專利名稱:家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
一種家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)熒光定量PCR檢測方法,屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
家香質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV) 屬呼腸孤病毒科(Reoviridae),是危害養(yǎng)蠶業(yè)的主要病原物之一,給生產(chǎn)上造成了巨大經(jīng)濟損失。BmCPV病毒粒子直徑約為50-65nm,形狀呈正二十面體,具有獨特的單層衣殼結(jié)構(gòu)。 基因組由10節(jié)段雙鏈RNA分子組成,目前把質(zhì)型多角體病毒按照電泳遷移率的不同分成14 個電泳型,BmCPV屬I型。其宿主域主要是鱗翅目,雙翅目,膜翅目和鞘翅目等昆蟲。BmCPV 專一性感染家蠶中腸上皮細胞,感染了 BmCPV的家蠶中腸上皮細胞的主要細胞器均發(fā)生顯著病變。家蠶表現(xiàn)為發(fā)育不良、體形瘦弱、行動呆滯。隨著病程的推進,在中腸后部可看到白色的褶皺,這是家蠶質(zhì)型多角體病的典型病癥之一。中腸乳白色的病變是家蠶質(zhì)型多角體病肉眼診斷的重要依據(jù)之一。目前對家蠶質(zhì)型多角體病的防治尚未取得突破性進展,生產(chǎn)上主要以預(yù)防為主。 家蠶病毒病的診斷技術(shù)相對落后,主要通過對典型癥狀的肉眼判斷為主。雖然,也有學(xué)者嘗試?yán)闷渌T如血清學(xué)方法、酶聯(lián)抗體-ELISA法、膠乳凝集反應(yīng)和單克隆抗體法用于家蠶病毒病的診斷,但這些檢測方法有的準(zhǔn)確性低、有的無法定量,有的操作煩瑣等,均沒有形成體系化、穩(wěn)定化的檢測方法,很難在實際診斷中推廣應(yīng)用。經(jīng)對現(xiàn)有發(fā)明專利檢索發(fā)現(xiàn), 劉吉平等(專利號CN1021M522A,2011年)采用常規(guī)PCR方法檢測BmCPV。常規(guī)PCR方法擴增后需電泳檢測,易造成PCR產(chǎn)物污染及環(huán)境污染,不能定量,且不適合高通量檢測。熒光定量PCR將常規(guī)PCR和熒光檢測相結(jié)合,儀器自動分析,高通量,無后續(xù)處理,具有高靈敏性、高特異性、重現(xiàn)性好,且可以對樣品中的病毒含量進行準(zhǔn)確定量,已成為病毒檢測的重要方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量 PCR檢測方法。本發(fā)明檢測靈敏度可達IO1個數(shù)量級拷貝的病毒分子,具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、可以定量,特異性好,假陽性低等特點。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn),步驟如下步驟一,以家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因的保守序列為靶目標(biāo),利用I^rimer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物,擴增目的基因片斷(SEQ ID No :1)。所述特異性引物為正向引物5‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3,,反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3,。步驟二,構(gòu)建含目的基因片斷的定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,所用載體為pGEM-T Easy ;步驟三,提取樣品RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;步驟四,實時熒光定量PCR擴增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。PCR反應(yīng)體系為95°C預(yù)變性3min ;95°C 15s,60°C lmin,共 40 個循環(huán)。本發(fā)明的有益效果為與RT-PCR相比,本發(fā)明的方法無需擴增后電泳分析,避免了 PCR產(chǎn)物污染及制膠過程中的健康損害;本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性強、特異性好及可以準(zhǔn)確定量等特點;本發(fā)明可同時進行大批量樣品的檢測,具有高通量性;本發(fā)明方法檢測范圍廣,在IO1-IO7拷貝范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,檢測范圍可達7個數(shù)量級。
圖1家蠶質(zhì)型多角體病毒絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR擴增曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例進一步說明本發(fā)明。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法或按照制造廠商所建議的條件;所使用的材料、試劑等,如無特殊說明, 為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例步驟一,設(shè)計特異性引物從基因數(shù)據(jù)庫中檢索獲得家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因序列(登錄號為AB003361), 利用I^rimer Premier 5. 0軟件設(shè)計得到一條特異性引物,目的擴增片段為118bp (SEQ ID NO :1)。設(shè)計的引物序列為正向引物5'ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3,,(SEQ ID NO 2)反向引物5'ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3,。(SEQ ID NO 3)步驟二,定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的家蠶質(zhì)型多角體病毒RNA為模板,應(yīng)用I^rimer script RT reagent kit (購自TaKafci公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系共20 μ L,其中,5 XI^rimer script Buffer 4 μ L, Primer script RT Enzyme Mix I 1 μ L, Oligo dT Primer 1 μ L, Random 6mers 1 μ L,Total RNA(1 μ g) 2 μ L,RNase-free 水 11 μ L。反應(yīng)條件為37 °C 15min, 85°C 5s0以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,用正向引物(SEQ ID NO 2)和反向引物(SEQ ID NO :3)擴增目的基因片斷,PCR反應(yīng)體系為10XPCR Buffer (Mg2+)2. 5μ L, dNTP(各 10mM)0. 5μ L,正向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L,反向引物(10 μ mol/L) 0. 6 μ L,cDNA 模板 1· 0 μ L,Taq (5U/ μ L) 0· 5 μ L,ddH20 19. 3 μ L,終體積 25 μ L。反應(yīng)條件為94 "C 2min ; 94°C 30s,58°C 40s,72°C 40s,共 30 個循環(huán);72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后,取 5yL PCR 產(chǎn)物在 1 %的瓊脂糖凝膠上電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后,通過膠回收純化目的片段,然后將目的片段與PGEM-T Easy載體連接,將其轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細胞,進行測序驗證。陽性質(zhì)粒用堿裂解法進行提純,根據(jù)紫外分光光度計測定0擬60/280值計算質(zhì)粒濃度,并換算為質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(μ g/μ L) X6. 02X 1023mol/1000M, M 代表質(zhì)粒分子量。步驟三,病毒樣品RNA的提取
采用Trizol法提取待檢樣本的RNA。具體步驟如下(1)將待檢樣品放入處理好的研缽中,用研杵迅速將樣品砸碎并磨成粉末,分裝到 RNase-free 的 1. 5mLEppendorf 管中,每 0. Ig 組織加 ImL Trizol,樣品體積應(yīng)小于 Trizol 體積的10% ;(2)振蕩混勻,室溫溫育約lOmin,12000g,4°C離心IOmin ;(3)將上清轉(zhuǎn)移到另一個新的離心管中,每mL加入0.2mL氯仿(1/5體積),劇烈搖動15s,室溫放置5min,12000g,4°C離心15min ;混合物分成下層的紅色苯酚-氯仿相,中間的蛋白質(zhì)沉淀和上層無色水相。RNA即位于上清液;(4)將上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈離心管中,等體積加入預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻, 室溫靜置lOmin,12000g,4°C離心lOmin,留下RNA沉淀,棄上清;(5)加入 75% 乙醇,ImL Trizol 加 ImL 75% 乙醇,渦旋混勻,7500g,4°C離心 5min,
棄上清;(6)自然控干RNA沉淀約5-lOmin,用30-40 μ L的RNase-free水常溫溶解RNA ;(7)取1 μ L稀釋100倍后,5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,剩余用于分光光度計檢測總RNA濃度和純度,_80°C保存?zhèn)溆谩悠稲NA的反轉(zhuǎn)錄同步驟二中的反轉(zhuǎn)錄。步驟四,實時熒光定量PCR擴增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將步驟2中的定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋至1.0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、 i.oxio3、i. ox Io^loxio1U. ox 10°拷貝/y l,以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液為模板,進行熒光定量PCR擴增。其中,1. OX IO7 1. OX IO3拷貝/μ L用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;1. O X IO2U. O X IO1, 1.0X10°拷貝/yL作為陽性對照,同時檢測PCR反應(yīng)的靈敏性。兩個家蠶品種(P50和意 16)的未感染中腸cdna及滅菌水作為陰性對照的模板。每個反應(yīng)作3個平行樣,進行組內(nèi)的重復(fù)性檢驗。反應(yīng)體系為:2XSYBR Premix Ex Taq 10 μ L,正向引物(10 μ mol/L) O. 4 μ L, 反向引物(10ymol/L)0. 4yL,模板lyL,ddH20 8. 2 μ L,終體積20 μ L。反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性:3min ;95°C 15s,60°C lmin,40個循環(huán)。檢測結(jié)束后,熒光PCR儀自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖1)。本檢測方法靈敏度可達到10個拷貝,在1. O X IO7 1. O X IO1拷貝/ μ L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,其檢測范圍可達7個數(shù)量級。步驟五,重復(fù)性分析每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)液均檢測3個平行樣,進行重復(fù)性分析,通過檢測其CT值的變異系數(shù)進行重復(fù)性評價,下表結(jié)果顯示,變異系數(shù)均小于0. 5%,表明本檢測方法重復(fù)性很好, 穩(wěn)定性強。
權(quán)利要求
1.一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法,其特征在于,包括以下步驟 (1)、以家蠶質(zhì)型多角體蛋白基因的保守序列(SEQ ID No:l)為靶目標(biāo),設(shè)計特異性引物,擴增目的基因片斷;O)、利用步驟(1)所得片斷構(gòu)建定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒; (3)、提取樣品RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;G)、實時熒光定量PCR檢測方法檢測樣本中的家蠶質(zhì)型多角體病毒含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法,其特征是,步驟 ⑴和步驟⑷中,擴增時所用引物為正向引物5 ‘ ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3 ’, 反向引物5 ‘ ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3 ’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法,其特征是,步驟 (2)中所述質(zhì)粒使用的是pGEM-T Easy0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法,其特征是,步驟中,PCR反應(yīng)體系為95°C預(yù)變性:3min ;95°C 15s,60°C lmin,共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶質(zhì)型多角體病毒熒光定量PCR檢測方法,屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、特異性引物的設(shè)計、實時熒光定量PCR的擴增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的制備及其檢測結(jié)果的判定。本發(fā)明靈敏性高、穩(wěn)定性好、特異性強,可以定量,適用于病毒感染的批量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102559929SQ20121000470
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者吳萍, 李龍, 郭錫杰, 陳濤 申請人:江蘇科技大學(xué)