專利名稱：一種淋球菌免疫抑制突變基因ΔopaI及其突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋球菌免疫抑制突變基因及突變方法。
背景技術(shù)：
淋球菌的天然宿主是人類，感染后導致性傳播疾病淋病，可引起一系列病變，包括局部感染(如尿道炎、副睪炎、宮頸炎，輸卵管炎等)和全身播散性感染。輸卵管、盆腔等部位的病變可導致不孕癥或?qū)m外孕等嚴重后遺癥。淋病患者還大大增加了艾滋病的發(fā)病機會。淋病發(fā)病率高，全球每年新發(fā)病例約6200萬。越來越嚴重的淋球菌耐藥性現(xiàn)象給淋病治療帶來了越來越大的困難。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重點方向之一。淋球菌疫苗研制歷經(jīng)艱難，二十世紀七十年代全細胞疫苗的人體試驗遭遇失敗，研究的重點開始轉(zhuǎn)向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個被純化的淋球菌亞單位成分，盡管純化后的菌毛能夠刺激機體產(chǎn)生較高滴度的抗體，但是由于菌毛表面一些表位變異程度高，這些抗體并不具有顯著的免疫保護作用。同樣由于高度變異的原因，另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制?？椎鞍资浅掷m(xù)表達在淋球菌表面的I型外膜蛋白，具有免疫原性強、抗原相對保守等特點。90年代初期曾用覆蓋多數(shù)血清型的porin疫苗進行動物免疫實驗，效果并不十分理想。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，用基因工程技術(shù)表達淋球菌抗原成為研制淋病疫苗的重要方向。人們已經(jīng)成功表達了多種淋球菌抗原，如Porin、NspA, TbpA, TbpB, LOS等，用蛋白質(zhì)相關(guān)技術(shù)進行純化和復性，配合一定佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)均可以誘導產(chǎn)生特異性保護抗體。從目前的淋球菌疫苗的研究現(xiàn)狀分析，只用一種抗原的淋球菌疫苗完全預防淋球菌感染是非常困難的。盡管這種疫苗可以產(chǎn)生一定的保護力，但是，如果這種接種只是使淋球菌感染轉(zhuǎn)為無癥狀型，感染者因而不就醫(yī)，那反而會增加淋球菌的傳播。因此，含有更多甚至全部淋球菌保護性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候選。本發(fā)明提供了一種突變淋球菌免疫抑制基因的有效方法，突變株不能表達淋球菌免疫抑制基因，解除淋球菌感染后對機體造成的免疫抑制，在淋病新型疫苗研制中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
野生型淋球菌中含有免疫抑制基因opal，該基因的產(chǎn)物蛋白OpaI可抑制機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對病菌的抵抗力。本發(fā)明提供了一種突變OA3I的方法及突變基因，從而消除了淋球菌的免疫抑制作用，突變菌株進入機體后可刺激產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)，解決了研制淋球菌全細胞疫苗的瓶頸問題。本發(fā)明所述的突變免疫抑制基因—al，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。本發(fā)明所述的突變免疫抑制基因Δ0/λ3Ι通過以下方法獲得以淋球菌基因組DNA為模板，PCR擴增opal基因上游和下游側(cè)翼區(qū)DNA片段，二者之間插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突變基因—eil。將上述突變基因Aoa3I克隆至自殺質(zhì)粒pGMB151，攜帶重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌與淋球菌共孵育使質(zhì)粒轉(zhuǎn)入淋球菌細胞。自殺質(zhì)粒帶有的基因可誘導細菌脫去質(zhì)粒并與野生型OA3I發(fā)生同源重組，從而得到OA3I-突變株。本發(fā)明所述的突變方法，包括如下步驟
(1)o/7aI基因的克隆以淋球菌基因組DNA為模板，以SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列為引物通過PCR擴增出如SEQ ID NO. 3所示淋球菌c^al基因；
(2)opal上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增；將上述以上述(I)0^3I基因擴增產(chǎn)物與T載體pMD-19連接，并以連接產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID W). 5為引物，擴增得到包含opal基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的一個線性片段SEQ ID NO. 6 ；
(3)以質(zhì)粒pET-28a(+)為模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8為引物擴增得到Kanr基因序列SEQ ID NO. 9 ；
(4)OAaI基因的插入突變
將SEQ ID NO. 6 (OA3I基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和opal基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分別用Mlu I和Xho I雙酶切，并回收純化；二者用T4連接酶進行連接，獲得的環(huán)形DNA片段中即含有opal基因中間部分被有活性的Kanr基因替換的突變基因Lopal和pMP_19載體骨架，命名為pMD19 Aoa3I，其中AopaI 序列如 SEQ ID NO. 10 所示。目前淋球菌疫苗研制中采用單一抗原或2種抗原組合作為疫苗，含有的抗原數(shù)量有限，而淋球菌是一種含有數(shù)千種蛋白的細菌，有限數(shù)量抗原做成的疫苗很難刺激機體產(chǎn)生足夠的免疫保護。本發(fā)明提供的方法，因突變株不能表達淋球菌免疫抑制基因，解除了淋球菌抑制機體產(chǎn)生正常免疫反應(yīng)的能力，因而可以刺激機體產(chǎn)生有利于預防再次感染的抵抗力，為淋病新型疫苗的研制帶來新的突破。


圖1是.opal基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析
圖2.包含opal基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和opal基因上游側(cè)翼區(qū)線性DNA片段SEQ ID NO. 6瓊脂糖凝膠電泳分析
圖3是包含opal基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和opal基因上游側(cè)翼區(qū)線性DNA片段SEQ ID NO. 6片段結(jié)構(gòu)示意圖
圖4是Kanr基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析
圖5是淋球菌opal-突變株的PCR篩選，其中1為陰性對照；2_3為AopaI已經(jīng)進入細胞但尚未取代正常opal基因的菌株，可同時擴增出AopaI和opal基因；4為野生菌株，只能擴增出opal基因；5為突變菌株，只能擴增出AopaI基因；
圖6淋球菌opal-突變株的Wfestern blotting鑒定，其中1為野生菌株，仍表達OpaI蛋白；2為突變菌株，不表達OpaI蛋白。
具體實施例方式用PCR將淋球菌基因組中的opal擴增出來，將該基因的中間一段用來自pET28a的Kanr抗性基因替換，得到被插入失活的突變基因Δ ο/^Ι，后者連接到自殺載體中，攜帶AopaI的重組自殺載體放在大腸桿菌中，大腸桿菌與淋球菌共孵育，使自殺載體轉(zhuǎn)化進野生型淋球菌菌株中，然后篩選和鑒定同源重組后野生OA3I被ΔΟΑ3Ι替換的突變株。實施例一
i-)opal基因的克隆及其兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增I, opal基因的克隆
以淋球菌基因組 DNA 為模板，以 F 5’CGGGATCCGCGGGTGAAGGCAATGGC3’ (.Bam H DCSEQID NO. 1)和 R :5，CCCGGATCCGAAGCGGTAGCGCACGCC3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 2)的序列為引物通過PCR擴增出淋球菌基因組中的O^3I基因(圖1)，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，序列如SEQ IDNO. 3所示。SEQ ID NO. 3中，兩端部分為漢警H I識別位點。2. opal上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增
將上述OA3I基因擴增產(chǎn)物與T載體pMD-19T連接，并以連接產(chǎn)物為模板擴增包含opal基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的一個線性片段，該線性片段的瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2，該線性片段的的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3。擴增包含OA3I基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)線性片段的正反向引物分別為
F 5' TGCCTCGAGACGGACACGTCAGACATCAGGT 3，{Xho I) (SEQ ID NO. 4)R 5'GTCACGCGTTTATCTACTCATCGTAAATGGTTGACAAGCC 3' (Mlu I) (SEQ ID NO. 5)，其中TTATCTACTCA為終止序列。擴增得到的包含pMD-19載體和opal基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的線性片段的序列如SEQ IDNO. 6所示(前端劃線大寫字母部分為Xho I識別位點；中間^7-3004bp部分為pMD_19骨架；末端為Μυ I識別位點；其中7-296bp部分為nnp基因下游側(cè)翼區(qū)，3005_3377bp部分為基因上游側(cè)翼區(qū))。(二)以質(zhì)粒pET_28a (+)為模板擴增Kanr基因序列引物序列為
F 5' TCGACGCGTGCTCAGTGGAACGAAAACTC ？, ‘ (. Mlu I) (SEQ ID NO. 7)R :5’ GCGCTCGAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT 3，(Jho I) (SEQ ID NO. 8)經(jīng)PCR擴增得到的Kanr基因擴增產(chǎn)物(圖4)與pMD_19T連接后，使該載體獲得了卡那霉素抗性，表明擴增的DNA片段有活性；產(chǎn)物經(jīng)測序，序列如SEQ ID NO. 9所示(兩端分別為Mlu I和煬ο I識別位點)。(三)opal基因的插入突變
將SEQ ID NO. 6 (OA3I基因下游側(cè)翼區(qū)、pMD19載體骨架和opal基因上游側(cè)翼區(qū)的線性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分別用Mlu I和Xho I雙酶切，并回收純化；二者用T4連接酶進行連接，獲得的環(huán)形DNA片段中即含有opal基因中間部分被有活性的Kanr基因替換的突變基因Lopal和pMP_19載體骨架，命名為pMD19 Aoa3I，其中AopaI 序列如 SEQ ID NO. 10 所示。將包含突變基因—al的重組載體pMD 19 ΔO^I和自殺載體pGMB151分別用召a H I酶消化，回收純化后二者用T4連接酶連接，獲得的連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化導入宿主大腸桿菌SPTO72 λ pir，攜帶重組自殺載體的大腸桿菌與野生型淋球菌共孵育。傳代過程中大腸桿菌死亡裂解，釋放的重組自殺載體進入淋球菌，并與淋球菌野生型opal發(fā)生同源重組，使野生OA3I被突變的取代，同時丟失自殺載體框架。表現(xiàn)為突變菌株具有kana抗性，但喪失了載體上的amp及sm抗性。提取傳代后分離的淋球菌菌落，提取基因組DNA作模板，用印al引物進行PCR，篩選出只擴增出Sopal的菌株，即為opal-突變株(圖5)； 用Wfestern blotting鑒定表明該突變株中Rmp蛋白表達缺失(圖6)。
權(quán)利要求
1.一種淋球菌突變免疫抑制基因ΔΟ/Λ3Ι，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
2.—種淋球菌突變免疫抑制基因Δο/^Ι的突變方法，其特征在于，以淋球菌基因組DNA為模板，PCR擴增opal基因上游和下游側(cè)翼區(qū)DNA片段，二者之間插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突變基因Nopal。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變方法，其特征在于，步驟如下(1)o/7aI基因的克隆以淋球菌基因組DNA為模板，以SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列為引物通過PCR擴增出如SEQ ID NO. 3所示淋球菌c^al基因；(2)opal上下游兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的擴增；將上述以上述(I)0^3I基因擴增產(chǎn)物與T載體pMD-19連接，并以連接產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID W). 5為引物，擴增得到包含opal基因兩側(cè)側(cè)翼區(qū)的一個線性片段SEQ ID NO. 6 ；(3)以質(zhì)粒pET-28a(+)為模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8為引物擴增得到Kanr基因序列SEQ ID NO. 9 ；(4)OAaI基因的插入突變將SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 9的DNA片段分別用i/Ζ I禾Π IAo I雙酶切，并回收純化；二者用Τ4連接酶進行連接，獲得的環(huán)形DNA片段即為突變基因—eil和pMP_19載體骨架，命名為pMD19Ao/7aI，其中Δο^Ι序列如SEQ ID NO. 10所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種淋球菌免疫抑制突變基因及突變方法。所述淋球菌突變免疫抑制基因ΔopaI，它的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。該突變基因通過以下方法獲得以淋球菌基因組DNA為模板，PCR擴增opaI基因上游和下游側(cè)翼區(qū)DNA片段，二者之間插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突變基因ΔopaI。
文檔編號C12N15/31GK102559706SQ201210004939
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者王小兵 申請人:常州大學