一種快速檢測瓜果腐霉菌的熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于熒光定量PCR法檢測瓜果腐霉菌的試劑盒，專用于檢測瓜果 腐霉囷，屬于農作物病害診斷與防治技術領域。
【背景技術】
[0002] 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum)，屬鞭毛菌亞門真菌。菌絲體生長繁茂，呈白 色棉絮狀。菌絲無色，無隔膜，直徑2.3-7. Ιμπι。菌絲與孢囊梗區(qū)別不明顯。孢子囊絲狀 或分枝裂瓣狀，或呈不規(guī)則膨大，大小63-725 X 4. 9-14. 8 ( μ m)。泡囊球形，內含6-26個游 動孢子。藏卵器球形，直徑14. 9-34. 8 μ m。卵孢子球形，平滑，不滿器，直徑14. 0-22. 0 μ m。 該菌在年平均氣溫高的地方出現(xiàn)頻率較高。病菌以卵孢子在12-18cm表土層越冬，并在土 中長期存活。翌春，遇有適宜條件萌發(fā)產生孢子囊，以游動孢子或直接長出芽管侵入寄主。 此外，在土中營腐生生活的菌絲也可產生孢子囊，以游動孢子侵染幼苗，引起茄子、番茄、辣 椒和黃瓜等作物的猝倒病。田間的再侵染主要靠病苗上產出孢子囊及游動孢子，借灌溉水 或雨水濺附到貼近地面的根莖上引致更嚴重的損失。
[0003] 瓜果腐霉菌傳統(tǒng)鑒定方法通常采用選擇性培養(yǎng)基進行病原菌的分離培養(yǎng)，菌落形 態(tài)觀察，顯微鏡下觀察病菌的菌絲體，孢子等特征，結合田間發(fā)病植株癥狀的觀察進行分 類。傳統(tǒng)鑒定方法在很多方面存在一定誤差和困難，具有很大局限性且費時費力。僅菌絲 體和孢子等的形態(tài)特征也即表型分析來鑒別，有時是不準確的。同一病原菌的菌落往往在 形態(tài)上、分布、生理性狀等方面存在一定差異，難以進行準確鑒定。隨著分子生物學技術的 日益成熟和廣泛應用，人們有可能避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過程，通過DNA水平上的研究，對土 壤中病原菌進行鑒定。分子生物學方法的簡便、快速、高效、可靠等特點，是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng) 方法所達不到的。
[0004] 實時焚光定量 PCR技術（real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q_PCR)是 一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過擴 增產物熔解曲線分析可以特異的檢測和鑒定某種病原真菌，通過標準曲線對未知模板進行 定量分析的方法。該技術不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠 性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛 應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域，但在農業(yè)植物病原真菌的定性定量檢測研究中 應用較少，尤其是在瓜果腐霉菌的定性定量研究中。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服瓜果腐霉菌傳統(tǒng)檢測鑒定方法的不足，提供一種PCR快速 檢測瓜果腐霉菌的方法，采用根據(jù)瓜果腐霉菌rDNA的ITS區(qū)所設計的特異性引物進行擴 增，得到282bp條帶，同時本發(fā)明優(yōu)化熒光定量PCR反應體系，實現(xiàn)對發(fā)病植物組織及果實 中的瓜果腐霉菌的快速檢測定量，提高了檢測的準確性，節(jié)約了檢測時間，可以試劑盒的形 式在植物病害診斷與防治領域大規(guī)模推廣。
[0006] -種PCR快速檢測瓜果腐霉菌的方法，以瓜果腐霉菌DNA為模板進行PCR反應，其 特征在于，所述PCR反應體系中加入有一對特異性引物GF1F/GF1R，該特異性引物的序列分 別為：
[0007] 特異性引物 GF1F :5' -GCAACCTCTATTGGCGGTATG-3'，
[0008] 特異性引物 GF1R :5' -ATATCAGGTCCAATTAGAAAGTTGTTC-3'。
[0009] 所述PCR反應體系終體積為20yL，其中10XPCR buffer 2yL，0. 5yL濃度為 15mM 的 MgCl2,1· 6 μ L 濃度為 2. 5mM 的 dNTPs，5 μ Μ 的引物各 0· 5 μ L，5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 2 μ L，DNA模板2 μ L，滅菌雙蒸水12. 7 μ L ;PCR反應擴增程序為：94°C預變性3min ;94°C 變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0010] 所述PCR快速檢測為實時熒光定量PCR檢測。
[0011] 所述PCR反應體系中加入有SYBR Green Supermix〇
[0012] 所述 PCR 反應總體積為 20 μ L，SYBR Green Supermix 10 μ L，1 μ L 濃度為 10 μ Μ 的特異性引物GF1F，1 μ L濃度為10 μ Μ的特異性引物GF1R，DNA模板2 μ L，余量為無菌雙 蒸水6 μ L ;熒光定量PCR反應程序：
[0013] 第 1 步：95. 0°C 3 分鐘，
[0014] 第 2 步：95. 0°C 10 秒鐘，
[0015] 第 3 步：58. 0°C 30 秒鐘，
[0016] 第4步：進行第2步程序，重復39次循環(huán)，
[0017] 第5步：熔解曲線65. 0°C至95. 0°C，每5秒鐘增加0. 5°C，
[0018] 第6步：結束。
[0019] 所述瓜果腐霉菌DNA來自植物組織、果實或土壤。
[0020] -種瓜果腐霉菌的試劑盒，包括一 PCR反應體系，所述PCR反應體系中含有特異性 引物GF1F/GF1R，該特異性引物的序列分別為：
[0021] 特異性引物（GF1F) :5' -GCAACCTCTATTGGCGGTATG-3'，
[0022] 特異性引物（GF1R) :5' -ATATCAGGTCCAATTAGAAAGTTGTTC-3'。
[0023] 所述PCR反應體系還包括焚光基團SYBR Green Supermix。
[0024] 所述PCR反應體系為：SYBR Green Supermix 10 μ L，1 μ L濃度為10 μ Μ的特異性 引物GF1F，1 μ L濃度為10 μ Μ的特異性引物GF1R，無菌雙蒸水6 μ L ;反應時需加入的待測 瓜果腐霉菌DNA模板為2 μ L。
[0025] 本發(fā)明采用根據(jù)瓜果腐霉菌rDNA的ITS區(qū)所設計的特異性引物進行擴增，得到 282bp條帶，同時本發(fā)明優(yōu)化熒光定量PCR反應體系，反應體系總體積為20 μ L，SYBR Green Supermix 10 μ L，上游引物 GF1F (10 μ Μ) 1 μ L，下游引物 GF1R (10 μ Μ) 1 μ L，DNA 模板 2 μ L， 余量為無菌雙蒸水6 μ L。本明實現(xiàn)對發(fā)病植物組織及果實中的瓜果腐霉菌的快速檢測定 量，提高了檢測的準確性，節(jié)約了檢測時間，可以試劑盒的形式在植物病害診斷與防治領域 大規(guī)模推廣。
[0026] 本發(fā)明提供一種熒光定量PCR法檢測瓜果腐霉菌的試劑盒，可對植物組織及土壤 中的瓜果腐霉菌進行快速檢測定量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 檢測準確性高，特異性好，可從植物組織及土壤中準確地檢測到瓜果腐霉菌。
[0028] 檢測靈敏度高，可檢測瓜果腐霉菌DNA濃度低至0. 01ng/mL，對瓜果腐霉菌的精確 檢測可達到62個孢子。
[0029] 操作簡便快捷，基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制。定量檢測，能真實反映 瓜果腐霉菌定殖和侵染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。本發(fā)明提供的試劑盒可對 瓜果腐霉菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)鑒定方法，并適于在 植物病害診斷及防治領域廣泛推廣應用。
[0030] 因此本發(fā)明提供一種熒光定量PCR法檢測瓜果腐霉菌的試劑盒，實用性強，可滿 足植物病害診斷及監(jiān)測的需要。
【附圖說明】
[0031] 圖1為特異性檢測引物對GF1F/GF1R對瓜果腐霉菌及其近緣種、屬真菌的PCR擴 增結果，其中1-9號為引物對GF1F/GF1R擴增6種病原菌結果：M:Marker II 1.無 DNA對照 2.禾谷鏡刀菌（Fusarium graminearum)3.群結腐霉（Pythium myriotylum)4.瓜果腐霉菌 (Pythium aphanidermatum)5.辣椒疫霉（Phytophthora capsici)6.棉疫霉（Phytophthora boehmeriae) 7.立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)；
[0032] 圖2為瓜果腐霉菌特異引物GF1F/GF1R的靈敏度檢測結果，
[0033] 其中1-5號為瓜果腐霉菌DNA模板濃度從高至低系列稀釋（10ng/mL-0.001ng/ mL)，M :Marker II ；
[0034] 圖3為標準樣品和未知樣品的瓜果腐霉菌熒光定量PCR擴增曲線圖，
[0035] 其中y軸：熒光吸收率；X軸：循環(huán)數(shù)；
[0036] 圖4為標準樣品和未知樣品的瓜果腐霉菌熒光定量PCR熔解曲線圖，圖示熔解溫 度為86°C ;圖5為標準樣品和未知樣品的瓜果腐霉菌熒光定量PCR標準曲線圖，
[0037] 其中未知樣品：1.番茄病根（有明顯癥狀，6. 57X 106個孢子），2.番茄莖基部（有 明顯癥狀，4. 33 X 105個孢子），3.番茄病莖（有癥狀，5. 69X 104個孢子），4.根際土壤1(948 個孢子），5.根際土壤2 (62個孢子）。該結果顯示該發(fā)明試劑盒及檢測方法可靈敏精確地 檢測植株病組織及土壤中的瓜果腐霉菌的數(shù)量，檢測結果可達到62個孢子。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明
[0039] 實施例1瓜果腐霉菌的特異性引物檢測
[0040] 1)各菌株DNA制備：
[0041] 采用平板培養(yǎng)菌株，置于適合溫度的培養(yǎng)箱內，生長一周左右，用滅菌的解剖針刮 取菌絲體，收集于