專利名稱：[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理提高水稻秸稈酶解效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素利用及化學(xué)工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理提高水稻秸稈酶解效率的方法。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的日益匱乏，近年來，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移到生物質(zhì)等可再生資源的開發(fā)和利用。與化石資源相比，生物質(zhì)資源有諸多優(yōu)勢。其不但取之不盡、用之不竭，且以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料和化工原料還可有效降低(X)2的排放和環(huán)境污染。木質(zhì)纖維素作為地球上分布最廣和含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源而備受人們的關(guān)注。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、纖維素及半纖維素組成。纖維素及半纖維素經(jīng)酶解所得的還原糖如葡萄糖、木糖等可用于發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料(如燃料乙醇及用于制備生物柴油的油脂等)和各種平臺化合物。然而，由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維素不僅被半纖維素和木質(zhì)素包裹，且其分子內(nèi)及分子間存在大量氫鍵，致使其高度結(jié)晶化，故難以直接利用化學(xué)法或生物法將其高效轉(zhuǎn)化為可用的能源或平臺化合物，這嚴(yán)重阻礙了木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用。因此，通常需要對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，以破壞其三維結(jié)構(gòu)、降低纖維素結(jié)晶度，從而增加反應(yīng)位點，提高木質(zhì)纖維素的利用率。木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法通?？煞譃槲锢矸ā⑽锢砘瘜W(xué)法、化學(xué)法和生物法。但現(xiàn)有的預(yù)處理方法均存在固有的缺點(Curr Opin Biotechnol, 2009, 20: 339-347)。例如，機(jī)械粉碎法能耗大；堿處理法對促進(jìn)軟木類木質(zhì)纖維素水解的能力有限；酸水解法易產(chǎn)生微生物抑制劑如糠醛、5-羥甲基糠醛，不利于后續(xù)發(fā)酵；而直接利用生物法，其酶解反應(yīng)慢、酶解率低，如大部分天然木質(zhì)纖維素的酶解率低于20%。離子液體是一類由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的低熔點有機(jī)鹽。由于具有蒸汽壓低、不易燃、較好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等特性，從而成為一類替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的新型介質(zhì)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)催化與合成、生物催化、分析化學(xué)等領(lǐng)域(Chem Rev, 2011， 111 3508-3576)。由于其超強(qiáng)的溶解能力及可設(shè)計性，近年來被用于木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理(Biotechnol Bioeng, 2011，108: 12四_1245)。該預(yù)處理工藝主要是利用離子液體的超強(qiáng)溶解能力，先將木質(zhì)纖維素中的纖維素溶出，然后加入其他溶劑(反溶劑)使纖維素沉淀析出(再生)，以破壞其晶體結(jié)構(gòu)。例如，Li等先將玉米棒子于130 ° C溶于1-甲基-3-甲基咪唑二甲基亞磷酸鹽，隨后加入去離子水使溶解的纖維素析出，經(jīng)上述處理后的纖維素酶解率可提高2倍以上(Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87: 117-1 )。該預(yù)處理工藝決定了只有木質(zhì)纖維素中的纖維素能被利用，而可水解產(chǎn)生木糖的半纖維則未得到利用，從而導(dǎo)致資源浪費。同時，體系中的水的存在會嚴(yán)重妨礙纖維素的溶解，故該溶解工藝對水含量要求甚為苛刻(通常需低于1%)，這就必須對原料及離子液體進(jìn)行長時間高溫脫水處理，導(dǎo)致能耗過大，嚴(yán)重降低了該預(yù)處理工藝的經(jīng)濟(jì)可行性。此外，目前已報道的用于木質(zhì)纖維素預(yù)處理的離子液體均為傳統(tǒng)的咪唑類和嘧啶類離子液體(CN1021M412)，這類離子液體的毒性較強(qiáng)、生物可降解性差，為環(huán)境不友好介質(zhì)(Chem Soc Rev, 2011， 40: 1383-1403);此外，這類離子液體源于化石資源，具有不可再生性。因此，顯然迫切需要開發(fā)新型的、可生物降解的離子液體，用于木質(zhì)纖維素預(yù)處理，以增強(qiáng)其酶解效率，提高可發(fā)酵的還原糖收率。膽堿及氨基酸均為可再生資源，以其為原料，通過膽堿氫氧化物與氨基酸在常溫下經(jīng)酸堿中和反應(yīng)制得一類以膽堿為陽離子、以氨基酸為陰離子的新型離子液體([膽堿] [氨基酸]離子液體)，具有低毒、綠色環(huán)保、可再生、可生物降解等特點，符合綠色化學(xué)發(fā)展策略。以該類離子液體為木質(zhì)纖維素預(yù)處理溶劑，克服了傳統(tǒng)離子液體預(yù)處理工藝環(huán)境不友好等缺陷。同時，木質(zhì)素在該類離子液體中的溶解度遠(yuǎn)超過木聚糖(為半纖維素的主要成分)，而纖維素在其中幾乎不溶，故該類離子液體能選擇性從木質(zhì)纖維素原料中萃取木質(zhì)素，從而實現(xiàn)木質(zhì)素與還原糖組分(纖維素及半纖維素)的分離，提供了一條全面綜合利用木質(zhì)纖維素原料中各組分的路徑，克服了傳統(tǒng)離子液體預(yù)處理工藝導(dǎo)致資源浪費(半纖維素組分的浪費)的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理增強(qiáng)水稻秸桿酶解，提高可發(fā)酵的還原糖(葡萄糖及木糖)收率的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
(1)水稻秸桿經(jīng)干燥后，粉碎，其平均粒徑控制在150 350Pm；
(2)以[膽堿][氨基酸]離子液體為預(yù)處理溶劑，在氮氣保護(hù)下，按照水稻秸桿與離子液體質(zhì)量比為1:10 1:25混合水稻秸桿和離子液體，于50 130 ° C下攪拌0.5 34 小時，隨后冷卻至室溫，加入0.5 3倍離子液體體積的NaOH溶液，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理后的水稻秸桿；
(3)稱取一定量預(yù)處理后的水稻秸桿，按照固液比為I 6mg/mL加入檸檬酸鹽緩沖液，再按照5 30 U/mg預(yù)處理后水稻秸桿的比例加入商品化纖維素酶(含纖維素酶和木聚糖酶)，在150 250 r/min, 40 60 ° C下反應(yīng)，測定水解液中葡萄糖及木糖濃度，直至水解液中葡萄糖及木糖濃度達(dá)到最大，終止反應(yīng)。步驟⑵中所述的[膽堿][氨基酸]離子液體是以膽堿為陽離子、天然氨基酸為陰離子的離子液體。所述的天然氨基酸包括L_甘氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-賴氨酸、L-精氨酸或L-組氨酸。所述的NaOH溶液濃度為0. I mol/L。所述的檸檬酸鹽緩沖液的濃度為50 mmol/L, pH為4.8。所述的商品化纖維素酶優(yōu)選來源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纖維素酶。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點
I)利用[膽堿][氨基酸]離子液體作為溶劑預(yù)處理水稻秸桿，明顯增強(qiáng)了水稻秸桿的酶解效率，提高了可發(fā)酵的還原糖(葡萄糖及木糖)收率。2)[膽堿][氨基酸]離子液體具有低毒、綠色環(huán)保、可再生、可生物降解等特點，故以該類離子液體為木質(zhì)纖維素的預(yù)處理溶劑，預(yù)處理工藝環(huán)境友好、符合綠色化學(xué)發(fā)展策略，克服傳統(tǒng)離子液體預(yù)處理工藝環(huán)境不友好等缺陷。3)利用[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料，可實現(xiàn)木質(zhì)纖維素原料的全面利用，克服傳統(tǒng)離子液體預(yù)處理工藝導(dǎo)致資源浪費(半纖維素組分的浪費)的缺
點ο


圖1 [膽堿][氨基酸]離子液體結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1[甘氨酸]預(yù)處理提高水稻秸稈酶解效率
a)預(yù)處理精確稱量150 mg水稻秸稈粉末(150 350 μ m)和3 g [膽堿][甘氨酸] 離子液體，共同置于15 mL三角瓶中，在氮氣保護(hù)下，于90 ° C下攪拌對小時；隨后冷卻至室溫，加入1倍離子液體體積的NaOH溶液(0. 1 mol/L)稀釋、過濾，再用3倍體積的去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后即得到預(yù)處理后的水稻秸稈。b)酶解精確稱量上述預(yù)處理后的水稻秸稈20 mg，置于50 mL的三角瓶中，加入 7 mL檸檬酸鹽緩沖液(50 mmol/L, pH 4.8)和M5 U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶， 密封后置于200 r/min、50 ° C的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200 μ L，于100 ° C下處理5分鐘以淬滅酶反應(yīng)；離心(10000 g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖及木糖濃度，直至水解液中葡萄糖及木糖濃度達(dá)到最大，終止反應(yīng)。根據(jù)預(yù)處理前水稻秸稈中葡萄糖及木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖及木糖收率，如表1。表 1
時間(h)Il. 5 |3. 5 |6 |9 |13. 5
葡萄糖收率(％) "69. 9 74. 4 78. 6 78. 8 79. 0 木糖收率(％)|24. 5 \2&. 0 |28. 2 \27. 2 \27. 4
實施例2[絲氨酸]預(yù)處理提高水稻秸稈酶解效率 a)預(yù)處理精確稱量150 mg水稻秸稈粉末(150 350 μ m)和3 g [膽堿][絲氨酸] 離子液體，共同置于15 mL三角瓶中，在氮氣保護(hù)下，于90 ° C下攪拌對小時；隨后冷卻至室溫，加入2倍離子液體體積的NaOH溶液(0. 1 mol/L)稀釋、過濾，再用3倍體積的去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后即得到預(yù)處理后的水稻秸稈。b)酶解精確稱量上述預(yù)處理后的水稻秸稈20 mg，置于50 mL的三角瓶中，加入 7 mL檸檬酸鹽緩沖液(50 mmol/L, pH 4.8)和M5 U來源于里氏木霉的商品化纖維素酶， 密封后置于200 r/min、50 ° C的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200 μ L，于100 ° C下處理5分鐘以淬滅酶反應(yīng)；離心(10000 g)后，利用高效液相色譜測定葡萄糖及木糖濃度，直至水解液中葡萄糖及木糖濃度達(dá)到最大，終止反應(yīng)。根據(jù)預(yù)處理前水稻秸稈中葡萄糖及木糖的理論產(chǎn)量，即可計算得到最終的葡萄糖及木糖收率，如表2。表權(quán)利要求
1.[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理提高水稻秸桿酶解效率的方法，其特征在于，具體步驟如下1)水稻秸桿經(jīng)干燥后，粉碎，其平均粒徑控制在150 350um；2)以[膽堿][氨基酸]離子液體為預(yù)處理溶劑，在氮氣保護(hù)下，按照水稻秸桿與離子液體質(zhì)量比為1:10 1:25混合水稻秸桿和離子液體，于50 130 ° C下攪拌0.5 34 小時，隨后冷卻至室溫，加入0.5 3倍離子液體體積的NaOH溶液，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理后的水稻秸桿；3)稱取一定量預(yù)處理后的水稻秸桿，按照固液比為I 6mg/mL加入檸檬酸鹽緩沖液， 再按照5 30 U/mg預(yù)處理后水稻秸桿的比例加入商品化纖維素酶，在150 250 r/min, 40 60 ° C下反應(yīng)，測定水解液中葡萄糖及木糖濃度，直至水解液中葡萄糖及木糖濃度達(dá)到最大，終止反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)中所述的[膽堿][氨基酸]離子液體是以膽堿為陽離子、天然氨基酸為陰離子的離子液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的天然氨基酸包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、 L-脯氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-賴氨酸、L-精氨酸或L-組氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)中所述的NaOH溶液濃度為0.I mol/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的檸檬酸鹽緩沖液的濃度為 50 mmol /T,, pH 為 4. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的商品化纖維素酶選自來源于里氏木霉(Trichoderma reesei )的纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種[膽堿][氨基酸]離子液體預(yù)處理提高水稻秸稈酶解效率的方法。首先以[膽堿][氨基酸]離子液體為溶劑，在一定溫度下對水稻秸稈進(jìn)行預(yù)處理一定時間后，經(jīng)過濾分離得到殘渣，干燥后即得預(yù)處理后的水稻秸稈。以水稻秸稈殘渣為底物，利用纖維素酶及木聚糖酶對其進(jìn)行酶解，最后得到以葡萄糖和木糖為主的糖液。本發(fā)明不僅能有效增強(qiáng)水稻秸稈的酶解效率，提高了可發(fā)酵的還原糖(葡萄糖及木糖)收率，而且克服了傳統(tǒng)離子液體預(yù)處理工藝環(huán)境不友好等缺點。
文檔編號C12P19/14GK102533907SQ20121000474
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者侯雪丹, 宗敏華, 李寧 申請人:華南理工大學(xué)