專利名稱：一種藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選模型領(lǐng)域，具體涉及藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，可應(yīng)用于藥物口服吸收的預(yù)測和篩選。
背景技術(shù)：
Caco-2 細胞(the human colon carcinoma cell line，人結(jié)腸腺癌細胞系，簡稱 Caco-2)來源于人結(jié)腸癌細胞，是目前公認用于預(yù)測人體腸道內(nèi)藥物吸收最為經(jīng)典的體外模型之一。Caco-2細胞可在培養(yǎng)條件下自發(fā)進行上皮樣分化并可以形成緊密聯(lián)結(jié)，分化出絨毛面和基底面，其形態(tài)學、標志酶的功能表達、滲透特征等與小腸上皮細胞相似，因此，此種細胞可以模擬小腸上皮細胞，廣泛用于藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究。
在傳統(tǒng)的Caco-2培養(yǎng)模型中Caco-2能表達許多載體蛋白和多種藥物代謝酶，包括P-糖蛋白(p-glycoprotein，P_gp)、CYP3A4等。傳統(tǒng)Caco-2細胞模型的建立方法為 細胞種板后在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天，前7天隔天換液，后14天每天換液；但是該模型比較明顯的缺陷是需要長達21天的培養(yǎng)時間，使其應(yīng)用于預(yù)測藥物口服吸收時的實驗周期過長，不能應(yīng)付現(xiàn)今大量先導化合物涌現(xiàn)后所需的高通量篩選。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對傳統(tǒng)的Caco-2培養(yǎng)模型需要較長培養(yǎng)時間的缺陷，提供一種藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，最大限度地縮短細胞培養(yǎng)周期，提高藥物口服吸收預(yù)測和篩選的效率。
本方法的原理是利用體外模型與體內(nèi)吸收的相關(guān)性，進行口服藥物吸收的預(yù)測。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的。
一種藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，包括如下步驟(1)WDMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng) Caco-2 細胞， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含體積分數(shù)20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 UmL-1的青霉素和 100 U-πιΓ1的鏈霉素；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板，即在Transwell板上的每個孔中加入鼠尾膠原，風干過夜；鼠尾膠原的配制方法為取IOOrnl超純水，加入100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入 5mg/ml鼠尾膠原anl，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1 ；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(4)第2、3天每天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第4、5、6天加分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為采用上皮細胞分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基后添加MIOT制得；一共培養(yǎng)6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
優(yōu)選地，步驟(1)中培養(yǎng)Caco-2細胞是將Caco-2細胞放入培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，隔天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37°C，通入5% CO2，相對濕度90%。
優(yōu)選地，步驟(2)中每個孔中加入上述鼠尾膠原800 μ L。
優(yōu)選地，步驟(3)的接種密度為5Χ105/孔，Transwell板下腔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.5mLo
其中Transwell板為一種具有0.3μπι孔徑的碳酸聚酯膜，起支持Caco-2單層細胞的作用；步驟(4)中的MIOT為MIOT (BD)公司產(chǎn)品，是包括牛胰島素、霍亂菌素等成分的混合物。
在藥物的轉(zhuǎn)運實驗進行前及結(jié)束后，均用細胞電位儀測定跨上皮細胞電阻 (trans印ithelial electrical resistance, TEER)，以確定單層細胞的緊密性與完整性， 符合條件的細胞可用于實驗。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢a)提高藥物體外吸收的有效篩選率。本發(fā)明模型使藥物經(jīng)過細胞的吸收、代謝等過程后，取藥進行測定，使得體外篩選的結(jié)果與整體實驗數(shù)據(jù)的基本吻合；另一方面，本發(fā)明減少了細胞的培養(yǎng)時間，從而減少了實驗中的不穩(wěn)定因素，如污染等。因此該快速藥物篩選模型提高了藥物吸收預(yù)測和篩選的可靠性，可有效地提高藥物的篩選率；b)簡化了篩選程序。常規(guī)的體外Caco-2細胞篩選模型需要長達21天的培養(yǎng)，這大大制約了初期先導化合物體外轉(zhuǎn)運和吸收篩選的效率。該發(fā)明將培養(yǎng)時間減少為6天，篩選速度是傳統(tǒng)培養(yǎng)時間的3倍以上，簡化了篩選程序，節(jié)約了大量的人力物力；c)操作方便，節(jié)約成本。對比國內(nèi)外報道的篩選模型，本發(fā)明模型的經(jīng)濟效益較高。關(guān)于快速篩選的模型，有報道用纖維膠原鋪板，但其成本較高，成本上消耗比21天培養(yǎng)的傳統(tǒng)模型更甚。本發(fā)明利用了鼠尾膠原鋪板，同樣也能達到效果，實現(xiàn)了成本與效率的雙贏， 在成本與效率上都比目前報道的預(yù)測模型具有優(yōu)勢。


圖1 藥物在Caco-2細胞單層模型中的轉(zhuǎn)運途徑，其中(I )跨細胞被動轉(zhuǎn)運 (細胞通透性)；(II )細胞旁轉(zhuǎn)運；(III)載體介導的轉(zhuǎn)運(a:攝入，b外排)；(IV)經(jīng)代謝后的轉(zhuǎn)運；圖2 :7天Caco-2細胞模型電阻值隨著細胞培養(yǎng)天數(shù)的變化； 圖3:熒光黃標準曲線；圖4 熒光黃在Caco-2單層細模型中的透過值(均數(shù)士方差，η = 3)； 圖5:普萘洛爾標準曲線；圖6 普萘洛爾在Caco-2單層細模型中的透過值(均數(shù)士方差，η = 3)； 圖7 :7天Caco-2細胞模型預(yù)測與體外吸收相關(guān)性分析； 圖8 :21天Caco-2細胞模型預(yù)測與體外吸收相關(guān)性分析； 圖9:地高辛標準曲線；圖10:地高辛在21天Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運特點； 圖11 地高辛在7天Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運特點； 圖12 21天Caco-2細胞模型單層的驗證(光斑為細胞核)； 圖13 :7天Caco-2細胞模型單層的驗證(光斑為細胞核)；圖14 21天Caco-2細胞模型中由于種板密度過高出現(xiàn)多層細胞(光斑為細胞核)。
具體實施方式
實施例1模型的建立。
圖1為Caco-2細胞模型中藥物在細胞中的轉(zhuǎn)運途徑，本發(fā)明根據(jù)這些轉(zhuǎn)運途徑建立快速Caco-2細胞單層模型，即上述藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型，其建立方法具體步驟如下(1)以DMEM(Dulbecco，s modified Eagle medium)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含體積分數(shù)20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 Umr1的青霉素和100 Umr1的鏈霉素；將Caco-2細胞培養(yǎng)于25 cm2卡式一次性培養(yǎng)瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，通入5% CO2，相對濕度90%條件下進行培養(yǎng)，隔天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板。鼠尾膠原的配制方法為取IOOml超純水，加入 100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入5mg/ml鼠尾膠原(生友技術(shù)有限公司)2ml，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1。在12孔Transwel 1板上，每孔加入SOOyL上述鼠尾膠原，風干過夜；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在12孔Transwell板上，接種密度約為5 X IO5/孔，Transwell板下腔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1. 5 mL ；(4)第2、3天每天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第4、5、6天加分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為采用上皮細胞分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基后添加MIOT制得；一共培養(yǎng)6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
在藥物的轉(zhuǎn)運實驗進行前及結(jié)束后，均用細胞電位儀測定跨上皮細胞電阻，以確定單層細胞的緊密性與完整性，符合條件的細胞可用于實驗。
實施例2采用幾種標準的底物或標記物在實施例1建立的藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型(下面稱為7天細胞模型)中進行轉(zhuǎn)運實驗，對細胞模型的完整性、通透性、細胞旁路轉(zhuǎn)運以及 P-糖蛋白(P-gp)的表達進行驗證，以及進一步形態(tài)學的考察，并將實驗結(jié)果與傳統(tǒng)的21天 Caco-2細胞模型進行比較。
一、細胞模型的完整性細胞電阻值是評價Caco-2細胞模型完整性的指標。在本研究中我們使用細胞電位儀 (EVOM)對快速Caco-2模型的電阻值進行測量在細胞種板前對Transwell板模電阻值進行測量，為空白值Ω 1，收板時測定的電阻值為最終電阻值Ω2，即Ω (TEER) = Ω 1-Ω 2
使用細胞電位儀(EVOM)對實施例1建立的快速Caco-2模型的電阻值進行測量， 結(jié)果如圖2所示，細胞電阻值均大于350 Ω。根據(jù)文獻報道其電阻值應(yīng)在150-650 Ω之間， 均在合格范圍之內(nèi)。
二、細胞旁路轉(zhuǎn)運熒光黃是評價Caco-2細胞模型旁路透過的經(jīng)典標記物。本實驗采用熒光分光光度計法測定熒光黃濃度。熒光黃激發(fā)波長為420nm，發(fā)射波長為520nm。
將20ng/mL熒光黃加于Caco-2細胞單層頂端(A面)，于池后從基底端(B面)取樣進行檢測。
藥物表觀滲透系數(shù)(Papp)根據(jù)下式計算 Papp= [(dC/dt (V) ]/(AXC0)C0為加藥側(cè)的藥物初始濃度，dC/dt為在接受側(cè)藥物出現(xiàn)的速率，V為接受側(cè)的溶液體積，A為Transwell多聚碳酸酯膜的表面積。
如圖3所示HBSS(Hanks Balanced Salt Solutions，漢克平衡鹽溶液)溶液中熒光黃的標準曲線方程為Y=157. 4Χ-26. 46，r=0. 999 (n=5)。線性范圍為31. 25 2000ng/ml。 其中Y為熒光黃的吸光度值(yg/ml)，X為熒光黃濃度(yg/ML)。如圖4所示可見Caco-2 細胞單層的緊密性良好，熒光黃在21天細胞模型和7天細胞模型中透過值分別0. 176和 0. 159 (10_6cm/s)，結(jié)果無統(tǒng)計學差異，7天細胞模型可能由于培養(yǎng)時間減少，不確定因素作用時間減少，方差較小。
三、細胞通透性普萘洛爾是評價Caco-2細胞通透性的經(jīng)典標記物。本實驗首先建立檢測生物樣品中普萘洛爾的HPLC方法。采用色譜柱為HypersilBDSC18(I.D. 4. 6mmX150mm，5ym)不銹鋼柱(大連依利特公司生產(chǎn))；流動相為25mM磷酸二氫鉀緩沖液乙腈(60:40)，用磷酸調(diào)pH 至2. 5 ；流速1. Oml/min ；檢測波長290nm ；進樣量20 μ L ；采用維拉帕米150 μ g/mL作為內(nèi)標。將100 μ mol/L熒光黃加于Caco-2細胞單層頂端(A面)，于Ih后從基底端(B面)取樣進行檢測。
如圖5所示HBSS溶液中普萘洛爾的標準曲線方程為Y=O. 098X-0. 246, r=0. 995 (n=5)。線性范圍為1 200 μ mol/L。結(jié)果如圖6所示可見Caco-2細胞單層的通透性良好，普萘洛爾在21天細胞模型和7天細胞模型中透過值分別為31. 36和32. 44( 10_6cm/ s)，結(jié)果無統(tǒng)計學差異，與熒光黃透過值一致，7天細胞模型中普萘洛爾透過值方差較小。
四、人體口服吸收利用度與藥物在細胞中透過值的相關(guān)性分析根據(jù)藥物在Caco-2細胞模型中的透過結(jié)果，結(jié)合已報道藥物在人體口服吸收利用度， 進行相關(guān)性分析。
由相關(guān)性分析圖7、圖8所示，普萘洛爾與熒光黃在Caco-2細胞單層中的透過值和人體口服吸收利用度相關(guān)性良好。而且7天細胞模型與21天細胞模型的的預(yù)測結(jié)果幾乎一致，結(jié)果如表1，表2所示。
表1 熒光黃體內(nèi)外相關(guān)性分析m I^e I Ammmm F—iXiOWO Μ A ni i it) ^RII“卜… 01W天 Cl IM ■!■■ 0 OW 0表2 普萘洛爾體內(nèi)外相關(guān)性分析
權(quán)利要求
1.一種藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，其特征在于包括如下步驟(1)以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含體積分數(shù)20%的胎牛血清、的非必需氨基酸、100 U-πιΓ1的青霉素和100 U-πιΓ1的鏈霉素；(2)種板前一天用鼠尾膠原鋪板，即在Transwell板上的每個孔中加入鼠尾膠原，風干過夜；鼠尾膠原的配制方法為取IOOml超純水，加入100 μ 1乙酸，高壓滅菌，冷卻后加入 5mg/ml鼠尾膠原anl，使用前用甲醇稀釋，稀釋體積比為甲醇鼠尾膠原=4:1 ；(3)當Caco-2細胞長至覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底的80% 90%時，胰酶消化，將Caco-2細胞接種在1TransweIl板上，Transwell板下腔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(4)第2、3天每天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第4、5、6天加分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為采用上皮細胞分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基后添加MIOT制得；一共培養(yǎng)6天后，獲得形成緊密單層的Caco-2細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(1)中培養(yǎng)Caco-2細胞是將Caco-2細胞放入培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，隔天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37°C，通入5% CO2，相對濕度90%。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(2)中每個孔中加入鼠尾膠原800μ L。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟(3)的接種密度為5ΧIO5/孔。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，其特征在于步驟 (3) Transwell板下腔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1. 5 mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物口服吸收預(yù)測和篩選模型的建立方法，是在前期已建立的21天Caco-2細胞模型預(yù)測化合物吸收的基礎(chǔ)上，進一步建立、優(yōu)化和驗證7天Caco-2細胞模型預(yù)測方法，并對該模型的檢測指標及細胞形態(tài)學進行優(yōu)化和驗證，以得到最適合的藥物口服吸收高通量篩選的Caco-2細胞模型。本發(fā)明能大大減少細胞模型培養(yǎng)的時間，而減少培養(yǎng)時間能大大降低細胞在21天長期培養(yǎng)中出現(xiàn)污染的可能性，減少勞動強度，以應(yīng)對現(xiàn)今出現(xiàn)的大量先導化合物的口服吸收預(yù)測和篩選。
文檔編號C12Q1/02GK102533927SQ20121002314
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月2日
發(fā)明者畢惠嫦, 胡晉卿, 蔡伊科, 蔡大可, 黃民 申請人:中山大學