專利名稱：一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種新型腫瘤基因治療靶向表達(dá)技 術(shù)，即通過構(gòu)建一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，應(yīng)用該調(diào)控盒調(diào)控腫瘤治療基因 的表達(dá)，并因此構(gòu)造腫瘤特異性的基因治療系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，基因治療作為一種新的疾病治療方式已經(jīng)成 為可能?；蛑委熓侵苯油ㄟ^基因水平的操作和介入來干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程。與 現(xiàn)有的其他治療方法和策略相比，基因治療的優(yōu)勢在于可直接利用人們在分子水平對疾病 的病因、發(fā)病機(jī)理的新發(fā)現(xiàn)、新認(rèn)識及分子生物學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)，針對性地修復(fù)甚至置換致 病基因、或糾正基因表達(dá)調(diào)控異常?；蛑委煂⑹轻t(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的一次革命，是當(dāng)今生物 醫(yī)學(xué)發(fā)展最重要的里程碑之一，同時也必將成為21世紀(jì)重要的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。基因治療的發(fā)展 極其迅速，據(jù)統(tǒng)計，自1990年美國FDA正式批準(zhǔn)第一個基因治療臨床試驗開始，截止2009 年3月，世界范圍內(nèi)已有1537個各期基因治療臨床研究方案(httpwiley. co. uk/ genmed/clinical/)，涵蓋了遺傳病、代謝病、腫瘤、傳染病等眾多領(lǐng)域，其中III期臨床研 究有52個，另外中國SFDA還在世界上首次批準(zhǔn)了 2個基因治療新藥上市。但是，總體上 講，基因治療技術(shù)和產(chǎn)品還處在其發(fā)展的初期階段，面臨著諸多問題與挑戰(zhàn)，其中最主要表 現(xiàn)為基因?qū)胂到y(tǒng)效率較低，缺乏靶向性，以及對導(dǎo)入的治療基因缺乏有效的調(diào)控等，這些 問題的也是制約著發(fā)展有效和安全的基因治療的主要原因?；蛑委熽P(guān)鍵技術(shù)中的首要問 題，是能夠選擇性(或相對特異性)地將治療基因輸送到特定的靶組織(或靶器官)，使之 進(jìn)入靶細(xì)胞，同時在靶細(xì)胞中實現(xiàn)選擇性表達(dá)。靶向基因治療是當(dāng)前基因治療的最重要研 究方向。腫瘤基因治療是基因治療研究中最重要的領(lǐng)域，目前其臨床研究方案已達(dá)993 個，占全體基因治療臨床方案的64. 6%。與其他藥物研究和技術(shù)評價的指導(dǎo)原則一樣，基因 治療藥物也要求做到安全、有效、質(zhì)量可控。目前，腫瘤基因治療研究的重要領(lǐng)域也大多集 中在靶向基因治療上?？傮w而言，靶向基因治療主要包括兩個方面一是基因治療載體轉(zhuǎn)導(dǎo) 的靶向性，即使基因治療載體特異性地導(dǎo)入腫瘤靶細(xì)胞，而不進(jìn)入正常細(xì)胞；一是治療基因 的靶向性表達(dá)，即使治療的目的基因在腫瘤靶細(xì)胞中實現(xiàn)特異性表達(dá)而不在正常細(xì)胞中表 達(dá)。其中，治療基因的靶向性表達(dá)是根本。通常，基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的雙重調(diào)控。對于腫瘤治療基因而言， 其靶向性表達(dá)也不外乎這兩個方面。目前，腫瘤治療基因的靶向性表達(dá)主要集中在利 用腫瘤特異性和/或組織特異性的基因啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控，包括甲胎蛋 白 AFP (alpha-fetoprotein)基因啟動子之于肝癌；癌胚抗原 CEA (carcinoembryonic antigen)基因啟動子之于結(jié)腸癌；雌激素反應(yīng)元件(Estrogen-response element)、 抗上皮粘蛋白MUCl (Mucin 1)等基因啟動子之于乳腺癌；PrcAasin、前列腺特異性抗 原PSA(prostate-specific antigen)等基因啟動子之于前列腺癌；分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑SLP I (secretory leukoprotease inhibitor)基因啟動子之于肺癌；酪氨酸 激酶Tyr(Tyrosinase)基因啟動子之于黑色素瘤；嗜鉻素CgA(Chromogranin A)基因 啟動子之于胰腺癌⑴roplakinll基因啟動子之于膀胱癌；Musashi-Ι、巢蛋白(Nestin) 等基因啟動子之于腦癌；間皮素(Mesothelin)基因啟動子之于間皮瘤；環(huán)氧合酶 2(Cyclooxygenase-2)、缺氧誘導(dǎo)因子HIF(Hypoxia-inducible factor)、0ct_3/4反應(yīng)元件 (0ct-3/4response elements)、E2F 反應(yīng)元件(E2F-responsive element)、進(jìn)展提高基因 PEG-3 (Progression elevated gene-3)、肝素結(jié)合細(xì)胞因子(Midkine)、存活素 Survivin、 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT(human telomerase reverse transcriptase)、早其月生長反應(yīng)因子 1 (early growth response l，Egr_l)等基因啟動子之于多種腫瘤等。
通常，哺乳動物細(xì)胞中一個編碼蛋白質(zhì)的完整的mRNA分子包括三部分5’ UTR、 編碼區(qū)和3’ UTR，其中高度結(jié)構(gòu)化的5’ UTR和3’ UTR參與基因表達(dá)在翻譯水平上的調(diào)控， 控制mRNA的翻譯速率，并維護(hù)mRNA的穩(wěn)定性。近年來，已有報道利用高度結(jié)構(gòu)化的5’端 非翻譯區(qū)(5’ Untranslated Region，5’ UTR)來調(diào)控治療基因的翻譯水平以實現(xiàn)其在腫瘤 細(xì)胞中特異性表達(dá)。這是由5’ UTR的結(jié)構(gòu)決定的，它包含了若干調(diào)控mRNA翻譯的元件，包 括(l)m7GpppG帽，是翻譯效率的決定性因子，為帽結(jié)合復(fù)合體(eukaryotic initiation factor 4E，eIF_4E)所識別；(2) 二級結(jié)構(gòu)(又稱莖環(huán))，通過阻礙核糖體40S亞單位的結(jié) 合或遷移來反向調(diào)節(jié)翻譯；(3)與5’ UTR調(diào)控蛋白(5’ -UTR-interacting protein)相作 用的特異元件，通過類似于二級結(jié)構(gòu)的方式抑制翻譯；(4)上游ORF(Upstream ORFs, uORF) 和上游AUG (upstream AUGs，uAUG)，通常以提供替代的起始位點方式來下調(diào)主ORF的翻譯；[5]核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(Internalribosome entry sites, IRES)，促進(jìn)非帽依賴的翻譯 起始。通常情況下，5’ UTR會阻止mRNA的翻譯。不過，在腫瘤細(xì)胞中，5’ UTR對翻譯的抑制 作用可為elF-4E所逆轉(zhuǎn)。elF-4E是位于人類第四號染色體上、編碼分子量為25KD多肽的 癌基因，它能與mRNA 5’末端的帽狀結(jié)構(gòu)(m7GpppN)特異性結(jié)合，使mRNA 5’末端非編碼區(qū) (5’UTR)的二級結(jié)構(gòu)松動、解旋并形成一段單鏈的mRNA。單鏈結(jié)構(gòu)的mRNA使起始密碼子得 以掃描，啟動mRNA與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。因此，eIF-4E被認(rèn)為是翻譯的最有 效的限速調(diào)節(jié)因子。同時，eIF-4E與真核細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)運和降解關(guān)系密切。eIF_4E在多 種惡性腫瘤組織中都具有高表達(dá)，對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、分裂以及獲得向外侵蝕、轉(zhuǎn)移的能力 等方面都有著重要的影響。因此，5’UTR可有效限制腫瘤治療基因的mRNA只在腫瘤細(xì)胞中 翻譯，而在正常細(xì)胞中不翻譯。同樣地，3’ UTR也包含了若干翻譯調(diào)控元件(1)調(diào)控蛋白識別位點元件。通常 3’UTR的調(diào)控需要調(diào)控蛋白復(fù)合體而不是單個蛋白；(2)反義microRNA，通過靶向3’UTR內(nèi) 的互補序列來抑制翻譯功能；(3) CPE (Cytoplasmic polyadenylation elements, CPE)和六 聚核苷酸AAUAAA，激活mRNA polyA尾巴的延長，同時CPE對翻譯抑制也有作用；G) PolyA 尾巴，增加PolyA尾巴的長度可補充額外的polyA結(jié)合蛋白(poly (A)-binding protein, PABP)分子，促進(jìn)翻譯。3’ UTR具有調(diào)控mRNA翻譯、維持mRNA的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位等多 重作用。在真核生物細(xì)胞中，基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、翻譯等多種水平的調(diào)控。然而，在目前 的腫瘤治療基因的靶向表達(dá)技術(shù)中，更多地是集中在轉(zhuǎn)錄靶向表達(dá)水平，其調(diào)控下的mRNA 穩(wěn)定性與表達(dá)效率還有待提高。因此，只有完整模擬真核基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄和翻譯雙重水平上共同調(diào)控治療基因，才有可能在腫瘤靶細(xì)胞中實現(xiàn)最高的特異表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是設(shè)計并構(gòu)建一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，應(yīng)用該調(diào) 控盒調(diào)控腫瘤治療基因使之在腫瘤靶細(xì)胞中實現(xiàn)特異表達(dá)，并因此構(gòu)造腫瘤特異性的基因 治療系統(tǒng)。本發(fā)明針對腫瘤治療基因的靶向表達(dá)技術(shù)，設(shè)計并提供一種嵌合的腫瘤特異性基 因表達(dá)調(diào)控盒，以實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯雙重水平上調(diào)控腫瘤治療基因的表達(dá)，使之表達(dá)局限 于腫瘤靶細(xì)胞內(nèi)，而在其他正常細(xì)胞中不表達(dá)。本發(fā)明提供了一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，它包含腫瘤特異性基因啟 動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、多克隆位點、基因表達(dá)增強子和多聚腺苷酸 信號區(qū)；腫瘤特異性基因啟動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、基因表達(dá)增強 子和多聚腺苷酸信號區(qū)依次連接，多克隆位點位于腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū) 和多聚腺苷酸信號區(qū)之間，與基因表達(dá)增強子相互獨立。上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒中，所述的腫瘤特異性基因啟動子是端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶基因啟動子、存活素基因啟動子、環(huán)氧合酶2基因啟動子、缺氧誘導(dǎo)因子基因啟動子、 0ct-3/4反應(yīng)元件、E2F反應(yīng)元件、進(jìn)展提高基因啟動子、早期生長反應(yīng)因子1基因啟動子、 肝素結(jié)合細(xì)胞因子基因啟動子、甲胎蛋白基因啟動子、癌胚抗原CEA基因啟動子、雌激素 反應(yīng)元件、抗上皮粘蛋白基因啟動子、Probasin基因啟動子、前列腺特異性抗原基因啟動 子、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑基因啟動子、酪氨酸激酶基因啟動子、嗜鉻素基因啟動子、 Uroplakin II基因啟動子、Musashi-I基因啟動子、巢蛋白基因啟動子或者間皮素基因啟動 子中的任意一種。上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒中，所述的腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯 區(qū)可以是堿性成纖維細(xì)胞生長因子2的5’端非翻譯區(qū)、人凋亡抑制蛋白hBcl-XL的5’端 非翻譯區(qū)、人缺氧誘導(dǎo)因子hHIF-Ι的5’端非翻譯區(qū)或者人血管內(nèi)皮生長因子的5’端非翻 譯區(qū)之一。例如，所述的腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)是堿性成纖維細(xì)胞生長因 子2的5’端非翻譯區(qū)。上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒中，所述的基因表達(dá)增強子是乙肝病毒增強子、 SV40增強子、巨細(xì)胞病毒增強子、甲胎蛋白增強子或者癌胚抗原增強子中的任意一種或者 幾種。上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒中，該腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的多聚腺苷酸 信號區(qū)之前還有腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件3’端非翻譯區(qū)。上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒中，所述的腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件3’端非翻譯 區(qū)可以是表皮生長因子受體的3’端非翻譯區(qū)、抑癌基因p53的3’端非翻譯區(qū)或者人VEGF 的3’端非翻譯區(qū)。例如，所述的腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件3’端非翻譯區(qū)是表皮生長因子 受體的3’端非翻譯區(qū)。本發(fā)明還提供了上述腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的制備方法，即分別制備腫瘤特 異性基因表達(dá)調(diào)控盒的各個組成部分，然后將其依次連接。構(gòu)建嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的具體步驟如下
利用常規(guī)的分子生物學(xué)與分子克隆技術(shù)，建立嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控 盒，該調(diào)控盒是由腫瘤特異性基因啟動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、增強子 (enhancer)和/或3’端非翻譯區(qū)、以及多聚腺苷酸信號區(qū)等組成。上述腫瘤特異性基因啟動子包括但不限于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERTOmman telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因啟動子、存活素(Survivin)基因啟動 子、環(huán)氧合酶2(CyclooxygenaseD基因啟動子、缺氧誘導(dǎo)因子HIF(Hypoxia-inducible factor)基因啟動子、早期生長反應(yīng)因子Egr-I (Early growth response 1)基因啟動 子、0ct-3/4 反應(yīng)元件(0ct-3/4response elements)、E2F 反應(yīng)元件(E2F_responsive element)、進(jìn)展提高基因PEG-3 (!Progression elevated gene-3)基因啟動子、肝素結(jié)合細(xì) 胞因子(Midkine)基因啟動子、甲胎蛋白AFPfelpha-fetoprotein)基因啟動子、癌胚抗 原 CEA(carcinoembryonic antigen)基因啟動子、雌激素反應(yīng)兀件(Estrogen-response element)、抗上皮粘蛋白MUCl (Mucin 1)基因啟動子、ftx)basin基因啟動子、前列腺特 異性抗原PSA(prostate-specific antigen)基因啟動子、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑 SLPI (secretory leukoprotease inhibitor)基因啟云力子、酷氛酸激BlTyr (Tyrosinase)基 因啟動子、嗜鉻素CgA(Chromogranin A)基因啟動子、Uroplakin II基因啟動子、Musashi-I 基因啟動子、巢蛋白(Nestin)基因啟動子、間皮素(Mesothelin)基因啟動子等；上述5’端非翻譯區(qū)包括但不限于堿性成纖維細(xì)胞生長因子2 (basic fibroblast growth factor 2，bFGF_2)的5，端非翻譯區(qū)、人凋亡抑制蛋白hBcl-XL的5，端非翻譯區(qū)、 人缺氧誘導(dǎo)因子hHIF-Ι的5，端非翻譯區(qū)、人血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的5，端非翻譯區(qū)等；上述增強子包括但不限于乙肝病毒增強子WRE(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element 或 Woodchuck Response Element, WRE)、 SV40 (simian virus 40)增強子、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增強子、甲胎蛋白增 強子、癌胚抗原增強子等；上述3’端非翻譯區(qū)包括但不限于表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的3，端非翻譯區(qū)、抑癌基因p53的3，端非翻譯區(qū)、人VEGF的3，端非翻 譯區(qū)等；上述多聚腺苷酸信號區(qū)包括但不限于牛生長素多聚腺苷酸信號區(qū)(bovine growth hormone polyadenylation signal，BGHpolyA)、SV40ployA 等。多克隆位點的主要功能是插入外源DNA片段，通常由一系列外切酶組成，可以由 若干常規(guī)的外切酶串聯(lián)而得，例如 Sail, Hindlll，EcoRI，SacI, KpnI, EcoRV，NotI, SphI, NcoI, XhoI, SmaI, PacI, NheI, BamHI，等等。利用本發(fā)明的嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒可以構(gòu)建其調(diào)控下的基因表達(dá) 報告系統(tǒng)。利用常規(guī)的分子生物學(xué)與分子克隆技術(shù)，構(gòu)建上述嵌合的腫瘤特異性基因表 達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的基因表達(dá)報告系統(tǒng)，包括但不限于定性的增強綠色熒光蛋白基因報告 系統(tǒng)EGFP (Enhance Green Fluorescence Protein)和定量的熒光素酶基因報告系統(tǒng) (Luciferase reporter)。由此，可以進(jìn)一步構(gòu)建嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤治療基因及其基因治療系統(tǒng)。利用常規(guī)的分子生物學(xué)與分子克隆技術(shù)，構(gòu)建上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào) 控盒調(diào)控的腫瘤治療基因及其基因治療系統(tǒng)。本發(fā)明的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒可以應(yīng)用于腫瘤的基因治療，即將腫瘤治療 基因插入腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的多克隆位點，用于制備抗腫瘤基因治療藥劑。所述的腫瘤治療基因是細(xì)菌毒素基因、自殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、抗新生血管 形成基因、放射線增敏基因、腫瘤抑制基因、免疫調(diào)節(jié)因子基因中的任意一種或幾種。上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤治療基因，包括但不限于(1)細(xì)菌毒素基因，包括但不限于白喉毒素(diphtheria toxin, DT)、綠膿桿菌 夕卜毒素(pseudomonas exotoxin, ΡΕ)、霍舌匕毒素(choleratoxin, CT)、志賀氏毒素(shiga toxin, ST)、百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、葡萄球菌腸毒素 B 基因(staphylococcal enterotoxin B, SEB)等基因；(2)殺基因，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase，HSV-TK)、水痘帶狀泡疹病毒胸苷激酶(Varicella-hster Virus Thymidine Kinase, VZV-TK)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ε· coli Cytosine Deaminase, CD)、 大腸桿菌脫氧胞苷激酶(Ε. coli Deoxycytidine Kinase, DCK)、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷 酸核H轉(zhuǎn)移BS (E. coli hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT)及 細(xì)胞色素 p450 (Cytochromo P450, CYP)等基因；(3)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因，包括但不限于B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因家族、月旨肪酸合Bl (Fatty acid synthase,Fas)及其配 體(Fas-ligand, Fas_L)、bax、caspase 等基因；(4)抗新生血管形成基因，包括但不限于內(nèi)皮抑素(Endostatin)、血管生 長抑素(angiostatin)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF ；血管生成素 (angiopoietin-2,Ang-2)-7 (Matrix Metalloproteinases 7,MMP-7)誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia induced factor-1，HIF-1)、存活素(Survivin)等基因；(5)放射增敏基因，包括但不限于DNA依賴性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)、Ku70、Ku80、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(ataxia-telangiectasia mutant, ATM)等基因；(6)腫瘤抑制基因，包括但不限于抑癌基因p53、Rb、PTEN(phosphatase and tensin homolog, PTEN)、APC(adenomatous polyposis coli)、BRCAl 禾口 2(breast cancer 1, -2, early onset)等基因；(7)免疫調(diào)節(jié)因子，包括但不限于細(xì)胞白介素-2、-12和-Mdnterleukin 2，-12，-24，IL-2, IL-12，IL-24)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF) > zF Λ : _ α ， 一 β ， 一 γ (Interferon alpha, -beta, -gama, IFN-α，一β，一 γ)、月中瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)及 腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)等 基因；(8)上述基因的融合基因；
(9)病毒復(fù)制關(guān)鍵因基因，包括但不限于腺病毒早期基因E1A、單純皰疹病毒極 早期基因ICP4和ICP27等基因。本發(fā)明的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒可以用于制備抗腫瘤基因治療的質(zhì)粒系統(tǒng)、 重組病毒系統(tǒng)或者溶瘤病毒系統(tǒng)。上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤基因治療系統(tǒng)，包括但不限 于(1)質(zhì)粒系統(tǒng)，包括但不限于包含上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的 真核基因表達(dá)空載質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒和治療基因質(zhì)粒，上述質(zhì)粒和/或與脂質(zhì)體、聚 乙二胺(Polyethylenimine, PEI)、聚乳酸(poly-lactic acid, PLA)、聚乳酸-甘醇酸 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、殼聚糖(Chitosan)等納米微粒組成腫瘤基因治 療系統(tǒng)；(2)重組病毒系統(tǒng)，包括但不限于包含上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒 調(diào)控報告基因、腫瘤治療基因及其空載的各種復(fù)制缺陷型的重組腺病毒、重組單純皰疹病毒、重組痘病毒等；(3)溶瘤病毒系統(tǒng)，包括但不限于包含上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒 調(diào)控報告基因、腫瘤治療基因及其空載的各種選擇復(fù)制型的溶瘤腺病毒、溶瘤單純皰疹病 毒、溶瘤痘病毒等。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體提供一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控 盒。應(yīng)用該調(diào)控盒調(diào)控腫瘤治療基因的表達(dá)，并因此構(gòu)造腫瘤特異性的基因治療系統(tǒng)。本 發(fā)明通過有效調(diào)控腫瘤治療基因的表達(dá)使之局限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，顯著提高了治療基因表達(dá) 的特異性，進(jìn)而有效提高腫瘤基因治療的安全性，降低其對正常組織和細(xì)胞的損害。以治療 基因sHSVl-tk為例，嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的對腫瘤細(xì)胞靶向性殺傷能 力比正常細(xì)胞提高50至800倍。利用該嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒構(gòu)建成的重組 腺病毒系統(tǒng)，對腫瘤細(xì)胞靶向性殺傷能力要提高300至1800倍。可有效提高荷瘤小鼠生存 時間2-5月，并且荷瘤小鼠治愈率可達(dá)50-80%。


圖1嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒及其調(diào)控的報告基因、治療基因示意 圖。分別是骨架質(zhì)粒pBA-MCS ；空載表達(dá)質(zhì)粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS ；報告基因質(zhì)粒 phTUff-EGFP 和 phTUWR-EGFP ；腫瘤基因治療質(zhì)粒 phTUW-sHSVl-tk 和 phTUWR-sHSVl-tk。
具體實施例方式實施例1分離和克隆腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控元件A. hTERT基因啟動子
端粒酶是一種RNA依賴的DNA多聚酶，端粒酶的激活是細(xì)胞獲得永生化和惡性變 的重要機(jī)制。研究顯示，端粒酶在85%以上的腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)陽性表達(dá)，而在幾乎所有的成 人體細(xì)胞中呈現(xiàn)陰性。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT編碼的端粒酶催化亞單位，是端粒酶 活性的決定性因素。hTERT自身的活性主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，hTERT基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性在這一過程中扮演重要角色。由于hTERT啟動子只在腫瘤細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，因此 hTERT是實現(xiàn)治療基因在腫瘤細(xì)胞中靶向性表達(dá)的理想轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本發(fā)明實施例應(yīng)用 常規(guī)PCR技術(shù)，以人類細(xì)胞DNA為模板，擴(kuò)增人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因啟動子片段(SEQ No. 1)，然后插入到TA克隆載體pCR2. 1 (Invitrogen)中，經(jīng)測序確證該序列。B. bFGF-25，UTR近年來，利用高度結(jié)構(gòu)化的5’ UTR來調(diào)控治療基因的翻譯水平以實現(xiàn)其在腫瘤細(xì) 胞中特異性表達(dá)已多有報道。在通常情況下，5’UTR會阻止mRNA的翻譯。但在腫瘤細(xì)胞中 因高表達(dá)eIF-4E可逆轉(zhuǎn)5’ UTR對翻譯的抑制作用。本發(fā)明實施例采用常規(guī)的RT-PCR技 術(shù)，以大鼠細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增大鼠bFGF-2的5’ UTR(SEQ No. 2)，然后插入到TA克隆 載體pCR2. 1 (Invitrogen)中，經(jīng)測序確證該序列。C. WRE通常腫瘤特異性的基因啟動子其轉(zhuǎn)錄活性相對較弱，需要借助增強子來進(jìn)一步提 高其轉(zhuǎn)錄能力。本發(fā)明實施例應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)，以乙型肝炎病毒基因組DNA為模板，擴(kuò)增 乙肝病毒增強子WRE (SEQ No. 3)，然后插入到TA克隆載體pCR2. 1 (Invitrogen)中，經(jīng)測序 確證該序列。D. EGFR 3' UTR在真核生物細(xì)胞中，3’UTR具有調(diào)控mRNA翻譯、維持mRNA的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位 等多重作用。本發(fā)明實施例應(yīng)用常規(guī)RT-PCR技術(shù)，以人類細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增人表皮生 長因子受體EGFR的3，UTR(SEQ No. 4)，然后插入到TA克隆載體pCR2. 1 (Invitrogen)中， 經(jīng)測序確證該序列。E. BGHpolyA在真核生物細(xì)胞中，其mRNA的轉(zhuǎn)錄終止需要借助多聚腺苷酸信號。本發(fā)明實施例 應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)，以質(zhì)粒pCDNA3. 1(+) (Invitrogen)為模板，擴(kuò)增牛生長素的多聚腺苷酸 信號區(qū)BGHpolyA (SEQ No. 5)，然后插入到TA克隆載體pCR2. 1 (Invitrogen)中，經(jīng)測序確證 該序列。實施例2構(gòu)建嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒上述分離和克隆的各種腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控元件，需循一定順序擺列 組合，構(gòu)建成嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒。本發(fā)明實施例應(yīng)用分子克隆技術(shù)基本原 理，設(shè)計并化學(xué)合成多克隆位點MCS (Multiple Cloning Sites,MCS) (SEQ No. 6)，經(jīng)PacI和 XhoI雙酶切后，插入到經(jīng)同樣雙酶切的pORF-MCS (Invivogen)中構(gòu)成骨架質(zhì)粒pBA_MCS (圖 1A)。把實施例1中的經(jīng)測序確證的hTERT基因啟動子序列用EeoRI和HindIII雙酶切、 bFGF-25’ UTR用HindIII和BamHI雙酶切、WRE用HindIII和SalI雙酶切并補平末端、 EGFR 3，UTR用BglII酶切、BGHpolyA用BglII和XhoI雙酶切，依次插入到上述骨架質(zhì)粒 pBA-MCS,分別構(gòu)建成包含不同的嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的表達(dá)質(zhì)粒phTUW-MCS 禾口 phTUWR-MCS (圖 IB) ο實施例3建立嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的報告基因上述構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS中包含的嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒能否發(fā)揮作用，需進(jìn)一步應(yīng)用報告基因在細(xì)胞系中進(jìn)行分析和驗證。本發(fā)明實 施例應(yīng)用NcoI和^CbaI雙酶切從質(zhì)粒PFUGW(Addgene)切出增強綠色熒光蛋白基因EGFP， 分別插入到經(jīng)同樣酶切的表達(dá)質(zhì)粒PhTUW-MCS和phTUWR-MCS中，構(gòu)建成定性基因報告質(zhì)粒 PhTUff-EGFP和phTUWR-EGFP(圖1C)。應(yīng)用上述報告基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)染各種腫瘤細(xì)胞株系， 確證其腫瘤特異性的雙重調(diào)控基因表達(dá)效果。與正常細(xì)胞(如正常肝細(xì)胞L-02)相比較， 該嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的報告基因EGFP在腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌細(xì)胞 QGY-7703和SMMC-7721以及肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞MHCC97-H等)中表達(dá)的特異性要提高100 至2000倍。實施例4建立嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤治療基因質(zhì)粒系統(tǒng)上述構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒phTUW-MCS和phTUWR-MCS中包含的嵌合的腫瘤特異性基因 表達(dá)調(diào)控盒能否有效調(diào)控腫瘤治療基因的特異性表達(dá)，可進(jìn)一步用體外細(xì)胞殺傷實驗進(jìn)行 分析和驗證。本發(fā)明實施例應(yīng)用NcoI和NheI雙酶切從質(zhì)粒pMOD-HSVltkanvivogen)切 出可溶性的sHSVl-tk基因，分別插入到經(jīng)NcoI和XbaI雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒phTUW-MCS和 phTUWR-MCS中，構(gòu)建成腫瘤基因治療裸質(zhì)粒phTUW-sHSVl-tk和phTUWR-sHSVl-tk (圖ID)。 應(yīng)用上述治療基因裸質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)染各種腫瘤細(xì)胞株系，用常規(guī)的MTT法確證其在腫瘤細(xì) 胞中的特異性表達(dá)與靶向性殺傷效果。與正常細(xì)胞(如正常肝細(xì)胞L-02)相比較，該嵌合 的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的治療基因sHSVl-tk對腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌細(xì)胞 QGY-7703和SMMC-7721以及肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞MHCC97-H等)靶向性殺傷能力要提高50至 800 倍。實施例5建立嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤治療基因重組腺病毒系統(tǒng)上述嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒調(diào)控的腫瘤基因治療裸質(zhì)粒的腫瘤靶向 治療效果可在重組病毒體系和溶瘤病毒體系中得到進(jìn)一步增強和提高。本發(fā)明實施例應(yīng) 用 AdEasy 腺病毒載體系統(tǒng)(AdEasy Adenoviral Vector System, Stratagene)構(gòu)建重 組腺病毒系統(tǒng)，首先應(yīng)用I^acI和BioI雙酶切從腫瘤基因治療裸質(zhì)粒phTUW-sHSVl-tk和 phTUWR-sHSVl-tk中切出完整的雙重靶向調(diào)控的治療基因表達(dá)盒，然后插入到穿梭載體 pShuttle中，再與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι在E. coli BJ5183中進(jìn)行同源重組，得 到重組質(zhì)粒pAd-hTUW/sHSVl-tk和pAd-hTUWR/sHSVl_tk，該重組質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)染293細(xì) 胞得到重組腺病毒Ad-hTUW/sHSVl-tk和Ad-hTUWR/sHSVl-tk。應(yīng)用上述重組腺病毒進(jìn)一步 體外感染各種腫瘤細(xì)胞株系，用常規(guī)的MTT法確證其在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)與靶向性 殺傷效果。與正常細(xì)胞(如正常肝細(xì)胞L-02)相比較，該嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控 盒調(diào)控的治療基因sHSVl-tk對腫瘤細(xì)胞(如肝細(xì)胞癌細(xì)胞QGY-7703和SMMC-7721以及肝 細(xì)胞轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞MHCC97-H等)靶向性殺傷能力要提高300至1800倍。上述重組腺病毒進(jìn) 一步治療各種荷瘤小鼠模型(如上述肝細(xì)胞癌移植瘤模型)，可有效提高荷瘤小鼠生存時 間2-5月，并且荷瘤小鼠治愈率可達(dá)50-80%。序列表<210>1<211>1087100075]<212>DNA0076]<213>Artificial0077]<400>10078]cagaattcctgggaagtcctcagctgtcct0079]ggaccagtggCCgtgtggCttctactgctg0080]tccgaggcttggagccaggtgcctggaccc0081]atgtgaccagatgttggcctcatctgccag0082]ttgtggctggtgtgaggcgcCCggtgCgCg0083]ccctttctcgacgggaccgcCCCggtgggt0084]gtggggacccctcgccgcctgagaacctgc0085]cccaagtcgcggggaagtgttgcagggagg0086]ggagcaatgcgtcctcgggttcgtccccag0087]acgtccggcattcgtggtgcccggagcccg0088]tgggtctccggatcaggccagcggccaaag0089]ccacatcatggcccctccctcgggttaccc0090]ctggggccctCgCtggCgtCcctgcaccct0091]cgcggcccagacccccgggtccgcccggag0092]ccagtggattcgcgggcacagacgcccagg0093]ggacccgggcacccgtcctgccccttcacc0094]gccccgtcccgacccctcccgggtccccgg0095]ccccttcctttccgcggccccgccctctcc0096]gcttatc0097]<210>20098]<211>5750099]<212>DNA0100]<213>Artificial0101]<400>20102]gataagcttgcaccccattcctggcctctg0103]gctctaggggactggagatttccaaaacct0104]tactgctttgggtggaaggctggtcgttgt0105]ttaaactttaggagctgcgtcacggcagtc0106]attctttttgcaacttggaggcgccgggcg0107]gcgcggggccggggtgcaggcggggacgcg0108]acaggggctcggtctctcggcttcaggcgg0109]gggacgcgaaccgggaggctggcagcccgc0110]ggtcggggccggggagccccgagagctgcc0111]atggctgccggcagcatcacttcgcttgga0112]<210>30113]<211>621gcggttgtgccggggccccaggtctggagg60ggctggaagtcgggcctcctagctctgcag120cgaggttgccctccaccctgtgcgggcggg180acagagtgccggggcccagggtcaaggccg240gccagcaggagcgcctggctccatttccca300gattaacagatttggggtggtttgctcatg360aaagagaaatgacgggcctgtgtcaaggag420cactccgggaggtcccgcgtgcccgtccag480ccgcgtctacgcgcctccgtcctccccttc540acgccccgcgtccggacctggaggcagccc600ggtcgccgcacgcacctgttcccagggcct660cacagcctaggccgattcgacctctctccg720gggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaag780cagctgcgctgtcggggccaggccgggctc840accgcgcttcccacgtggcggagggactgg900ttccagctccgcctcctccgcgcggacccc960cccagccccctccgggccctcccagcccct1020tcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcaa10801087tctcccgcaccctatcccttcacagcctgt60gacccgatccctccccagttcagttccttc120gttaaaaggcaggaagggagaaagttgcat180tcctggagaaagctccgccgaacgggacag240tggggaggaggcggcgcgcggggcgggggc300gggtgacgcgggcccgggccgctgtagcac360agtccggctgcactaggctgggagcgcggc420gggcgagccgCgCtggggggccgaggccgg480gcagcggggtCCCggggCCgcggaggggcc540tcctt5750114]<212>DNA0115]<213>Artificial0116]〈400>30117]caaagcttatcgataatcaacctctggatt0118]ttaactatgttgctccttttacgctatgtg0119]ctattgcttcccgtatggctttcattttct0120]tttatgaggagttgtggcccgttgtcaggc0121]acgcaacccccactggttggggcattgcca0122]ctttccccctccctattgccacggcggaac0123]caggggctcggctgttgggcactgacaatt0124]ttccttggctgctcgcctgtgttgccacct0125]tcccttcggccctcaatccagcggaccttc0126]ctcttccgcgtcttcgccttcgccctcaga0127]cgcatcgataccgtcgacctC0128]<210>40129]<211>16770130]<212>DNA0131]<213>Artificial0132]<400>40133]gaagatctagtatgagccctaaaaatccag0134]caggtcctccatcccaacagccatgcccgc0135]caacgtttacaccgactagccaggaagtac0136]attcctttgtcttcaaactgtgaagcattt0137]ctttgagcagaaatttatctttcaaagagg0138]aggatttttattgattggggatcttggagt0139]atgggctcttccaacaaggaagaagcttgc0140]ggcccaactgtgagcaaggagcacaagcca0141]ggttctgcttcaaggcttccactgcaaaac0142]cagcaggccggatcggtactgtatcaagtc0143]tcccttcctgggcaaagaagaaacggaggg0144]aaaaatgtccccacggtacttactccccac0145]ttagactgacttgtttgtcttccattccat0146]ttgctgtcatgaaatcagcaagagaggatg0147]cacattggattcatcagcatttggaccaat0148]ggatagcaccgcttttgttctcgcaaaaac0149]gcatcaggtcctttggggcatagatcagaa0150]cctttagccatcaccccaaccccccaaaat0151]ctccttttacttcacttcaaaagcttttta0152]ctgcccccaaaccccctccttacgctttgtacaaaatttgtgaaagattgactggtattc60gatacgctgctttaatgcctttgtatcatg120cctccttgtataaatcctggttgctgtctc180aacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctg240ccacctgtcagctcctttccgggactttcg300tcatcgccgcctgccttgcccgctgctgga360CCgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcct420ggattctgcgcgggacgtccttctgctacg480cttcccgcggcctgctgccggctctgcggc540cgagtcggatctccctttgggccgcctccc600621actctttcgatacccaggaccaagccacag60attagctcttagacccacagactggttttg120ttccacctcgggcacattttgggaagttgc180acagaaacgcatccagcaagaatattgtcc240tatatttgaaagtatatgtg300ttttcattgtcgctattgatttttacttca360tggtagcacttgctaccctgagttcatcca420caagtcttccagaggatgcttgattccagt480actaaagatccaagaaggccttcatggccc540atggcaggtacagtaggataagccactctg600gatggaattcttccttagacttacttttgt660tgatggaccagtggtttccagtcatgagcg720tgttttgaaactcagtatgctgcccctgtc780acacatcaaataataactcggattccagcc840agcccacagctgagaatgtggaatacctaa900gtatctcctaatttgaggctcagatgaaat960gactacaaaa atgaagctgctctgaaatct1020tagtttgtgttacttatgga agatagtttt1080ctcaaagagt atatgttccctccaggtcag1140C 3. C 3. C 3.3.3.3.3.gtgtctctgccttgagtcat12000153]ctattcaagcacttacagctctggccacaa cagggcattttacaggtgcg aatgacagta12600154]gcattatgagtagtgtggaa ttcaggtagt aaatatgaaa ctagggtttg aaattgataa13200155]tgctttcacaacatttgcag atgttttaga aggaaaaaag ttccttccta aaataatttc13800156]tctacaattggaagattgga agattcagct agttaggagcccaccttttttcctaatctg14400157]tgtgtgccctgtaacctgactggttaacag cagtcctttg taaacagtgttttaaactct15000158]cctagtcaatatccaccccatccaatttatcaaggaagaa atggttcaga aaatattttc15600159]agcctacagttatgttcagtC￡lC￡lC￡lC￡lC￡ltacaaaatgttccttttgcttttaaagtaa16200160]tttttgactcccagatcagtcagagcccct acagcattgttaagaaagta gatctac16770161]<210>50162]<211>2540163]<212>DNA0164]<213>Artificial0165]<400>50166]gatagatcttagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct600167]ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtct1200168]gagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattg1800169]ggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaag2400170]aaccagctcgagat2540171]<210>60172]<211>780173]<212>DNA0174]<213>Artificial0175]<400>60176]ccttaattaagaattcgatatcaagcttgacggatccccatgggtcgactctagaattta600177]aatagatctctcgagcag781權(quán)利要求
1.一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，它包含腫瘤特異性基因啟動 子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、多克隆位點、基因表達(dá)增強子和多聚腺苷酸信 號區(qū)；腫瘤特異性基因啟動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、基因表達(dá)增強子 和多聚腺苷酸信號區(qū)依次連接，多克隆位點位于腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)和 多聚腺苷酸信號區(qū)之間，與基因表達(dá)增強子相互獨立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，所述的腫瘤特異 性基因啟動子是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子、存活素基因啟動子、環(huán)氧合酶2基因啟動子、 缺氧誘導(dǎo)因子基因啟動子、0ct-3/4反應(yīng)元件、E2F反應(yīng)元件、進(jìn)展提高基因啟動子、早期生 長反應(yīng)因子1基因啟動子、肝素結(jié)合細(xì)胞因子基因啟動子、甲胎蛋白基因啟動子、癌胚抗原 CEA基因啟動子、雌激素反應(yīng)元件、抗上皮粘蛋白基因啟動子、I^robasin基因啟動子、前列 腺特異性抗原基因啟動子、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑基因啟動子、酪氨酸激酶基因啟動 子、嗜鉻素基因啟動子、tooplakin II基因啟動子、Musashi-I基因啟動子、巢蛋白基因啟動 子或者間皮素基因啟動子中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，所述的腫瘤特異 性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)是堿性成纖維細(xì)胞生長因子2的5’端非翻譯區(qū)、人凋亡抑 制蛋白hBcl-XL的5’端非翻譯區(qū)、人缺氧誘導(dǎo)因子hHIF-Ι的5’端非翻譯區(qū)或者人血管內(nèi) 皮生長因子的5’端非翻譯區(qū)之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，所述的基因表達(dá) 增強子是乙肝病毒增強子、SV40增強子、巨細(xì)胞病毒增強子、甲胎蛋白增強子或者癌胚抗原 增強子中的任意一種或者幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，該腫瘤特異性基 因表達(dá)調(diào)控盒的多聚腺苷酸信號區(qū)之前還有腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件3’端非翻譯區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒，其特征在于，所述的腫瘤特異 性翻譯調(diào)控元件3’端非翻譯區(qū)是表皮生長因子受體的3’端非翻譯區(qū)、抑癌基因p53的3’ 端非翻譯區(qū)或者人VEGF的3’端非翻譯區(qū)。
7.權(quán)利要求1-6中任意一種腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的制備方法，其特征在于，分 別制備腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的各個組成部分，然后將其依次連接。
8.權(quán)利要求1-6中任意一種腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的應(yīng)用，其特征在于，將腫瘤 治療基因插入腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的多克隆位點，用于制備抗腫瘤基因治療藥劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤治療基因是細(xì)菌毒素基因、自 殺基因、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因、抗新生血管形成基因、放射線增敏基因、腫瘤抑制基因、免疫調(diào) 節(jié)因子基因中的任意一種或幾種。
10.權(quán)利要求1-6中任意一種腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒的應(yīng)用，其特征在于，將所述 的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒用于制備抗腫瘤基因治療的質(zhì)粒系統(tǒng)、重組病毒系統(tǒng)或者溶 瘤病毒系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體提供一種嵌合的腫瘤特異性基因表達(dá)調(diào)控盒。它包含腫瘤特異性基因啟動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、多克隆位點、基因表達(dá)增強子和多聚腺苷酸信號區(qū)；腫瘤特異性基因啟動子、腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)、基因表達(dá)增強子和多聚腺苷酸信號區(qū)依次連接，多克隆位點位于腫瘤特異性翻譯調(diào)控元件5’端非翻譯區(qū)和多聚腺苷酸信號區(qū)之間，與基因表達(dá)增強子相互獨立。本發(fā)明通過有效調(diào)控腫瘤治療基因的表達(dá)使之局限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，顯著提高了治療基因表達(dá)的特異性，進(jìn)而有效提高腫瘤基因治療的安全性，降低其對正常組織和細(xì)胞的損害。
文檔編號A61P35/00GK102051358SQ20091019857
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者方煜翔, 田聆, 薛京倫, 陳金中 申請人:復(fù)旦大學(xué)