專(zhuān)利名稱(chēng)：基因表達(dá)盒及含有該基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體的制作方法
基因表達(dá)盒及含有該基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種基因表達(dá)盒及含有該基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法主要采用病毒攜帶特異性的啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)，其主要方法是克隆出在某一類(lèi)群細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子序列，然后亞克隆到攜帶有目的基因的病毒轉(zhuǎn)移載體上實(shí)現(xiàn)基因的特異性表達(dá)。該方法在某些情況下能夠取得較好的效果，但是多數(shù)情況下卻得不到理想的效果，主要是因?yàn)樗捎玫奶禺愋詥?dòng)子在多數(shù)情況下表達(dá)效率比較低，同時(shí)又很難找到其他可替代的特異性啟動(dòng)子，那么要提高目的基因的表達(dá)效率同時(shí)又兼顧細(xì)胞選擇性成為急需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種表達(dá)效率較高且細(xì)胞特異性較強(qiáng)的基因表達(dá)盒。一種基因表達(dá)盒，包括依次相連的無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子、LoxP位點(diǎn)、終止子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、Cre重組酶基因、終止子、LoxP位點(diǎn)、目的基因及終止子，其中，兩個(gè)LoxP 位點(diǎn)是同向的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子、EFl-a啟動(dòng)子或 PGK啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述CMV啟動(dòng)子的基因序列為序列表中的SEQ ID NO :1。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述LoxP位點(diǎn)的基因序列為序列表中的SEQ ID NO :2。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述終止子為SV40 poly A終止子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述SV40 poly A終止子的序列為序列表中的SEQ ID NO 3。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Cre重組酶基因序列為序列表中的SEQ ID NO :4。
包含上述特征的基因表達(dá)盒可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體，從而用于疾病的診斷或治療等領(lǐng)域。優(yōu)選的，使用的表達(dá)載體可以為質(zhì)?；虿《尽?當(dāng)該基因表達(dá)盒導(dǎo)入到活體動(dòng)物的某個(gè)組織后，無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄被下游終止子提前終止，具有細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子會(huì)在靶細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶，非靶細(xì)胞中不表達(dá)，Cre重組酶會(huì)識(shí)別基因表達(dá)盒上的LoxP位點(diǎn)，將兩同向LoxP位點(diǎn)之間的序列剪切掉，從而開(kāi)啟了無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該基因表達(dá)盒無(wú)需使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，同時(shí)保證細(xì)胞的選擇性；且無(wú)需使用多個(gè)表達(dá)載體，只要按要求將基因表達(dá)盒克隆到實(shí)驗(yàn)所需的表達(dá)載體就可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?jié)省了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。


圖1為一實(shí)施方式的基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為具體實(shí)施例部分設(shè)計(jì)的基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為pMD18T-CS載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖；圖4為pMD18T-CS載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖5為pMD18T-CCS載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖；圖6為pMD18T-CCS載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖7為pMD18T-CCST載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖；圖8為pMD18T-CCST載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖9為pShuttle-CCS載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖；圖10為pShuttle-CCS載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖11為pshuttle-CCS_ChR2載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖；圖12為pshuttle-CCS-ChR2載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖13為含有該基因表達(dá)盒的腺病毒在體內(nèi)表達(dá)ChR2的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)基因表達(dá)盒及含有該基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。如圖1所示，一實(shí)施方式的基因表達(dá)盒，包括依次連接的無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子 (Promoter 1)、LoxP位點(diǎn)、終止子(stop)、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(Promoter2)、Cre重組酶基因、終止子(stop)、LoxP位點(diǎn)、目的基因(Target gene)及終止子(stop)，其中，兩個(gè)LoxP 位點(diǎn)是同向的。本實(shí)施方式的無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子優(yōu)選強(qiáng)啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子、EFl-a啟動(dòng)子或PGK啟動(dòng)子等，其中CMV啟動(dòng)子的基因序列為序列表中的SEQ ID NO :1。該強(qiáng)啟動(dòng)子可以在眾多類(lèi)型的細(xì)胞(靶細(xì)胞或者非靶細(xì)胞)中啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，用來(lái)高效的表達(dá)目的基因。具體實(shí)施過(guò)程中可以根據(jù)需求克隆相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子序列到該位置。Cre/LoxP位點(diǎn)重組酶系統(tǒng)是在體內(nèi)外進(jìn)行遺傳表達(dá)的有力工具，Cre重組酶能夠識(shí)別DNA序列上的LoxP位點(diǎn)，當(dāng)DNA序列中有兩個(gè)同向的LoxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶會(huì)將位于LoxP位點(diǎn)之間的DNA序列剪切掉，從而關(guān)閉或開(kāi)啟基因的表達(dá)。其中，LoxP位點(diǎn)的基因序列如序列表中的SEQ ID NO 2所示，Cre重組酶基因序列如序列表中的SEQ ID NO 4所不。終止子可以采用常用的SV40 polyA (簡(jiǎn)稱(chēng)pA)終止序列，其序列如序列表中的SEQ ID NO 3 所示。細(xì)胞特異性啟動(dòng)子只能在特定類(lèi)型的細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)靶細(xì)胞)中表達(dá)相應(yīng)的目的基因，在非靶細(xì)胞中則沒(méi)有啟動(dòng)目的基因表達(dá)的功能。一般情況下，其在特定細(xì)胞中啟動(dòng)效率較低，其對(duì)應(yīng)的目的基因的表達(dá)效率也較低。兩個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)使用(即無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子和細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)，并且結(jié)合Cre/LoxP系統(tǒng)，讓細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Cre重組酶，當(dāng)Cre重組酶表達(dá)后，就會(huì)在靶細(xì)胞內(nèi)將表達(dá)盒中的兩個(gè)同向LoxP位點(diǎn)之間的序列剪切掉，從而開(kāi)啟了強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)。當(dāng)具有圖1結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)盒的表達(dá)載體進(jìn)入動(dòng)物特定組織后，位于LoxP位點(diǎn)中的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子就會(huì)選擇性的在靶細(xì)胞類(lèi)群中表達(dá)Cre重組酶，而其它細(xì)胞類(lèi)群中則不表達(dá)Cre重組酶。盡管在細(xì)胞特異性啟動(dòng)子前設(shè)有無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子，在一般情況下其會(huì)啟動(dòng)下游序列的轉(zhuǎn)錄，但在該啟動(dòng)子后面的目的基因前設(shè)計(jì)有終止子，從而提前終止了它的轉(zhuǎn)錄，只有這段終止序列被剔除后，無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用。當(dāng)靶細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶后，基因表達(dá)盒中的兩個(gè)同向LoxP位點(diǎn)被Cre酶識(shí)別，從而將其間的 DNA序列剪切掉，被剪切的基因表達(dá)盒在DNA序列上發(fā)生重大變化，無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄被提前終止的結(jié)構(gòu)被解除，開(kāi)始下游目的基因的高效表達(dá)。包含上述特征的基因表達(dá)盒可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體，從而用于疾病的診斷或治療等領(lǐng)域。優(yōu)選的，使用的表達(dá)載體可以為質(zhì)?；虿《?。下面以具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明如何實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞中高效表達(dá)通常在五羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)光敏蛋白ChR2(Channelrh0d0pSinD是選取色氨酸羥化酶的啟動(dòng)子作為表達(dá)光敏蛋白ChR2的啟動(dòng)子，因?yàn)橹挥羞@種酶特異性的表達(dá)在五羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞中，但是使用該啟動(dòng)子后，目的基因的表達(dá)十分微弱，很難檢測(cè)至IJ，對(duì)于實(shí)驗(yàn)幾乎是沒(méi)有意義。研究發(fā)現(xiàn)色氨酸羥化酶在五羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)水平本身很低，即是色氨酸羥化酶啟動(dòng)子是一個(gè)弱啟動(dòng)子，自然表達(dá)效率很低。本實(shí)施例的無(wú)細(xì)胞特性的啟動(dòng)子選用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV promoter)，細(xì)胞特異性啟動(dòng)子選用色氨酸羥化酶啟動(dòng)子(TPH promoter)。其具體構(gòu)建方法如下一、實(shí)驗(yàn)材料1.質(zhì)粒和菌株pMD 18T-simple 及連接酶 solution I 購(gòu)自 takara 公司；pshuttle載體及腺病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自Mratagene公司；大腸桿菌感受態(tài)(Escherichia coli)DH5a 購(gòu)自 takara 公司。2.分子克隆主要相關(guān)試劑限制性?xún)?nèi)切酶 Bgl II、EcoR V、Kpn I、Not I、Xba I 禾口 Sac I 購(gòu)自 takara 公司， Pac I、Pme I、Xma I 購(gòu)自 NEB 公司。3.細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人胚胎腎細(xì)胞HEK293購(gòu)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞公司；C57小鼠購(gòu)自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。4.腺病毒包轉(zhuǎn)所需試劑DMEM,購(gòu)自于 GIBCO 公司；胎牛血清(FBS)，購(gòu)自于GIBCO公司；胰酶，購(gòu)自于GIBCO公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購(gòu)自于Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑(FuGENE HD transfection reagent)、細(xì)胞培養(yǎng)皿及移液管購(gòu)自coming 公司。二、實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)1. LoxP, stop、SV40 ρIoyA及Cre重組酶基因的DNA序列合成及克隆利用基因合成技術(shù)合成如圖2所示的DNA序列，將該序列插入到pMD18T-Simple 載體上，經(jīng)酶切鑒定該序列確實(shí)插入到載體中，并將該載體命名為PMD18T-CS。
pMD18T-CS載體構(gòu)建的技術(shù)路線(xiàn)圖如圖3所示。pMD18T_CS酶切鑒定Bgl II和 EcoR V，酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，得到大約1. 7kb左右的片段和2. 6kb的片段，證明構(gòu)建成功，其中，鑒定過(guò)程中使用的Marker為1Kb DNA ladder。2. CMV promoter 的克隆利用PCR技術(shù)，以ρ⑶NA3. 1載體為模板，擴(kuò)增CMV promoter,將擴(kuò)增后的片段插入到pMD18T-CS載體的Bgl II與&icl之間，并將構(gòu)建的載體命名為pMD18T_CCS，構(gòu)建過(guò)程如圖5所示。pMD18T-CCS酶切鑒定結(jié)果如圖6所示，經(jīng)Bgl II和I酶切，得到約4. 3Kb和 600bp左右(即CMV promoter片段的長(zhǎng)度)的片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該序列正確，其中，鑒定過(guò)程中使用的 Marker 為 1Kb DNA ladder。3. TPH promoter 的克隆提取小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的基因組DNA，以該基因組DNA為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增TPH promoter,并將該序列插入到pMD18T_CCS載體的Sbf I與Xma I之間，構(gòu)建過(guò)程如圖7所示，將構(gòu)建的載體命名為PMD18T-CCST。pMD18T-CCST酶切鑒定結(jié)果如圖8所示，經(jīng)Xma I和Sbf I酶切，得到約4. 9Kb和 IKbTPH啟動(dòng)子左右的片段，測(cè)序證實(shí)該片段正確插入，其中，鑒定過(guò)程中使用的Marker為 1Kb DNA ladder。4.將含有TPH promoter的表達(dá)盒(即pMD18T_CCST)克隆到pshuttle載體上利用PCR的方法以pMD18T為模板，擴(kuò)增含有TPH promoter的表達(dá)盒，將該片段插入到pshuttle載體的Kpn I與Not I之間，構(gòu)建過(guò)程如圖9所示，并將構(gòu)建的載體命名為 pshuttle-CCS。pshuttle-CCS酶切鑒定結(jié)果如圖10所示，經(jīng)Kpn I和Not I酶切，得到約3.2Kb 和6. 6Kb左右的片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該序列插入正確，其中，鑒定過(guò)程中使用的Marker為1Kb DNA ladder。5. ChR2 及 SV40polyA 克隆到 pshuttle-CCS 載體上利用PCR技術(shù)或者基因合成的方式獲得ChR2與SV40polyA序列，將該序列插入到 pshuttle-CCS的)(ba I和EcoRV之間，并將構(gòu)建的載體命名為pshuttle-CCS_ChR2構(gòu)建過(guò)程如圖11所示。pshuttle-CCS-ChR2酶切鑒定結(jié)果如圖12所示，經(jīng)Xba I和EcoR V酶切，得到約1. 3Kb和9. 8Kb左右的片段，測(cè)序證實(shí)該序列正確的插入其中，鑒定過(guò)程中使用的Marker 為 1Kb DNA ladder。6.將上面構(gòu)建好的載體利用腺病毒包裝技術(shù)，制備腺病毒，將包裝好的病毒利用立體定位儀注射到小鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)X區(qū)，腺病毒會(huì)感染注射位點(diǎn)周?chē)牟糠謪^(qū)域，在五羥色胺能神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)群中，色氨酸羥化酶啟動(dòng)子會(huì)啟動(dòng)Cre重組酶的低效率轉(zhuǎn)錄，Cre重組酶會(huì)表達(dá)在五羥色胺能神經(jīng)元中，非五羥色胺能神經(jīng)元中則不能表達(dá)Cre重組酶，Cre重組酶表達(dá)后會(huì)識(shí)別表達(dá)盒結(jié)構(gòu)上的LoxP位點(diǎn)，LoxP位點(diǎn)中間的DNA序列被剪切，同時(shí)CMV promoter下游的終止序列也被剪切，從而實(shí)現(xiàn)了光敏蛋白ChR2在強(qiáng)啟動(dòng)子下的高效表達(dá)。將具有該基因表達(dá)盒并攜帶有ChR2基因的腺病毒載體構(gòu)建好之后，利用該載體包裝腺病毒，將包裝好的腺病毒利用立體定位注射方式，注射C57小鼠的大腦的中縫核(DRN)區(qū)域，四天后，取出該中縫核區(qū)域的組織提取蛋白，免疫印跡檢測(cè)ChR2的表達(dá)情況。 以不具有該基因表達(dá)盒的腺病毒載體為對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如圖13所示，其中，Lanel 未注射病毒C57，lane 2 注射含有基因表達(dá)盒的病毒，lane3 注射只含有ChR2基因的病毒，證明 ChR2基因在小鼠體內(nèi)成功表達(dá)，且lane 2條帶亮度明顯強(qiáng)于lane 1和lane 3，說(shuō)明ChR2 基因在小鼠體內(nèi)高效表達(dá)。當(dāng)該基因表達(dá)盒導(dǎo)入到活體動(dòng)物的某個(gè)組織后，無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄被下游終止子提前終止，具有細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子會(huì)在靶細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶，非靶細(xì)胞中不表達(dá)，Cre重組酶會(huì)識(shí)別基因表達(dá)盒上的LoxP位點(diǎn)，將兩同向LoxP位點(diǎn)之間的序列剪切掉，從而開(kāi)啟了無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該基因表達(dá)盒無(wú)需使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，同時(shí)保證細(xì)胞的選擇性；且無(wú)需使用多個(gè)表達(dá)載體，只要按要求將基因表達(dá)盒克隆到實(shí)驗(yàn)所需的表達(dá)載體就可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?jié)省了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種基因表達(dá)盒，其特征在于，包括依次相連的無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子、LoxP位點(diǎn)、 終止子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、Cre重組酶基因、終止子、LoxP位點(diǎn)、目的基因及終止子，其中， 兩個(gè)LoxP位點(diǎn)同向設(shè)計(jì)。
2.如權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子、EFl-a啟動(dòng)子或PGK啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述CMV啟動(dòng)子的基因序列為序列表中的 SEQ ID NO :1ο
4.如權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述LoxP位點(diǎn)的基因序列為序列表中的 SEQ ID NO :2ο
5.如權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述終止子為SV40poly A終止子。
6.如權(quán)利要求5所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述SV40poly A終止子的序列為序列表中的SEQ ID NO :3ο
7.如權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述Cre重組酶基因序列為序列表中的 SEQ ID NO :4ο
8.含有權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述載體為質(zhì)粒或病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因表達(dá)盒及其應(yīng)用，該基因表達(dá)盒包括依次連接的無(wú)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子、LoxP位點(diǎn)、終止子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、Cre重組酶基因、終止子、LoxP位點(diǎn)、目的基因及終止子，其中，兩個(gè)LoxP位點(diǎn)是同向的。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該基因表達(dá)盒無(wú)需使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，同時(shí)保證細(xì)胞的選擇性；且無(wú)需使用多個(gè)表達(dá)載體，只要按要求將基因表達(dá)盒克隆到實(shí)驗(yàn)所需的表達(dá)載體就可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?jié)省了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102533744SQ20111045171
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日 公開(kāi)號(hào)201110451711.發(fā)明者潘建青, 王立平, 羅振 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院