專利名稱：一株發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株內生真菌。
背景技術：
微生物特別是真菌有非常強的分解轉化物質的能力，并能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，通過微生物發(fā)酵中草藥與一般的物理或化學加工方法相比能大幅度改變藥性，提高療效，降低毒副作用，擴大適應癥。利用植物中的內生真菌對中藥進行發(fā)酵，由于中藥的某些物質可能對微生物的生長和代謝有促進或抑制作用，對活性成分的產(chǎn)生也可能有促進或抑制作用，微生物在中藥的特殊環(huán)境中也可能改變自身的代謝途徑，從而形成新的活性成分 或改變各活性成分的相互比例，因此利用從藥用植物中分離到的內生真菌來生產(chǎn)生物活性物質已成為當今學者的研究趨勢。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一株發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌。本發(fā)明發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillusversicolor)RE4，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012045，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為12 14cm，菌落為白色，漸變?yōu)榛揖G色，基質為棕黃色，菌絲較密集，呈氈毛狀，菌落邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈球形，分生孢子單生，單細胞。本發(fā)明發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillusversicolor) RE4，其ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構建系統(tǒng)進化樹，RE4菌株的ITS序列與曲霉屬菌(Aspergillus versicolor,編號JN545818. I)菌株的相似性都達到了 98%以上,結合形態(tài)學觀察結果，確定內生真菌RE4為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。本發(fā)明發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillusversicolor)RE4，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012045，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillusversicolor) RE4，能夠以甘草為底物對其進行發(fā)酵，提高甘草中的主要活性成分——甘草次酸的含量。本發(fā)明利用微生物制藥手段提取分離甘草健康植株的內生真菌RE4，以甘草為底物進行發(fā)酵，采用HPLC法為分析手段測定甘草內生真菌RE4發(fā)酵甘草后甘草次酸的含量，最后將內生真菌RE4菌株通過形態(tài)學觀察和18S rDNA序列分析鑒定其種屬。本發(fā)明中的這株能夠通過發(fā)酵甘草提高甘草次酸的內生真菌RE4，它為雜色曲霉(Aspergillus versicolor),其以甘草為底物對其進行發(fā)酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高，甘草次酸是經(jīng)典的抗炎藥物，目前在醫(yī)藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用；本發(fā)明對采用內生真菌RE4發(fā)酵甘草生產(chǎn)甘草次酸具有指導意義。


圖I為具體實施方式
一中雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4的孢子顯微結構圖；圖2為具體實施方式
一中雜色曲霉(Aspergillus versicolor) RE4的PCR擴增的電泳圖，其中M泳道表示Marker, I泳道表示RE4 ；圖3為具體實施方式
一中雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4的系統(tǒng)進化樹圖；圖4為具體實施方式
一中甘草次酸對照品的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；
圖5為具體實施方式
一中甘草的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；圖6為具體實施方式
一中甘草加入對照品后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示加對照品后甘早次Ife ；圖7為具體實施方式
一中RE4發(fā)酵甘草后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示加對照品后甘草次酸。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012045，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本實施方式中雜色曲霉(Aspergillus versicolor) RE4,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為12 14cm，菌落為白色，漸變?yōu)榛揖G色，基質為棕黃色，菌絲較密集，呈氈毛狀，菌落邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈球形，分生孢子單生，單細胞。本實施方式中雜色曲霉(Aspergillus versicolor) RE4,其生長溫度為28°C,生長pH值自然。本實施方式中雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4,該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區(qū)，植株年齡3年，植株健壯，無病蟲害，其樣本現(xiàn)存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業(yè)實驗室；它按以下步驟進行分離培養(yǎng)選取健康的野生甘草的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段于無菌超凈臺內將野生甘草的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗3次；用無菌手術刀將野生甘草的根莖從中間切開，分別置于5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 5d,待實驗材料周圍長出菌體,挑取菌體轉入平板(5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基)多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆茫?%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養(yǎng)基為取5mL5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結果從野生甘草的根莖中分離出內生真菌RE4，根據(jù)《真菌分類學》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進行形態(tài)學鑒定，其菌落特征和孢子形態(tài)與曲霉屬菌特征極為相近，孢子顯微結構如圖I所示；
分子鑒定內生真菌RE4發(fā)酵液抽濾得菌絲體用25%乙醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，離心去上清液，提取總DNA后進行目的片段的PCR擴增，將含有目標條帶的PCR產(chǎn)物全部進行再一次的點樣，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒回收，制備感受態(tài)大腸桿菌細胞，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接后，連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，進行菌落PCR驗證；挑取單菌落進行大腸桿菌轉化子的PCR檢測，證明目的片段已成功轉化進入感受態(tài)細胞中后，將克隆陽性菌株送上海生工生物工程技術服務有限公司測序；所測定的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中應用BLAST分析進行同源性比較，并根據(jù)分子生物學研究的基本原理選擇相應種屬代表菌株的18SrDNA序列應用軟件CLUSTALX I. 83和MEGA5. 03以近鄰結合法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap檢驗值> 50% (1000重復)，確定目標菌株的分類地位；內生真菌RE4基因組經(jīng)尿素法提取后，采用PCR擴增后凝膠成像結果如圖2所示，在500bp附近得到一擴增片段(堿基序列見SEQ ID NO :1)，證明已成功從內生真菌RE4菌株中提取出其基因組DNA;根據(jù)內生真菌RE4的ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構建系統(tǒng)進化樹(見圖3)，RE4菌株的ITS序列與曲霉屬菌(Aspergillus versicolor，編號JN545818. I)菌株的相似性都達到了 98%以上，結合形態(tài)學觀察結果，確定內生真菌RE4為雜色曲霉屬菌(Aspergillus versicolor)。本實施方式中的雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4,其發(fā)酵甘草提高甘草次酸的實驗結果如表I所示，內生真菌RE4發(fā)酵甘草提高甘草次酸實驗結果表明，內生真菌RE4能夠通過發(fā)酵甘草使其中的甘草次酸含量顯著升高。表I
權利要求
1.一株發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，其特征在于它為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo M 2012045，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它涉及一株內生真菌。發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)RE4，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM 2012045，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明中發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，其以甘草為底物對其進行發(fā)酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高，甘草次酸是經(jīng)典的抗炎藥物，目前在醫(yī)藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用；本發(fā)明對采用內生真菌RE4發(fā)酵甘草生產(chǎn)甘草次酸具有指導意義。
文檔編號C12N1/14GK102643756SQ20121012628
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權日2012年4月26日
發(fā)明者孔德崴, 孫雅北, 白長勝, 譚佳音, 鄭春英 申請人:黑龍江大學