用于檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的特異性引物、探針、試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)和生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測(cè)肉制品 中鴨源性成分的特異性引物、探針、試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國(guó)肉制品市場(chǎng)中肉類摻假問題日益嚴(yán)重，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，一些不 法分子為牟取暴利而摻雜使假，將相對(duì)廉價(jià)的鴨肉、豬肉等深加工后冒充牛羊肉進(jìn)行銷售； 其中，相對(duì)于豬肉，鴨肉的紋理色澤和牛羊肉最為接近，因此，市售牛羊肉及其制品中，很多 都摻雜鴨肉冒充牛羊肉進(jìn)行銷售，為彌補(bǔ)羊肉味不足，有的甚至摻入羊肉粉，羊肉精膏等添 加劑來粉飾其摻假行為。肉制品摻假的行為，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的權(quán)益，因此，對(duì)食品監(jiān)管 部門而言，建立一種快速、簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的方法非常必要。
[0003] 隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，食品中肉類成分的鑒別與分析已逐步形成了分別以蛋白 質(zhì)和核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法體系，其中以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測(cè)技術(shù)最為突出。但是 普通PCR的擴(kuò)增效率低，qPCR需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等因素，使得其定量體系 需進(jìn)一步完善。微滴式數(shù)字PCR方法（Droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發(fā)展起來的 快速、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對(duì)定量的PCR方法。其原理是通過微滴發(fā)生器把PCR反應(yīng)體系生 成約20000個(gè)微滴，PCR擴(kuò)增后通過微滴分析儀讀取陽(yáng)性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出 樣本中的DNA拷貝數(shù)。ddPCR與qPCR方法相比，靈敏度高，無(wú)需核酸標(biāo)準(zhǔn)品，就可對(duì)起始樣 品進(jìn)行絕對(duì)定量，可以用于物種鑒定、致病菌、轉(zhuǎn)基因及肉源性成分檢測(cè)等。因此，研究和建 立肉制品中鴨源性成分的ddPCR檢測(cè)方法對(duì)肉制品中鴨源性的快速、準(zhǔn)確的定性和定量檢 測(cè)具有重大意義。
[0004] β-actin基因是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分一一肌動(dòng)蛋白的一種單拷貝基因，具有 基因序列高度保守、能在不同組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)、mRNA表達(dá)數(shù)量高且穩(wěn)定的特點(diǎn)。本申 請(qǐng)根據(jù)鴨的β-actin基因，設(shè)計(jì)一種特異性的引物、探針，建立一種定量檢測(cè)肉制品中鴨 源性成分含量的方法，并組裝成試劑盒，為相關(guān)部門定量分析檢測(cè)肉制品中鴨源性成分提 供有力的科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)肉制品中鴨源性 成分的特異性引物和探針；本發(fā)明的另一目的是提供一種定量檢測(cè)肉制品中鴨源性成分含 量的方法；本發(fā)明的再一目的是提供一種檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的特異性引物，所述特異性引物的核 苷酸序列為：
[0008] 上游引物：5' -TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0009] 下游引物：5' -GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種與上述引物配合使用的探針，所述探針的核苷酸序列為： 5'-H-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG-Q-3'（SEQ ID 勵(lì).3)，其中，!1為熒光報(bào)告基團(tuán)，〇為熒 光淬滅基團(tuán)。
[0011] 優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0012] 本發(fā)明所述的引物和探針是通過核酸比對(duì)軟件DNAMAN對(duì)GenBank中公布的多種 動(dòng)物的β-actin單拷貝基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出鴨β-actin基因特異序列（其核苷酸 序列如SEQ ID N0. 4所示），根據(jù)篩選得到的特異序列利用Primer5. 0設(shè)計(jì)特異性引物和探 針。所有的引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)肉制品中鴨源性成分含量的方法，具體包括以下步 驟：
[0014] (1)建立鴨肉樣品質(zhì)量和基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系式：
[0015] a.鴨肉樣品質(zhì)量與鴨肉樣品DNA濃度之間線性關(guān)系式的確定：稱取至少5個(gè)（優(yōu) 選為5-10個(gè)）不同質(zhì)量梯度的預(yù)處理后的鴨肉樣品，分別對(duì)每一個(gè)鴨肉樣品進(jìn)行基因組 DNA的提取，并運(yùn)用核酸定量分析儀測(cè)定每個(gè)鴨肉樣品基因組DNA提取物中的DNA濃度， 得到與每一個(gè)質(zhì)量梯度鴨肉樣品相對(duì)應(yīng)的鴨肉樣品DNA濃度；然后根據(jù)檢測(cè)到的鴨肉樣品 DNA濃度和與之相對(duì)應(yīng)的鴨肉樣品的質(zhì)量，制作關(guān)于鴨肉樣品質(zhì)量-鴨肉樣品DNA濃度的標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線，得到鴨肉樣品質(zhì)量-鴨肉樣品DNA濃度的線性關(guān)系式：C = kiM+bi，其中，Μ代 表鴨肉樣品肉質(zhì)量；C代表鴨肉樣品DNA濃度；
[0016] b.鴨肉樣品DNA濃度與基因拷貝數(shù)之間線性關(guān)系式的確定：對(duì)步驟a中得到的 已知鴨肉樣品DNA濃度的鴨肉樣品基因組DNA提取物進(jìn)行梯度稀釋，稀釋成系列濃度梯度 的DNA樣品，然后分別以每一個(gè)稀釋濃度的DNA樣品作為模板，進(jìn)行微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增反 應(yīng)；微滴數(shù)字PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用微滴分析儀進(jìn)行分析，記錄每一個(gè)微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體 系中的基因拷貝數(shù)，然后根據(jù)基因拷貝數(shù)和與之相對(duì)應(yīng)的模板DNA含量，制作關(guān)于模板DNA 含量-基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到模板DNA含量-基因拷貝數(shù)的線性關(guān)系式：Y = k具+b2，其中，代表微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中模板DNA含量；Υ代表微滴數(shù)字PCR反應(yīng)后 所測(cè)得的基因拷貝數(shù)；
[0017] 其中，在每一個(gè)微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中，模板DNA含量與鴨肉樣品DNA濃度、反 應(yīng)體系中模板DNA的加入體積之間的線性關(guān)系式為：1^= CV/N，其中，C代表鴨肉樣品DNA 濃度；V代表微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中模板DNA的加入體積；N代表鴨肉樣品基因組DNA提 取物的稀釋倍數(shù)A代表微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中模板DNA的含量；
[0018] 將吣=CV/N代入模板DNA含量-基因拷貝數(shù)的線性關(guān)系式Y(jié) = k具+132中，即得 到鴨肉樣品DNA濃度-基因拷貝數(shù)的線性關(guān)系式，即為Y = k2CV/N+b2;
[0019] c.鴨肉樣品質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間關(guān)系式的確定：根據(jù)步驟a建立的鴨肉樣品質(zhì) 量-鴨肉樣品DNA濃度的線性關(guān)系式C = hM+h和步驟b建立的鴨肉樣品DNA濃度-基因 拷貝數(shù)的線性關(guān)系式Y(jié) = k2CV/N+b2，選擇以鴨肉樣品DNA濃度C作為中間換算變量，計(jì)算 鴨肉樣品質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系，得到鴨肉樣品質(zhì)量-基因拷貝數(shù)的關(guān)系式，即為Μ =(NY-N b2-k2b1V) /ki^V ；
[0020] (2)待檢測(cè)肉制品中鴨源性成分含量的測(cè)定：
[0021] 取已知質(zhì)量的預(yù)處理后的待檢測(cè)肉制品，提取待檢測(cè)肉制品的基因組DNA，并運(yùn)用 核酸定量分析儀測(cè)定其基因組DNA提取物中的DNA濃度，然后將待檢測(cè)肉制品基因組DNA 提取物稀釋N倍，稀釋后的待檢測(cè)肉制品基因組DNA提取物中的DNA濃度小于100ng/ μ L ; 以稀釋后的待檢測(cè)肉制品基因組DNA作為模板進(jìn)行微滴數(shù)字PCR反應(yīng)，微滴數(shù)字PCR反應(yīng) 結(jié)束后，采用微滴分析儀測(cè)定微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系中的基因拷貝數(shù)；然后將基因拷貝數(shù) 代入步驟⑴得到的鴨肉樣品質(zhì)量-基因拷貝數(shù)的關(guān)系式M= (NY-N b^kAVVkAV中， 計(jì)算待檢測(cè)肉制品中的鴨肉質(zhì)量；然后根據(jù)計(jì)算出的鴨肉質(zhì)量，計(jì)算鴨肉質(zhì)量與待檢測(cè)肉 制品質(zhì)量的比值，即得到待檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的百分含量；
[0022] 其中，步驟⑴和步驟⑵中所述微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選 為20yL反應(yīng)體系，其具體配置見表1 ;其中，反應(yīng)體系中所述上游引物的核苷 酸序列為：5' -TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3' ；所述下游引物的核苷酸序列為： 5' -GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3';所述探針的核苷酸序列為：5' -HEX-TCCTGGTGTTAGGTTGTA AACGCTTG-BHQ1-3'。
[0023] 表1微滴數(shù)字PCR的反應(yīng)體系
[0025] 根據(jù)上述方法，優(yōu)選地，所述微滴數(shù)字PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋海?)微滴生成：通過微滴 發(fā)生器進(jìn)行微滴化處理，生成約20000個(gè)微滴；（2)PCR擴(kuò)增：95°C預(yù)變性lOmin，1個(gè)循環(huán)； 94°C變性 30s，60°C退火 lmin，98°C延伸 10min，40 個(gè)循環(huán)。
[0026] 根據(jù)上述方法，步驟a所述的鴨肉樣品和步驟（2)中所述的待檢測(cè)肉制品的預(yù)處 理過程相同，均為：將鴨肉或肉制品切成約lcm2-2cm2大小的肉丁，用蒸餾水洗凈，在10°C 水中浸泡過夜，以除去多余的鹽分和油脂，用組織勻漿機(jī)絞碎后于烘箱中80°C _85°C烘干 72h，然后將烘干后的肉加入粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎、勻質(zhì)處理，得到預(yù)處理后的鴨肉樣品或待 檢測(cè)肉制品。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肉制品中鴨源性成分的試劑盒，所述試劑盒包括特異性 引物和與該特異性引物配合使用的探針，其中，所述特異性引物的核苷酸序列為：
[0028] 上游引物：5' -TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3'（SEQ ID NO. 1)，
[0029] 下游引物：5'-GCGGAAGATACAAAAAGACACT