專利名稱：一種c8:0/c10:0/c12:0/c14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸
及其乙酯的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
生物柴油作為化石能源的可替代品，具有安全、可生物降解、燃燒完全等優(yōu)點(diǎn)，已受到許多國家的高度關(guān)注與重視。2010年，全球生物柴油產(chǎn)量約為1700萬噸，并呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢。目前，生物柴油主要利用動、植物油脂、油脂精練后的下腳料、油泥以及城市潲水油、油炸食品后的廢油等，經(jīng)改性處理，在催化劑催化下與短鏈醇如甲醇或乙醇等復(fù)合而成。生物柴油的主要成分是脂肪酸短鏈酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等。原料成本和生產(chǎn)工藝是制約生物柴油生產(chǎn)的兩大因素。生物柴油的生產(chǎn)原料目前大多是采用植物油脂和少量動物油脂，如豆油(主要是美國采用)、菜籽油(歐洲采用)、棕櫚油(印度尼西亞)和廢油(日本)等。我國主要使用地溝油和酸化油作為原料生產(chǎn)生物柴油(譚天偉等，2002)。原料不足是制約生物柴油規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵因素，原料成本已占生物柴油生產(chǎn)成本的75%以上，而且，大量種植含油植物存在與農(nóng)業(yè)爭地、破壞生物多樣性等問題。自20世紀(jì)90年代以來，利用微生物或藻類發(fā)酵生產(chǎn)油脂成為燃料油脂研究的重要方向和熱點(diǎn)領(lǐng)域。清華大學(xué)吳慶余等利用氮限制培養(yǎng)異養(yǎng)微藻脂，油脂含量達(dá)到50%以上，但微藻培養(yǎng)存在生物量小(10-20g/L)、培養(yǎng)周期長等不足，而微生物具有代謝旺盛、培養(yǎng)周期短、易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，微生物的油脂產(chǎn)量可達(dá)菌體干重的50-70% (施安輝等，2003 ;Papanikolaou S et al.，2004)。微生物油脂在脂肪酸組成上同植物油相似，是生產(chǎn)生物柴油的潛在原料。利用微生物培養(yǎng)生產(chǎn)油脂，是可持續(xù)發(fā)展的必然，也必將成為生物柴油合成的新方向(趙宗保，2005 ;黃英明等，2006 ；Eric J. Steen et al. , 2010)。目前國內(nèi)生物柴油主要原料來自地溝油，主要組分是長鏈脂肪酸(C16:0-C18:0)， 低溫性能較差，不適合我國北方地區(qū)的冬季使用。添加部分中鏈脂肪酸乙酯可以有效改善生物柴油的低溫性能，擴(kuò)大其使用范圍。另外，中鏈脂肪酸(C8:0-C14:0)亦用于化妝品、潤滑油基礎(chǔ)油等，應(yīng)用范圍廣，市場前景大。但目前中鏈脂肪酸多為從植物種子提取，來源有限，而且價格較高。微生物油脂多為胞內(nèi)產(chǎn)物，必須從組織、細(xì)胞中分離后，才能用于油脂原料及生物柴油生產(chǎn)，而且長鏈脂肪酸居多，這一過程關(guān)系油脂成分及生物柴油的質(zhì)量與成本。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)尤其合成生物學(xué)的發(fā)展，通過基因工程的手段，調(diào)控脂肪酸合成的相關(guān)酶的表達(dá)，增加特異性鏈長脂肪酸的產(chǎn)量，進(jìn)而合成脂肪酸乙酯，是微生物合成特定油脂及生物柴油的前沿技術(shù)。該方法既可以解決生物柴油的原料問題，又可以解決生產(chǎn)工藝步驟多、酶易失活等問題。與其它菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易于改造、生長速度快、適合高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，是微生物法合成化學(xué)品和燃料的理想菌株。利用大腸桿菌生產(chǎn)高附加值脂肪酸和生物柴油是不爭地、不靠天、可持續(xù)生產(chǎn)的新途徑。與公知技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)微生物油脂及生物柴油發(fā)酵生產(chǎn)周期短，不受場地、季節(jié)等因素的影響，不占用耕地資源，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。(2)脂肪酸及脂肪酸乙酯以游離方式分泌到細(xì)胞外，便于分離。(3)發(fā)酵液得到了高濃度的中鏈游離脂肪酸，克服了生物柴油生產(chǎn)中原料油脂的高成本、胞內(nèi)油脂不易分離的問題。(4)直接發(fā)酵得到高濃度的脂肪酸乙酯，克服了生物柴油生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用重組大腸桿菌(Escherichia coli)直接合成脂肪酸及其乙酯的可再生能源工藝路線，使微生物可以作為細(xì)胞工廠直接發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸及其乙酯。本發(fā)明首次采用三種植物萼距花屬植物(Cuphea hookeriana) /月桂樹 (Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中具有不同特異性FAT (fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase)家族中的硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB 來構(gòu)建工程菌，即將基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表達(dá)載體pETDuet_l中，得到重組質(zhì)粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)中，IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，表達(dá)的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，即可分別制得C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)C8:0和ClO: O脂肪酸所占比例為5. 42 %與12. 6 % ；PETDuet-ucFatB重組大腸桿菌所產(chǎn) C12:0脂肪酸所占比例為34. 52% ；PETDuet-ccFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)C14:0脂肪酸所占比例為32. 21%。再異源表達(dá)來自不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的高度非特異性高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶(WS)/?；o酶A 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，通過外源性流加乙醇的方式，催化脂肪酸代謝產(chǎn)物脂酰輔酶A與乙醇反應(yīng)生成脂肪酸乙酯，即完成脂肪酸乙酯的生產(chǎn)新途徑。具體為將不動桿菌中酰基轉(zhuǎn)移酶基因atfA分別克隆至表達(dá)載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 中得到重組質(zhì)粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，表達(dá)的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸；這些中鏈脂肪酸會在胞內(nèi)形成脂酰-CoA，共同表達(dá)的?；D(zhuǎn)移酶利用外源性流加的乙醇(1% -5% )與中鏈脂酰-CoA發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)合成脂肪酸乙醇酯，得到利用重組大腸桿菌直接合成CS: 0-C10:0/C12:0/ C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯的可再生資源工藝路線。本發(fā)明中硫酯酶特征在于通過特異性催化C8:0/C10:0/C12:0/C14:0脂酰ACP水
解來提高大腸桿菌體內(nèi)脂肪酸的含量；高度非特異性?；D(zhuǎn)移酶的特性在于可催化脂酰 CoA與任意結(jié)構(gòu)的醇類(包括乙醇)發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成脂肪酸乙醇酯。本發(fā)明首次克隆并表達(dá)來自萼距花屬植物/月桂樹/香樟中的特異性硫酯酶基因生產(chǎn)中鏈脂肪酸及其乙酯，可以有效改善生物柴油的低溫性能，且發(fā)酵原料易得，可再生； 產(chǎn)物可直接分泌至胞外，產(chǎn)物提取工藝簡單，大大降低成本，簡化了生產(chǎn)工藝。


圖I :DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側(cè)純化后的萼距花屬植物中硫酯酶基因PCR產(chǎn)物， 1248bp。右側(cè)為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖2 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-chFatB的圖譜，chFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點(diǎn)。圖3 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側(cè)純化后的月桂樹中硫酯酶基因PCR產(chǎn)物，1149bp。 左側(cè)為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖4 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-ucFatB的圖譜，UcFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點(diǎn)。圖5 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側(cè)純化后的香樟中硫酯酶基因PCR產(chǎn)物，1149bp。 左側(cè)為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖6 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-ccFatB的圖譜，ccFatB基因克隆于pETDuet-Ι載體，基因兩端帶有NdeI和EcoRV位點(diǎn)。圖7 =DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側(cè)純化后的不動桿菌中?；D(zhuǎn)移酶基因PCR產(chǎn)物， 1377bp。右側(cè)為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖8 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-chFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-chFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點(diǎn)。圖9 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-ucFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-ucFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點(diǎn)。圖10 :構(gòu)建的重組載體pETDuet-ccFatB-atfA的圖譜，atfA基因克隆于 pETDuet-ccFatB載體，基因兩端帶有NcoI和EcoRI位點(diǎn)。圖11、圖12、圖13 :分別表示含有重組質(zhì)粒pETDuet-chFatB-atfA、 pETDuet-ucFatB-atfA、pETDuet-ccFatB-atfA三株工程大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后，其培養(yǎng)液中脂肪酸乙酯的生產(chǎn)情況；C8:0表不Octanoic acid, ethyl ester ;C10:0表不Decanoic acid, ethyl ester ；C12:0 表不 Dodecanoic acid, ethylester ；C14:0 表不 Tetradecanoic acid, ethylester ;C16:0 表不 Hexadecanoic acid, ethylester ;C18:1 表不 Oleic acid, ethylester ;C18:0 表不 Octadecanoic acid, ethyl ester。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的一種利用重組大腸桿菌直接合成脂肪酸乙酯的可再生能源工藝路線，使脂肪酸得到有效利用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決這一技術(shù)問題先針對來自萼距花屬植物中的硫酯酶基因(ChFatB)/月桂樹中的硫酯酶基因(UcFatB)/香樟中的硫酯酶基因(ccFatB)進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后利用全基因合成方法分別合成chFatB/ucFatB/ccFatB 基因，并以不動桿菌基因組DNA為模板，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并添加特殊的酶切位點(diǎn)，PCR 擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠回收獲得目的基因DNA片段，酶切后連接至雙啟動子pET載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選獲得陽性重組質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)純化、電泳檢測、測序鑒定目的基因。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)與外源性流加乙醇后，繼續(xù)培養(yǎng)，在重組大腸桿菌體內(nèi)和發(fā)酵液中均可獲得中鏈脂肪酸乙酯。本發(fā)明提供的方法，大腸桿菌中表達(dá)特異性調(diào)控中鏈脂肪酸合成及?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的關(guān)鍵酶基因，可高密度發(fā)酵且生長速度快，為高品質(zhì)的中鏈脂肪酸乙酯合成開辟途徑。實(shí)驗(yàn)步驟I)采用的菌種不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi ；ATCC :33305)大腸桿菌BL21 (DE3)2)采用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，121°C濕熱滅菌20min)， 若配制平板培養(yǎng)基，則需加入I. 5%瓊脂粉；選擇性LB培養(yǎng)基50ml的LB培養(yǎng)基中加入 50 μ L左右O. I %的氨芐青霉素溶液；腦心浸液培養(yǎng)基(心提取物5. Og/L,腦提取物12. 5g/L，示胨10. Og/L,葡萄糖
2.0g/L,NaCl 5. 0g/L,Na2HP04 2. 5g/L，pH7. 4，115°C濕熱滅菌 20min)，若配制平板培養(yǎng)基， 則需加入I. 5%瓊脂粉。3)實(shí)驗(yàn)方法分別以全基因合成技術(shù)所合成的一個來自萼距花屬植物(Cuphea hookeriana)/ 月桂樹(Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA [acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase]和利用博邁德試劑盒法所提取的不動桿菌ADP I (Acinetobacter baylyi)基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得帶有特殊酶切位點(diǎn)的硫酯酶基因和高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶(WS) /?；o酶A 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(wax ester synthase/acy I-CoA: diacy I glycerol acy I transferase)基因。用膠回收試劑盒回收目的片段，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB片段和雙啟動子的原核表達(dá)載體pETDuet-Ι，并于16°C過夜連接， 即為構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ;將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒利用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法(即42°C熱擊法)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，即可獲得產(chǎn)硫酯酶的工程大腸桿菌。將工程大腸桿菌按I %的接種量接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C快速振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑后繼續(xù)在37°C快速振蕩培養(yǎng) 3-5h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；提取發(fā)酵液中脂肪酸，測定C8:0/C10:0/C12:0/C14:0特異性脂肪酸所占比例，即為制備好的中鏈脂肪酸。再利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別酶切?；D(zhuǎn)移酶基因atfA片段和雙啟動子的原核表達(dá)載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,并于 16°C過夜連接，即為構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB ；將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒利用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法(即42°C熱擊法)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中， 即可獲得產(chǎn)硫酯酶與酰基轉(zhuǎn)移酶的工程大腸桿菌。將工程大腸桿菌按I %的接種量接種到 50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C快速振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑與外源性流加乙醇后， 繼續(xù)在37°C快速振蕩培養(yǎng)3-5h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；提取發(fā)酵液中脂肪酸乙酯，測定C8:0/ C10:0/C12:0/C14:0特異性脂肪酸乙酯所占比例，即為制備好的中鏈脂肪酸乙酯。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體方法做進(jìn)一步的說明
實(shí)施例II脂肪酸調(diào)控相關(guān)基因-萼距花屬植物中硫酯酶的克隆與重組載體的構(gòu)建I. I萼距花屬植物中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成萼距花屬植物(Cuphea hookeriana)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。萼距花屬植物中 chFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將CS: 0-C10:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內(nèi)獲得中鏈脂肪酸。以上述合成的萼距花屬植物中硫酯酶基因DNA為模板，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(Nde I和EcoR V)與保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增硫酯酶基因chFatB所用引物如下上游引物5，-GGAATTCCATATGGTTGCTGCGGCTGCCAGC-3’下游引物5’ -CGGGATATCTTAGCTAACGCTGTTACCG-3 ’PCR 反應(yīng)體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補(bǔ)至20 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min50s，循環(huán)30次，72度10min，4度保存。這樣就PCR擴(kuò)增克隆到目的硫酯酶基因chFatB 該基因序列長度為1248bp，PCR擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1248bp(如圖I所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB 重組載體的構(gòu)建將克隆的chFatB基因與pETDuet-Ι載體(購于Novagen公司)用相同的酶(NdeI 和EcoRV)進(jìn)行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜， 對長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR與質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列I所示，編碼如序列2所示的氨基酸序列。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-chFatB的圖譜(見圖2)。2含有萼距花屬植物硫酯酶基因chFatB工程大腸桿菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的含有硫酯酶基因ChFatB重組載體42 °C熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實(shí)施例2I脂肪酸調(diào)控相關(guān)基因-月桂樹中硫酯酶的克隆與重組載體的構(gòu)建I. I月桂樹中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成月桂樹(Umbellularia californica)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。月桂樹中 UcFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將C12:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內(nèi)獲得單一的中鏈脂肪酸。以上述合成的月桂樹中硫酯酶基因DNA為模板，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(Nde I和EcoR V)與保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增硫酯酶基因UcFatB所用引物如下
上游引物5’-GGAATTCCATATGGCTACCACCTCTCTGGCCAG-3’下游引物5，-CGGGATATCTTAAACACGCGGTTCCGC-3，PCR 反應(yīng)體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補(bǔ)至20 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循環(huán)30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴(kuò)增克隆到目的硫酯酶基因UcFatB 該基因序列長度為1149bp，PCR擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1149bp (如圖3所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ucFatB 重組載體的構(gòu)建將克隆的UcFatB基因與pETDuet_l載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)進(jìn)行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜，對長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR與質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列3所示，編碼如序列4所示的氨基酸序列。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-ucFatB的圖譜(見圖4)。2含有月桂樹中硫酯酶基因UcFatB工程大腸桿菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的含有硫酯酶基因UcFatB重組載體42 °C熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實(shí)施例3I脂肪酸調(diào)控相關(guān)基因-香樟中硫酯酶的克隆與重組載體的構(gòu)建I. I香樟中硫酯酶基因的克隆利用全基因合成的方法合成香樟(Cinnamomum camphora)中的硫酯酶基因 DNA (acy I-acy I carrier protein (ACP) thioesterase)。香樟中 ccFatB 編碼硫酯酶基因，該基因可特異性地將C14:0脂酰ACP水解為脂肪酸，即可在重組大腸桿菌體內(nèi)獲得中鏈脂肪酸。以上述合成的香樟中硫酯酶基因DNA為模板，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(Nde I和EcoR V)與保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增硫酯酶基因ccFatB所用引物如下上游引物5’ -GGAATTCCATATGGCCACTACCAGCCTGGCCA-3 ’下游引物5’-CGGGATATCTTACACGCTGCTTTCCGCCG-3’PCR 反應(yīng)體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補(bǔ)至20 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度2min30s,循環(huán)30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴(kuò)增克隆到目的硫酯酶基因ccFatB 該基因序列長度為1149bp，PCR擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1149bp (如圖5所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-ccFatB 重組載體的構(gòu)建
將克隆的ccFatB基因與pETDuet-Ι載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nde I和EcoR V)進(jìn)行酶切，載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，16°C連接過夜，對長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR與質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列5所示，編碼如序列6所示的氨基酸序列。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-ccFatB的圖譜(見圖6)。2含有香樟中硫酯酶基因ccFatB工程大腸桿菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的含有硫酯酶基因ccFatB重組載體42 °C熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切鑒定、和測序鑒定篩選獲得陽性重組工程菌，即獲得了含有底物特異性的硫酯酶基因工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實(shí)施例4中鏈脂肪酸的合成、提取與氣相檢測I游離中鏈脂肪酸的合成將工程大腸桿菌pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 按 I % 的接種量接種到500mL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含50 μ g .mr1的氨芐青霉素)，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)(約3h)，當(dāng)0D600約為O. 4-0. 6時，在菌液中加入4mM誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度Immol Γ1, 繼續(xù)在30°C條件下振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液在SOOOrpm條件下，離心lOmin，取含有游離脂肪酸的上清液保存，為后續(xù)檢測工作做準(zhǔn)備。2游離中鏈脂肪酸的提取提取20ml發(fā)酵液中游離脂肪酸，先加入2mL HCl充分混勻酸化，再加入20ml乙酸乙酯，在振蕩儀上振蕩15s，充分進(jìn)行萃取，在提取過程中遵循少量多次的原則，5000r離心 lOmin，分離并收集有機(jī)層。再重復(fù)添加乙酸乙酯進(jìn)行二次萃取。利用乙酸乙酯的易揮發(fā)性對萃取的脂肪酸進(jìn)行濃縮。這樣即獲得一定濃度的游離中鏈脂肪酸。3游離中鏈脂肪酸的氣相檢測對乙酸乙酯所萃取的脂肪酸利用甲酯化試劑(三氟化硼/甲醇VBF3/V甲醇 =12.88)甲酯化之后進(jìn)行氣相色譜分析，氣相色譜條件如下=RTX-WAX毛細(xì)管色譜柱 (30mX0. 32mmX0. 25 μ m)，載氣高純氦氣(99. 999%)，進(jìn)樣器溫度220°C，檢測器溫度 250°C，載氣柱頭壓10psi ;程序升溫起始50°C，維持O. 5min ；25°C /min升溫至150°C， 保持Imin ;3°C/min升溫至220°C，保持lOmin。(結(jié)果見圖11，12，13)從最終氣相圖譜中可分析得出pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性C8:0和ClO:O脂肪酸所占比例為5. 42%與12. 6%，其余的脂肪酸C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例為 18. 77 %、17. 71 %,27. 41%,10. 7%111 % ;pETDuet_ucFatB 重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性 C12:0脂肪酸所占比例為34. 52%，其余的脂肪酸C14:0、C16:0、C18:0和C18:1所占比例為24. 07%,27. 21%、10· 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB 重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性 C14:0 脂肪酸所占比例為32. 21%，其余的脂肪酸C12: O、C16:0、C18:0和C18:l所占比例為 22. 36%,31. 48%、12. 01%和 I. 2% 0實(shí)施例5I?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆與重組載體的構(gòu)建I. I不動桿菌ADPl中?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆與序列測定不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)購買自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC33305)。利用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基活化菌種后，按I %的接種量接種于4ml LB液體試管培養(yǎng)基中，在37攝氏度搖床中培養(yǎng)12小時后，12000rpm離心Imin收集菌體。基因組DNA提取采用北京博邁德科技發(fā)展有限公司提供的細(xì)菌基因組提取試劑盒(具體方法參見說明書)。以上述所提取的不動桿菌基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)引物，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增酰基轉(zhuǎn)移酶基因所用引物如下上游引物5，-CATGccatggGCCGCCCATTACATCCGATT-3’下游引物5’ -CCGgaattcTTAATTGGCTGTTTTAATATC-3 ’PCR 反應(yīng)體系含有 I μ L 基因組 DNA，10 μ L 2 XPfu Master Mix 引物各 O. 5 μ L，加雙蒸水補(bǔ)至20 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性94度3min，94度變性30s，退火55度30s，延伸72 度3min,循環(huán)30次,72度IOmin, 4度保存。這樣就PCR擴(kuò)增克隆到目的酰基轉(zhuǎn)移酶atfA基因該基因序列長度為1377bp，PCR擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，所得到目的DNA條帶為1377bp (如圖7所示)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。I. 2 pETDuet-chFatB-atfA 重組載體的構(gòu)建將克隆的atfA基因與測序驗(yàn)證正確的pETDuet-chFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進(jìn)行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養(yǎng)后，挑取適量單菌落，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-chFatB-atfA原理圖譜如圖8所示。I. 3 pETDuet-ucFatB-atfA 重組載體的構(gòu)建將克隆的atfA基因與測序驗(yàn)證正確的pETDuet-ucFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進(jìn)行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養(yǎng)后，挑取適量單菌落，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-ucFatB-atfA原理圖譜如圖9所示。1. 4 pETDuet-ccFatB-atfA 重組載體的構(gòu)建將克隆的atfA基因與測序驗(yàn)證正確的pETDuet-ccFatB載體(購于Novagen公司)用相同的酶(Nco I和EcoR I)進(jìn)行酶切，37°C酶切3小時。載體與外源基因片段按摩爾比I : 3-1 10的比例，利用Fermentas的T4連接酶16°C連接過夜，用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有氨芐抗性LB瓊脂平板，37度過夜培養(yǎng)后，挑取適量單菌落，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證插入片段，并測定其序列如序列7所示，編碼如序列8所示的氨基酸序列。測序結(jié)果正確即獲得陽性重組載體。所構(gòu)建的重組載體pETDuet-ccFatB-atfA原理圖譜如圖10所示。2含有硫酯酶基因UcFatB與?；D(zhuǎn)移酶基因atfA工程大腸桿菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的含有硫酯酶基因UCFatB與?；D(zhuǎn)移酶基因atfA重組表達(dá)載體42°C熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，即獲得了含有底物特異性硫酯酶基因和催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的?；D(zhuǎn)移酶基因的工程大腸桿菌，_80°C保存該菌株。實(shí)施例6I乙酸乙酯的合成、提取與氣相質(zhì)譜檢測將工程大腸桿菌pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/ pETDuet-ccFatB-atfA按I %的接種量接種到500mL LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含50 μ g · πιΓ1 的氨芐青霉素)，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)(約3h)，當(dāng)0D600約為O. 4-0. 6時，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度Immol · L—1，再外源性流加2% (1% -5% )的乙醇至終濃度為
O.1% -O. 2%，繼續(xù)在25°C條件下振蕩培養(yǎng)24h。在上述發(fā)酵液中加入充足的乙酸乙酯，振蕩15s，進(jìn)行充分萃取，50001■離心 lOmin，分離并收集有機(jī)層。對乙酸乙酯萃取的脂肪酸乙酯樣品進(jìn)行GC檢測，氣相色譜條件為RTX-WAX毛細(xì)管色譜柱(30mXO. 32mmXO. 25 μ m)，載氣高純氦氣(99. 999%),進(jìn)樣器溫度220°C,檢測器溫度250°C，載氣柱頭壓IOpsi ;程序升溫起始50°C，維持O. 5min ；25°C /min升溫至 150°C，保持lmin;3°C/min升溫至220°C，保持lOmin。(結(jié)果見圖11，12，13)從最終氣相圖譜中可分析得出pETDuet-chFatB-atfA重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性C8:0和ClO:O脂肪酸乙酯所占比例為5. 42%與12. 6%，其余的C12:0、C14:0、C16:0、C18:0和C18:l脂肪酸乙酯所占比例為18. %Λ . 71%,27. 41%,10. 7%I. 11% ；pETDuet-ucFatB-atfA 重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性C12:0脂肪酸乙酯所占比例為34. 52%，其余C14:0、C16:0、C18:0和 C18:1 脂肪酸乙酯所占比例為24. 07%,27. 21%,10. 8%和 O. 76% ；pETDuet-ccFatB-atfA 重組大腸桿菌所產(chǎn)特異性C14:0脂肪酸乙酯所占比例為32. 21 %，其余C12:0、C16:0、 C18:0和C18:1脂肪酸乙酯所占比例為22. 36%,31. 48%U2. 01%和I. 2%0
權(quán)利要求
1.一種C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括步驟I、分別將萼距花屬植物/月桂樹/香樟中來自脂酰?；D(zhuǎn)運(yùn)蛋白硫酯酶(FAT)家族中具有不同特異性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至原核表達(dá)載體,得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至BL21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)生產(chǎn)中鏈脂肪酸。步驟2、再將不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/?；o酶A 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因atfA分別克隆至已連接硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB的原核表達(dá)載體， 得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至BL21 (DE3)中，經(jīng)外源性流加乙醇與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后生產(chǎn)中鏈脂肪酸乙醇酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所表達(dá)的來自萼距花屬植物/月桂樹/ 香樟中FAT家族硫酯酶可特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/ C14:0中鏈脂肪酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所表達(dá)的來自不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/?；o酶A二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶可催化外源性流加的乙醇(1% -5% ) 與胞內(nèi)形成的中鏈脂酰-Cok發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述chFatB/ucFatB/ccFatB基因克隆至雙啟動子原核表達(dá)載體pETDuet-Ι,得到重組質(zhì)粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/ pETDuet-ccFatB。其中硫酯酶基因置于T7promoter 2下游，由T7啟動子驅(qū)動表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述atfA基因克隆至雙啟動子原核表達(dá)載體 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB,得到重組質(zhì)粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。其中酸基轉(zhuǎn)移酶基因置于T7promoter I下游，由T7啟動子驅(qū)動表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pETDuet-chFatB/ pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 的重組大腸桿菌，經(jīng)添加 O. 2-0. 48mM IPTG 誘導(dǎo)硫酯酶表達(dá)后，可特異性水解特定鏈長的脂酰ACP，分別得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)C8:0和C10:0脂肪酸所占比例為5.42%% 12. 6% ；PETDuet-ucFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)C12:0脂肪酸所占比例為34. 52% ； pETDuet-ccFatB重組大腸桿菌所產(chǎn)C14:0脂肪酸所占比例為32. 21%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pETDuet-chFatB-atfA/ pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA 的重組大腸桿菌，經(jīng)添加 O. 2-0. 48mM IPTG 誘導(dǎo)硫酯酶和?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)與外源性流加1% -5%乙醇后，可催化乙醇與相應(yīng)的中鏈脂酰-Cok發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成特定的C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸乙醇酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述的來自萼距花屬植物/月桂樹/香樟中 FAT家族硫酯酶的核酸序列如序列1/3/5所示，各自所編碼氨基酸序列如序列2/4/6所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述來自不動桿菌中高度非特異性的雙功能蠟酯合成酶/?；o酶A 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列如序列7所示，所編碼氨基酸序列如序列8所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用工程大腸桿菌合成C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中鏈脂肪酸及其乙酯的生產(chǎn)方法。具體步驟為將萼距花屬植物/月桂樹/香樟中具有不同特異性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表達(dá)載體pETDuet-1中得到相應(yīng)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的硫酯酶特異性水解特定鏈長的脂酰ACP得到中鏈脂肪酸；分別將不動桿菌中酰基轉(zhuǎn)移酶基因atfA克隆至表達(dá)載體pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB中得到相應(yīng)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，共表達(dá)的?；D(zhuǎn)移酶利用外源性流加的乙醇與中鏈脂肪酸在胞內(nèi)形成的脂酰-CoA發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)合成脂肪酸乙酯，得到利用重組大腸桿菌直接合成中鏈脂肪酸及其乙酯的工藝路線。
文檔編號C12P7/62GK102586350SQ20121000479
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉軍鋒, 劉珞, 王芳, 范麗蘋, 譚天偉, 鄧?yán)?申請人:北京化工大學(xué)