專利名稱：初始t細胞來源的腫瘤特異性殺傷細胞的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的細胞免疫治療新技術(shù)，特別涉及一種初始T細胞來源的新型腫瘤特異性殺傷細胞(DC-CIK-CTL)的制備方法極其應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來“細胞免疫治療”作為一種全身治療新技術(shù)應(yīng)用于臨床，并獲得了有效率高、副反應(yīng)小的良好效果，因而成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四大腫瘤治療模式。細胞免疫治療的基本方法是采取外周血T細胞，進行體外擴增、激活，制備成腫瘤殺傷細胞，然后回輸病人體內(nèi)進行治療。體外擴增制備的NK、TIL、CTL、或DC-CIK等效應(yīng)細胞均可用于腫瘤的細胞免疫治療，其目的是應(yīng)用這些效應(yīng)細胞特異性或非特異性殺傷腫瘤細胞，達到控制腫瘤進程，改善生存質(zhì)量，延長生存期，爭取腫瘤根治的目的。目前國際國內(nèi)應(yīng)用的效應(yīng)細胞主要是TIL、DC、CIK、NK, DC-CIK、CTL、或DC-CIK-CTL等。效應(yīng)細胞的制備目前仍以外周血分離的總T細胞為主，而外周血總T細胞是由初始T、中樞記憶T、和效應(yīng)記憶T細胞三個亞群組成。基礎(chǔ)研究證實，三個T細胞亞群均可用來制備效應(yīng)細胞，但就其擴增能力、增值活力、腫瘤殺傷能力來說，初始T優(yōu)于中樞記憶T，中樞記憶T優(yōu)于效應(yīng)記憶T細胞。近期有研究表明，初始CD8+T細胞制備的效應(yīng)細胞，腫瘤殺傷能力明顯增強(Blood，2010，Sept. 14，Online)。我們的研究證實，腫瘤的細胞免疫是個非常復(fù)雜的免疫過程，CD4+和CD8+T細胞在腫瘤免疫中分別擔(dān)當(dāng)重要功能。初始CD4+T和初始CD8+T細胞混合制備的效應(yīng)細胞，較單純初始CD8+T細胞制備的效應(yīng)細胞殺傷能力更佳，同時能夠產(chǎn)生更持久的免疫記憶，使效應(yīng)細胞對腫瘤產(chǎn)生持續(xù)的免疫殺傷，因而形成本專利發(fā)明。本發(fā)明提供一種最新的效應(yīng)細胞制備方法，即應(yīng)用⑶4+和⑶8+混合的初始T細胞，制備DC-CIK-CTL效應(yīng)細胞，同時提供一種應(yīng)用復(fù)合制劑對腫瘤微環(huán)境進行干擾，從而打破腫瘤免疫耐受，在此基礎(chǔ)上進行效應(yīng)細胞回輸治療的新技術(shù)。應(yīng)用按比例混合的初始CD4+T細胞和初始CD8+T細胞制備效應(yīng)細胞是個全新的新理念、新技術(shù)，其特點和優(yōu)勢是
①、CD4+和CD8+初始T細胞的體外擴增能力明顯高于總T細胞，有利于體外大批量制備腫瘤特異性殺傷細胞；②、⑶4+和⑶8+初始T細胞的KLRGl和⑶57明顯低表達，代表著細胞可以抵抗終末分化，使發(fā)生終末分化的時間顯著后延，保持更長的生存時間和功能潛力；③、CD4+和CD8+初始T細胞端粒較長，因而擴增潛能較大，更適合臨床細胞免疫治療效應(yīng)細胞的制備。本發(fā)明的方法是外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和總T細胞。DC細胞經(jīng)過5天的培養(yǎng)擴增并加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗備用。T細胞則進一步分離出初始CD4+T細胞和初始CD8+T細胞，將兩種初始T細胞按I : I混合，經(jīng)INF- Y沖擊后，應(yīng)用⑶3單抗和IL-2擴增至第7天制備CIK。半數(shù)細胞移瓶后加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)細胞繼續(xù)CIK培養(yǎng)，至第10天分別收獲CIK和CTL效應(yīng)細胞，混合移入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0.9%氯化鈉中，制備成高效DC-CIK-CTL?；剌斍笆紫葘Σ∪藢嵤┪h(huán)境干擾，方法是環(huán)磷酰胺(CTX) 600-1200mg靜脈滴入，I次/日共2天，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。細胞回輸治療第一天引流區(qū)域淋巴結(jié)注射DC疫苗，每周一次共三次。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于解決目前DC-CIK方法腫瘤殺傷率低、臨床有效率低的瓶頸問題，應(yīng)用本技術(shù)，可以顯著提高腫瘤的殺傷效率，提高臨床有效率和客觀療效。為保證上述技術(shù)的實施，本發(fā)明提供了一種特異性腫瘤殺傷細胞的制備方法，本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟步驟I，外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和總T細胞；步驟2，DC細胞經(jīng)過5天的培養(yǎng)擴增并加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗； 步驟3，T細胞分離出初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將兩種初始T細胞按I I混合，經(jīng)INF- Y沖擊后，應(yīng)用⑶3單抗和IL-2擴增至第7天，制備CIK ；步驟4，步驟3得到的擴增細胞的半數(shù)細胞加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)細胞繼續(xù)CIK培養(yǎng)，至第10天分別收獲CIK和CTL效應(yīng)細胞；步驟5，取1-2X IO7步驟2得到的DC疫苗和O. 5X IO9步驟4得到的CIK以及O. 5X IO9CTL效應(yīng)細胞混合，制備成用于治療的細胞制劑。因此本發(fā)明還包括，含有本發(fā)明特異性DC-CIK-CTL細胞的細胞制劑。如加入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0.9%氯化鈉中，制備成DC-CIK-CTL輸液用制劑。本發(fā)明的另一個內(nèi)容是，用本發(fā)明的細胞制劑治療腫瘤病人，其方法是將本發(fā)明制備的特異性DC-CIK-CTL細胞制劑回輸?shù)侥[瘤病人體內(nèi)。本發(fā)明還包括制備一種干擾微環(huán)境制劑，該制劑為注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，注射用CTX,以干擾腫瘤微環(huán)境為目的，而不以抗腫瘤為目的，該制劑的制備方法依據(jù)制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備即可，如制備成水針或粉針，也可直接制備成輸液劑。以上制劑的劑量范圍分別為可一次性用于病人的劑量，如靜脈注射用CTX—次用量為400-600mg/m2，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有O. 9 %氯化鈉或5 % -10 %的葡萄糖注射液中給病人輸注。本發(fā)明的細胞制劑和干擾微環(huán)境制劑的使用方法如下環(huán)磷酰胺(CTX)600-1200mg靜脈滴入，I次/日共2天，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。細胞回輸治療第一天引流區(qū)域淋巴結(jié)注射DC疫苗，每周一次共三次。以下詳細介紹本發(fā)明的初始T細胞來源的新型DC-CIK-CTL的制備方法外周血單狀核細胞采集應(yīng)用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml，分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4°C冷藏備用，收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)。DC和T細胞分離175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化，將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞。 DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C ,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天,第6天加入自體腫瘤相關(guān)抗原50ug/ml,次日補充10-15%的自體血清,培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療。初始⑶4+T細胞及初始⑶8+T細胞分選I)、可應(yīng)用美國BD、美國R&D、或德國美天旎公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選。采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響。①、初始⑶4+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照NaiveCD4+T cell isolation kit II,human試劑盒說明書,首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行初始CD4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用。②、初始⑶8+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na_ive⑶8+T cell isolation kit, human試劑盒說明書分兩步進行分選。第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞。第二步，對所收集的初始T細胞進行CD8+磁珠標記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始CD8+T細胞，離心洗滌2-3次備用。2)、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的CliniMACS Plus進行分選。CliniMACS Plus細胞分選系統(tǒng)包括 CliniMACS Plus 儀器、CliniMACS 管道、CliniMACS試劑和CliniMACS緩沖液，是一個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或去除。使用CliniMACS Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選，分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療。 將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACS Plus細胞準備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標記靶細胞，洗滌細胞以去除多余的抗體，然后，細胞準備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACS Plus儀器將按照程序自動開始分選?？俆細胞將自 動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞。將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照I : I混合備用。CIK制備
取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AM-V無血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的初始T細胞移入，置于37°C，5 % CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補充50 %的CIK培養(yǎng)基，第5天補充IL-2培養(yǎng)基，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，每次補充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)。
CTL 制備第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中加入IL-2培養(yǎng)基。加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL。高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備第10天分批取DC疫苗1-2 X IO7復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為O. 5 X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次祛除細胞碎片，移入含1%人血白蛋白2. 0g，IL-220萬單位的回輸用生理鹽水200ml中，4°C
保存?zhèn)溆??；蛉?-2 X IO7DC疫苗和O. 5 X IO9CIK以及O. 5 X IO9CTL效應(yīng)細胞混合，制備成用于治療的細胞制劑。


圖I. DC疫苗的制備流程示意圖。圖2. DC培養(yǎng)擴增過程的不同階段DC細胞鏡下形態(tài)和電鏡形態(tài)。圖3.攜帶腫瘤抗原的DC細胞在第一信號和第二信號的共同參與下，激活T細胞，制備腫瘤特異性CTL的示意圖。圖4. DC細胞激活T細胞的電鏡示意圖。圖5.干擾腫瘤微環(huán)境后，外周血Treg顯著降低，第4天到第10天保持在低水平，11天后回升(P <0.01)。圖6.干擾腫瘤微環(huán)境后，外周血IL-10水平顯著降低(P < O. 01)。圖7.干擾腫瘤微環(huán)境后，外周血TGF-β水平顯著降低(P < O. 01)。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例II、采血前注意事項因為放化療會在較大程度上影響外周血和骨髓初始T細胞的含量和功能，所以，根治手術(shù)后病人在放化療前采集外周血單壯核細胞較為適宜，放化療后病人需在放化療結(jié)束I個月后采集比較適宜。外周血白細胞數(shù)量較低時，可應(yīng)用注射用重組人粒細胞巨嗜細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)皮下注射進行骨髓動員。多發(fā)骨髓轉(zhuǎn)移或骨髓造血功能低下的腫瘤病人，外周血初始T細胞含量和功能較差，不宜實施外周血單狀核細胞采集。2、外周血單狀核細胞采集應(yīng)用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml。分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清(方法加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56 °C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液(Ficoll，I. 077) 15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX 15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層(單狀核細胞)。分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX5分鐘洗滌，棄上清。重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)(細胞總數(shù)量6-10XlO9)。3、DC和T細胞分離175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶 活化。將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞(待初始T細胞分選)，剩余貼壁細胞即為DC細胞。4、DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml,IL-430ug/500ml，慶大霉素2. O萬單位/500ml)，置于37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天。第6天加入自體腫瘤相關(guān)抗原50ug/ml (自體腫瘤相關(guān)抗原制備方法新鮮腫瘤組織O. 5cm3，剪除周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細胞懸液，凍融法制備細胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量)，次日補充10-15%的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶80、⑶83、⑶86、HLA-DR、HLA-ABC表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療(附圖1，2)。5、初始⑶4+T細胞及初始⑶8+T細胞分選I)、應(yīng)用美國 BD(Becton, Dickinson)、美國 R&D(Research andDevelopmentSystem)、或德國美天旎(MiltenyiBiotec)等公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始⑶4+T細胞及初始CD8+T細胞分選。建議采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響。①、初始⑶4+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照NalVe⑶4+T cell isolation kit II, human試劑盒說明書，首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗(包括 anti-CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD45R0、CD56、CD123、TCR Y /δ、HLA-DR及⑶235a)作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行初始⑶4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用。②、初始⑶8+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na_i_ve⑶8+T cell isolation kit, human試劑盒說明書分兩步進行分選。第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗(包括anti-⑶45R0、⑶56、⑶57及⑶244)作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞。第二步，對所收集的初始T細胞進行CD8+磁珠標記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始CD8+T細胞，離心洗滌2-3次備用。2)、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的CliniMACS Plus進行分選。CliniMACS Plus細胞分選系統(tǒng)包括 CliniMACS Plus 儀器、CliniMACS 管道、CliniMACS試劑和Cl iniMACS緩沖液，是一個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或去除。使用CliniMACS Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選。分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療。按說明書步驟，將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACSPlus細胞準備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標記靶細胞，洗滌細胞以去除多余的抗體。然后，細胞準備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACS Plus儀器將按照程序自動開始分選。總T細胞將自動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞。將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照I : I 混合備用。6、CIK 制備取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AM-V無血清培養(yǎng)基20ml (含IFN- y 1000U/ml ;慶大霉素2萬單位/500ml)，將懸浮的初始T細胞移入，置于37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，補充50 %的CIK培養(yǎng)基(AM-V無血清培養(yǎng)基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬單位)。第5天補充IL-2培養(yǎng)基(AM-V無血清培養(yǎng)基500ml，含IL_215ug，慶大霉素2萬單位)。以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，每次補充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)。5、CTL 制備第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中加入IL-2培養(yǎng)基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL(附圖3，4)。6、高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備第10天分批取DC疫苗1-2 X IO7復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為O. 5 X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(含1%人血白蛋白2. 0g，IL-220萬單位)，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑(細胞數(shù)量控制在1_2X109，4°C環(huán)境輸送病房備用。7、打破腫瘤免疫耐受基礎(chǔ)上回輸治療方法I :細胞培養(yǎng)的第9天，病人開始做細胞免疫治療前處理(干擾腫瘤微環(huán)境)，方法為應(yīng)用環(huán)磷酰胺(CTX) 400-600mg,靜脈滴注，I次/日，連續(xù)2天。細胞培養(yǎng)第11天，細胞回輸治療，方法為采用帶濾器輸血袋，生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖袋)，換細胞制劑200ml靜脈輸注，速度40-60滴/分，期間每5_10分鐘輕柔搖晃輸液瓶(袋)，保持細胞混懸狀態(tài)。細胞輸注完成后，換生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖洗輸液器)。細胞回輸治療每日2次，上下午分開，共6次3天完成。細胞回輸當(dāng)日起，IL-2100萬U肌肉注射，2次/日，連續(xù)5天。CTX處理前I天和處理后4天分別采取外周血(抗凝)，流式細胞學(xué)(FCM)檢測Treg(CD4+CD25+)水平，ELISA 法檢測 IL-10 和 TGF-β 水平(附圖 5-7)。方法2 :應(yīng)用COBE Spectra血液成分分離機采取外周血單狀核細胞的同時，按照程序說明書設(shè)定程序，采取造血干細胞，實驗室擴增后凍存?zhèn)溆?。細胞回輸治療前，?yīng)用全身放療(TBI)技術(shù)對病人實施腫瘤微環(huán)境干擾，方法是設(shè)定放療劑量12cGy，分三天完成或一次完成，干擾后病人移入層流病房。第二天進行細胞回輸治療，方法是采用帶濾器輸血袋，生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖袋)，換細胞制劑200ml靜脈輸注，速度40-60滴/分，期間每5-10分鐘輕柔搖晃輸液瓶(袋)，保持細胞混懸狀態(tài)。細胞輸注完成后，換生理鹽水IOOml靜脈點滴(沖洗輸液器)。細胞回輸治療每日2次，上下午分開，共6次3天完成。細胞回輸當(dāng)日起，IL-2100萬U肌肉注射，2次/日，連續(xù)5天。TBI處理前一天和處理后第四天，分別采取外周血(抗凝)，流式細胞學(xué)(FCM)檢測Treg (⑶4+⑶25+)水平，ELISA法檢測IL-10和TGF-β水平。治療結(jié)束后繼續(xù)層流病房內(nèi)支持治療，至外周血白細胞數(shù)量恢復(fù)，移出層流病房。兩周內(nèi)白細胞不能恢復(fù)正常者，立即進行造血干細胞回輸治療，方法是將治療前采取的造血干細胞實驗室復(fù)蘇，保證細胞數(shù)量為1-2 X IO9,加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3-6次去除細胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(含1%人血白蛋白2. 0g，IL-220萬單位)，制備成造血干細胞細胞制劑，靜脈回輸，I次/日，連續(xù)3天。權(quán)利要求
1.一種初始T細胞來源的腫瘤特異性殺傷細胞的制備方法，步驟如下 步驟I，外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和總T細胞； 步驟2，DC細胞經(jīng)過5天的培養(yǎng)擴增并加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗； 步驟3，T細胞分離出初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將兩種初始T細胞按I : I混合，經(jīng)INF- Y沖擊后，應(yīng)用⑶3單抗和IL-2擴增至第7天，制備CIK ； 步驟4，步驟3得到的擴增細胞的半數(shù)細胞加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)細胞繼續(xù)CIK培養(yǎng)，至第10天分別收獲CIK和CTL效應(yīng)細胞； 步驟5，取1-2X IO7步驟2得到的DC疫苗和O. 5X IO9步驟4得到的CIK以及O.5 X IO9CTL效應(yīng)細胞混合，制備成用于治療的細胞制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，其中，步驟I方法如下外周血單狀核細胞采集 應(yīng)用COBE SPECTRA細胞成分分離機，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120-140ml，分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4°C冷藏備用，收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管,應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX15分鐘,一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清,加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，DC和T細胞分離 175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化，將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞，剰余貼壁細胞即為DC細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，其中，步驟2方法如下DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備 貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天，第6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml，次日補充10-15 %的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶80、⑶83、⑶86、HLA-DR、HLA-ABC表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，其中，步驟3方法如下初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選 I)、可應(yīng)用美國BD、美國R&D、或德國美天旎公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響， ①、初始⑶4+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na'ive⑶4+Tcell isolation kit II, human試劑盒說明書,首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為ー抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行初始CD4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用， ②、初始⑶8+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na_ive⑶8+Tcell isolation kit, human試劑盒說明書分兩步進行分選,第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為ー抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞，第二部，對所收集的初始T細胞進行⑶8+磁珠標記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始⑶8+T細胞，離心洗滌2-3次備用， 2)、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的CliniMACS Plus進行分選，CliniMACS Plus細胞分選系統(tǒng)包括 CliniMACS Plus 儀器、CliniMACS 管道、CliniMACS試劑和CliniMACS緩沖液，是ー個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或去除，使用CliniMACS Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選，分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療， 將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACS Plus細胞準備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標記靶細胞，洗滌細胞以去除多余的抗體，然后，細胞準備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACS Plus儀器將按照程序自動開始分選，總T細胞將自動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始CD4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照I : I混合備用，CIK制備 取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AM-V無血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的初始T細胞移入，置于37°C,5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補充50%的CIK培養(yǎng)基，第5天補充IL-2培養(yǎng)基，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，毎次補充40%以上，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剰余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，其中，步驟4方法如下CTL制備 第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中加入IL-2培養(yǎng)基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，其中，步驟5方法如下高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備 第10天分批取DC疫苗1-2X IO7復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為O. 5X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次祛除細胞碎片。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法，其特征在于，步驟如下 外周血單狀核細胞采集 應(yīng)用COBE SPECTRA細胞成分分離機，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120-140ml，分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4°C冷藏備用，收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管,應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX15分鐘,一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清,加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，DC和T細胞分離 175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化，將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞，剰余貼壁細胞即為DC細胞，DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備 貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天，第6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml，次日補充10-15 %的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶80、⑶83、⑶86、HLA-DR、HLA-ABC表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療， 初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選 1)、可應(yīng)用美國BD、美國R&D、或德國美天旎公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響， ①、初始⑶4+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na_ive⑶4+Tcell isolation kit II, human試劑盒說明書,首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為ー抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行初始CD4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用， ②、初始⑶8+T細胞分選將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na_ive⑶8+Tcell isolation kit, human試劑盒說明書分兩步進行分選,第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為ー抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞，第二歩，對所收集的初始T細胞進行⑶8+磁珠標記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始⑶8+T細胞，離心洗滌2-3次備用， 2)、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的CliniMACS Plus進行分選，CliniMACS Plus細胞分選系統(tǒng)包括 CliniMACS Plus 儀器、CliniMACS 管道、CliniMACS試劑和Cl iniMACS緩沖液，是ー個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或祛除，使用CliniMACS Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選，分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療， 將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACS Plus細胞準備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標記靶細胞，洗滌細胞以祛除多余的抗體，然后，細胞準備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACS Plus儀器將按照程序自動開始分選，總T細胞將自動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始CD4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照I : I混合備用，CIK制備 取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AM-V無血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的初始T細胞移入，置于37°C,5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補充50%的CIK培養(yǎng)基，第5天補充IL-2培養(yǎng)基，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，毎次補充40%以上，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剰余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)， CTL制備 第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中加入IL-2培養(yǎng)基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL， 高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備 第10天分批取DC疫苗1-2X IO7復(fù)蘇、洗滌后，和數(shù)量分別為O. 5X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次祛除細胞碎片。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的制備方法制備的特異性殺傷細胞。
9.含有權(quán)利要求8的特異性殺傷細胞的制劑。
10.權(quán)利要求8的特異性殺傷細胞在制備抗腫瘤制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種初始T細胞來源的腫瘤特異性殺傷細胞的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明的特異性殺傷細胞制備方法如下步驟1，外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和總T細胞；步驟2，DC細胞經(jīng)過培養(yǎng)加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至成熟，得DC疫苗；步驟3，T細胞分離出初始CD4+T細胞和初始CD8+T細胞，將兩種初始T細胞按1∶1混合，經(jīng)INF-γ沖擊后，應(yīng)用CD3單抗和IL-2擴增，制備CIK；步驟4，步驟3得到的擴增細胞的半數(shù)細胞加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)細胞繼續(xù)CIK培養(yǎng)，分別收獲CIK和CTL效應(yīng)細胞；步驟5，取1-2×107步驟2得到的DC疫苗和0.5×109步驟4得到的CIK以及0.5×109CTL效應(yīng)細胞混合，制備成用于治療的細胞制劑。DC疫苗復(fù)蘇、洗滌后，和數(shù)量分別為0.5×109的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2×109。
文檔編號C12N5/0784GK102657853SQ201210127158
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者徐偉利, 蔡建輝, 問明 申請人:蔡建輝, 蔡穎