 73%，低聚糖占總糖的比例由原酶液的50. 9%增長(zhǎng)到78. 2%，提高幅度達(dá)到53. 0%。這說(shuō)明，堿性理對(duì)天然纖維素酶系的選擇性失活作用可顯著提高定向水解纖維素制備纖維低聚糖的生產(chǎn)性能，可用于纖維低聚糖的酶法生產(chǎn)。提高酶液堿度至ρΗΙΟ. O會(huì)導(dǎo)致三大酶類進(jìn)ー步失活，尤其是CBH顯著失活，造成酶水解性能和低聚糖的得率大幅度下降，但對(duì)酶解產(chǎn)品品質(zhì)即低聚糖比例的貢獻(xiàn)較小。酶水解產(chǎn)物的色譜分析葡萄糖的測(cè)定依照NREL方法采用高效液相色譜法(色譜儀Agilent 1200),以Bio-Rad HPX -87H色譜柱(7. 8mm X 300mm)測(cè)定。纖維低聚糖的分析測(cè)定采用高效液相離子交換色譜一脈沖安培法(色譜儀Dionex ICS-3000)，以CarboPacTMPA200陰離子交換色譜柱(3mmX 250mm)測(cè)定。葡萄糖和纖維低聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自Magazyme公司。采用高效離子液相色譜對(duì)酶解產(chǎn)物糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，采用堿失活纖維素酶水解紙漿只生成纖維ニ糖和少量的纖維三 糖，不會(huì)生成其它聚合度的纖維低聚糖，兩種糖分別約占總低聚糖類的90%和10%。
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于控溫5 40°C，調(diào)節(jié)纖維酶液的pH不小于8，靜置處理l(T80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的纖維素酶系為里氏木霉產(chǎn)的天然纖維素酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于用含有Na+的堿*液或緩沖液，或用含有K+的堿液或緩沖液，調(diào)節(jié)纖維酶液pH。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于pH=8.8^9. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的溫度為15 30°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶系的選擇性失活方法，其特征在于所述的處理時(shí)間為30 60min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維素酶系的選擇性失活方法，控溫5~40℃，調(diào)節(jié)纖維酶液pH不小于8，靜置處理10~80min，即可選擇性失活纖維素酶系；其中，CMCase和CBH選擇性保留，BG選擇性失活。本發(fā)明的纖維素酶系的選擇性失活方法，簡(jiǎn)單，快速，容易操作，僅需通過(guò)采用簡(jiǎn)單的pH值處理的方法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶系中的三大酶系進(jìn)行選擇性失活處理，是一種簡(jiǎn)單低廉的酶組分活力的定向控制技術(shù)和方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值，有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N9/99GK102653752SQ20121012710
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 徐勇, 杭琪, 范麗, 蔡鵬 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)