專利名稱：Muc1蛋白核酸適配子、復(fù)合體、組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MUCl蛋白核酸適配子、復(fù)合、組合物及其用途。
背景技術(shù)：
化療是治療腫瘤最主要的手段，尤其是對(duì)于晚期階段的轉(zhuǎn)移性腫瘤。但是，細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生的副作用往往限制了化療的效果。細(xì)胞毒藥物最主要的問題是它們能同時(shí)損傷腫瘤細(xì)胞和正常組織，引起嚴(yán)重的副反應(yīng)，限制了化療的強(qiáng)度和時(shí)程。因此，細(xì)胞毒藥物很難能夠清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致了臨床上治療的失敗和患者預(yù)后的不良。基于這一點(diǎn)，需要研發(fā)新的方法來(lái)降低化療藥物的毒性。靶向治療是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的途徑之一。靶向治療是指靶向分子攜帶藥物特異性地到達(dá)腫瘤部位，使藥物更多的富集在腫瘤組織中，而在正常組織中的含量較少。由于藥物被特異性地帶到腫瘤部位，對(duì)腫瘤組織的殺傷增強(qiáng)而對(duì)正常組織殺傷較弱，從而有助于清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，并大大降低毒副作用。靶向治療是有希望改善抗腫瘤化療療效的重要方向之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，核酸適配子作為靶向分子的納米載體攜帶順鉬在小鼠腫瘤模型中能夠顯著增強(qiáng)抗前列腺癌的效果(Dhar S，Gu FX, Langer R, Farokhzad 0C, Lippard SJ(2008)Targeted delivery of cisplatinto prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt (IV)prodrug-PLGA-PEGnanoparticles.Proc Natl Acad Sci USA 105:17356-17361.)。單克隆抗體和藥物共價(jià)連接已經(jīng)用于腫瘤的靶向治療研究。其中，HER2抗體和一種化學(xué)藥物形成的復(fù)合體正在進(jìn)行 III 期臨床試驗(yàn)(Vogel CL, Burris HA, Limentani S, Borson R, O' ShaughnessyJ, etal.(2009)A phase II study of trastuzumab-DMl(T-DM1), a HER2antibody-drugconjugate(ADC), in patients(pts)with HER2+metastatic breast cancer (MBC):Finalresults.Journal of Clinical Oncology 27.)。
靶向藥物傳遞系統(tǒng)通常包括抗腫瘤藥物和靶向分子，靶向分子能夠和表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤標(biāo)志物特異性的結(jié)合。一個(gè)理想的分子靶標(biāo)最好是表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜表面，并且在腫瘤部位高表達(dá)而正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。MUCl蛋白是一種廣泛的表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞膜上的糖蛋白，在大多數(shù)腺癌(乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等)中高表達(dá)，表達(dá)量是正常組織的 10 倍以上(Taylor-Papadimitriou J, Burchell J, MilesDff, Dalziel M(1999)MUCland cancer.BBA-Mol Basis Dis 1455:301-313.)，因而是一個(gè)較為理想的靶標(biāo)。MUCl蛋白由肽核心和糖鏈組成，肽核心是一段可變的重復(fù)序列，是具有免疫原性的部分，正常表達(dá)時(shí)，糖鏈的存在使肽核心隱蔽起來(lái)，失去免疫原性，腫瘤組織中異常表達(dá)時(shí)，由于糖鏈的丟失而使肽核心部分暴露了出來(lái)，成為治療的靶點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)MUCl蛋白的篩選也是應(yīng)用這段多肽作為靶標(biāo)，這可能是由于很難獲得整個(gè)MUCl蛋白。
靶向治療的實(shí)現(xiàn)還需要合適的靶向分子，理想的靶向分子是能夠和靶標(biāo)特異性結(jié)合，親和力高，在體內(nèi)免疫原性弱，穩(wěn)定性好。最近，一批新的靶向分子例如核酸適配子、短肽和小分子已經(jīng)成為了新一代的靶向分子。核酸適配子(aptamer)是近幾十年發(fā)展起來(lái)的新型核苷酸配體分子，特異性強(qiáng)，親和力高，相比抗體有許多優(yōu)勢(shì)，例如易于大規(guī)模合成，價(jià)格便宜，易于體外修飾，體內(nèi)低免疫原性，易于穿透腫瘤組織等。因此，核酸適配子越來(lái)越廣泛的作為靶向載體工具應(yīng)用到腫瘤的靶向治療研究中。根據(jù)已有的報(bào)道，F(xiàn)erreira小組篩選到了一組MUCl蛋白的適配子，能夠選擇性的和MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，并且，篩選出來(lái)的適配子還可在體外選擇性的攜帶光動(dòng)力治療劑到MUCl陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞(Ferreira CS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxicaptamers selectively enter and kill epitheIialcancer cells.Nucleic Acids Res37:866-876.)。
細(xì)胞毒藥物是化療中最重要的成分，因此，研究MUCl的適配子能否直接攜帶細(xì)胞毒藥物到腫瘤細(xì)胞是非常重要的。至今為止，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)這項(xiàng)研究。細(xì)胞毒藥物是化療中最重要的成分，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)MUCl的適配子能否直接攜帶細(xì)胞毒藥物到腫瘤細(xì)胞。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于獲取能高特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞MUCl蛋白的核酸適配子并探尋其在制備腫瘤特異性靶向治療藥物中的用途。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO:9所示，以及其保持與MUCl蛋白特異性結(jié)合能力的長(zhǎng)度介于70-110、優(yōu)選75-100、更優(yōu)選80-90、最優(yōu)選86個(gè)核苷酸的變體，優(yōu)選地，所述變體具有如SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11所示的序列。
本發(fā)明的第二方面涉及一種復(fù)合體，其由如第一方面所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物結(jié)合而成或被共同包在納米粒中，優(yōu)選地，MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子的序列如SEQ IDN0:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示，且其中MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物的摩爾比例的范圍為0.001 1，優(yōu)選地，0.003 0.1，更優(yōu)選地，0.005 0.03。
優(yōu)選地，所述化療藥物選自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌，優(yōu)選地，所述化療藥物為阿霉素。
本發(fā)明的第三方面涉及一種組合物，其活性成分為上述第二方面所述的復(fù)合體。
本發(fā)明的第四方面涉及根據(jù)上述第一方面所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子作為化療藥物靶向 載體的用途，優(yōu)選地，所述化療藥物選自抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來(lái)霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼，更優(yōu)選地，所述化療藥物選自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、順鉬、吉西他濱、雷替曲塞、絲裂霉素、博萊霉素、長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿、卡鉬、他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松、吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼。
優(yōu)選地，所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物組成復(fù)合體或者被共同包在納米粒中。
本發(fā)明的第五方面涉及根據(jù)上述第二方面所述的復(fù)合體或根據(jù)第四方面所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中所述腫瘤為腺癌，優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或肝癌。
優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物的劑型為口服劑、肌肉注射劑或靜脈注射劑。
本發(fā)明的第六方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和腫瘤顯影劑的組合物，優(yōu)選地，所述MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和腫瘤顯影劑形成復(fù)合體，優(yōu)選地，所述顯影劑是鐵磁性納米?；虬孙@影劑的納米粒，優(yōu)選地，所述組合物中含有一種或多種MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和/或腫瘤顯影劑。
本發(fā)明的第七方面涉及一種根據(jù)上述第六發(fā)明所述的組合物在制備腫瘤靶向造影劑中的用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為腺癌，更優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或肝癌。
換言之，本發(fā)明利用SELEX 技術(shù)(Kim Y,Liu C,Tan W(2009)Aptamers generatedby Cell SELEX for biomarker discovery.BiomarkMed 3: 193-202.)篩選到一個(gè)和 MUCl蛋白特異性結(jié)合的核苷酸適配子(aptamer),并用該核苷酸適配子作為載體直接攜帶細(xì)胞毒藥物選擇性的到達(dá)MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中，因此，只要是MUCl呈陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞均可以被本發(fā)明所述的核苷酸適配子所靶向，由于大多數(shù)的腺癌如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等均高表達(dá)MUCl蛋白，因此，本發(fā)明的核苷酸適配子可以靶向大多數(shù)的腺癌。
S卩，本發(fā)明選取了 MUCl蛋白肽核心中最具有免疫原性的部分，用它篩選到了新的MUCl的核酸適配子，并在體外評(píng)估了它攜帶細(xì)胞毒藥物的能力。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明用MUCl的核心抗原肽為靶標(biāo)篩選到了一個(gè)新的核酸適配子MA3，序列如SEQ ID NO:9所示。該篩選出來(lái)的適配子具有86個(gè)堿基長(zhǎng)度，能形成更復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，親和系數(shù)為38nM。
流式細(xì)胞分析儀驗(yàn)證了該適配子和血漿中的白蛋白(BSA)具有很弱的交叉反應(yīng)，靶標(biāo)特異性較好。本發(fā)明還挑選了已發(fā)表的MUCl適配子中親和力最高的一個(gè) S2.2 (Ferreira CS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxic aptamers selectively enter and kiIlepithelial cancer cells.Nucleic Acids Res 37:866-876.；Ferreira CSM, Matthews CS, Missailidis S(2006)DNA Aptamers That Bind to MUClTumour Marker:Design and Characterization of MUC1-BindingSingle-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.),將其和MA3在結(jié)合BSA方面進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MA3和S2.2和靶標(biāo)多肽都有比較高的結(jié)合力，但是MA3和BSA的結(jié)合要明顯弱于S2.2。相對(duì)于S2.2,MA3和BSA的交叉反應(yīng)很弱，能夠選擇性的結(jié)合MUCl多肽。
流式細(xì)胞分析儀驗(yàn)證了該適配子和MUCl多肽具有較強(qiáng)的結(jié)合力，和MUCl陽(yáng)性細(xì)胞具有較高的結(jié)合力而和MUCl陰性細(xì)胞具有很弱的結(jié)合力。
利用dox能嵌入到雙鏈DNA中的特性，制備了適配子-dox靶向載藥復(fù)合體。通過(guò)對(duì)阿霉素?zé)晒夤庾V值的測(cè)定，確定阿霉素確實(shí)能夠嵌入到該適配子中。通過(guò)共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)了 Dox和適配子-dox靶向載藥復(fù)合體與MUCl陽(yáng)性和陰性腫瘤細(xì)胞的結(jié)合力。結(jié)果顯示，游離Dox在兩種細(xì)胞中的攝入都較高，沒有表現(xiàn)出選擇性，可能是因?yàn)橛坞xDox在不同細(xì)胞中的攝入機(jī)制是一樣的。相反，適配子-dox復(fù)合體在MUCl陽(yáng)性細(xì)胞中的攝入明顯高于在MUC l陰性細(xì)胞中的攝入，能夠區(qū)別靶向細(xì)胞和非靶向細(xì)胞。共聚焦顯微鏡顯示游離dox主要集中在細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，而適配子-dox則存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，這可能是游離dox和適配子-dox復(fù)合體被細(xì)胞攝入的不同機(jī)制造成的，游離的dox是通過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，嵌入到細(xì)胞核內(nèi)雙鏈DNA中，沒有細(xì)胞選擇性。而當(dāng)嵌入到適配子中后，DNA的極性成分阻斷了 dox進(jìn)入細(xì)胞膜。適配子-dox復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞很可能是由于適配子和A549細(xì)胞表面的MUCl蛋白結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。由于H印G2細(xì)胞缺乏表面的受體蛋白，因而造成復(fù)合體不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，Dox在細(xì)胞的攝入降低。發(fā)現(xiàn)適配子-dox復(fù)合體能夠選擇性的被MUCl陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞攝入，而在MUCl陰性細(xì)胞H印G2中攝入量明顯減少。MTS試驗(yàn)也證實(shí)了上面的細(xì)胞攝入Dox實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。當(dāng)然，本發(fā)明選擇dox來(lái)進(jìn)行適配子靶向載藥復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)僅是出于便于定量和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)二者結(jié)合及攝入的目的，并非意味著本發(fā)明所述的適配子必須要依靠化療藥物能插入到DNA雙鏈中的特性。與此相反，本發(fā)明所述的適配子可以與化療藥物如抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來(lái)霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼進(jìn)行復(fù)合使用，實(shí)現(xiàn)特異性靶向MUCl陽(yáng)性細(xì)胞的目的。
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，對(duì)MUCl陽(yáng)性細(xì)胞，載藥復(fù)合體引起的細(xì)胞毒作用和游離dox相似:然而，對(duì)于MUCl陰性細(xì)胞，載藥復(fù)合體引起的細(xì)胞毒作用低于游離dox(p< 0.01)。這些數(shù)據(jù)再一次說(shuō)明適配子-dox能選擇性地?cái)y帶dox到MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。從而降低dox對(duì)不表達(dá)MUCl蛋白的正常細(xì)胞的毒副作用。細(xì)胞毒藥物能同時(shí)損傷腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，從而引起毒副作用，嚴(yán)重限制了化療的效果和應(yīng)用。由于本發(fā)明的上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明適配子-dox復(fù)合體能夠區(qū)分靶向和非靶向細(xì)胞，而且MUCl蛋白在大多數(shù)腺癌表面高表達(dá)，因此MA3可以作為靶向分子在對(duì)多種惡性腫瘤的靶向治療方面找到潛在的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明還研究了上述序列的變體的MUCl蛋白的特異性結(jié)合能力，所述變體通過(guò)在上述序列的兩端或一段添加部分核苷酸或者改變所述序列中的部分核苷酸而獲得，所述變體保持或基本保持與SEQ IDNO:9相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而保持了其與MUCl蛋白特異性結(jié)合的能力。上述核苷酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，另外本發(fā)明的上述內(nèi)容中也具體公開了適配子與MUCl蛋白特異性結(jié)合的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以據(jù)此容易地獲得這樣的變體。這樣的變體的例子如下述序列:
5' -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO: 10)，和
5， -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO:11)，它們與MUCl蛋白的結(jié)合能力也較強(qiáng)(數(shù)據(jù)略)。
另外，本發(fā)明的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子還可以和腫瘤顯影劑聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)具體腫瘤的靶向顯影，從而為更精確地確定腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移、定位提供可以視覺化的判斷方式。


圖1:流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)SELEX篩選進(jìn)程。
圖2:流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)適配子MA3的靶標(biāo)特異性。(a)適配子和靶標(biāo)多肽的結(jié)合。(b)適配子和BSA的結(jié)合。(c) S2.2和靶標(biāo)多肽的結(jié)合。(d) S2.2和BSA的結(jié)合。
圖3: (a)適配子MA3和靶標(biāo)多肽的親和力的檢測(cè)。(b)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)適配子和26-AA多肽的結(jié)合，黑色部分是隨機(jī)對(duì)照。
圖4:流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)適配子MA3和MUCl陽(yáng)性細(xì)胞特異性結(jié)合。(a)MUCl+細(xì)胞 A549。(b) MUCl+細(xì)胞 MCH7。(c)MUCr 細(xì)胞 H印G2。(d)MUCr 細(xì)胞 L02。
圖5:熒光光譜分析不同摩爾比的適配子MA3和阿霉素的混合后阿霉素?zé)晒夤庾V值的變化。
從上到下摩爾比依次為:0,0.001,0.003,0.005,0.01,0.03,0.1，I。
圖6:上圖a-d:共聚焦顯微鏡檢測(cè)游離阿霉素和適配子-dox復(fù)合體在A549細(xì)胞和H印G2細(xì)胞中的攝入。下圖:流式細(xì)胞分析儀測(cè)定游離阿霉素(黑線)和適配子-dox復(fù)合體(灰線)在A549細(xì)胞(e)和H印G2細(xì)胞中(f)的攝入。
圖7:MTS法測(cè)定適配子MA3、dox和適配子_dox復(fù)合體對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷。
圖8:MTS法測(cè)定適配子MA3、dox和適配子_dox復(fù)合體對(duì)A549細(xì)胞的殺傷。
具體實(shí)施方式
下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。
實(shí)施例
實(shí)施例1
一、材料和方法
試劑
單鏈寡核苷酸由Invitrogen公司合成。多肽購(gòu)買于北京賽百盛公司。牛血清白蛋白購(gòu)買自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?。單分散磁珠，鏈酶親和素包被磁珠購(gòu)買自普洛麥格公司。EDC購(gòu)買自Sigma公司。
細(xì)胞系
人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、人肝癌細(xì)胞H印G2、人正常肝細(xì)胞L02均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞 中心。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS、常規(guī)濃度青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中(廠家:北京盈信陽(yáng)光生物技術(shù)有限公司，貨號(hào):07-021，商品名:DMEM高糖培養(yǎng)基)。細(xì)胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有試驗(yàn)所用細(xì)胞均是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
靶標(biāo)和磁珠的連接
用于篩選的靶標(biāo)為9個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽l(p印tidel)，序列為APDTRPAPG(SEQID NO:1)，其來(lái)自MUCl蛋白的高免疫原性的VNTR區(qū)域。多肽用含I % DMSO的雙蒸水溶解。2ug多肽和5\105磁珠混合，在40禮EDC水溶液中室溫反應(yīng)2h，PBS洗5次，最后重懸于PBS中，于4°C保存。用相同的方法處理BSA以及含有29個(gè)氨基酸殘基的GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (SEQ ID NO:2)的多肽 2 (p印tide2)和磁珠的連接。
DNA文庫(kù)的構(gòu)建
起始隨機(jī)文庫(kù)為含有86個(gè)堿基的單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)，中間為40個(gè)隨機(jī)序列，兩邊為固定的引物Pl序列:5’ AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC(N40)CACAGACACACTACACACGCACA3’ (SEQ ID NO:3) ,FITC 修飾的引物 P2 (5，-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’ (SEQ ID NO:4))和生物素修飾的引物P3 (5’-B_TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’ (SEQ ID NO:5))用于PCR擴(kuò)增雙標(biāo)記的雙鏈DNA分子(dsDNA)。上述反應(yīng)產(chǎn)生的dsDNA和鏈霉素包被的磁珠共反應(yīng)lOmin，PBS洗3遍，然后加入0.1M NaOH變性5min，將FITC標(biāo)記的ssDNA和生物素標(biāo)記的ssDNA分開。分離出的帶有FITC的單鏈被分離出來(lái)用于流式檢測(cè)和下一輪的篩選。
體外篩選過(guò)程
200pm隨機(jī)ssDNA文庫(kù)在Hank’ s溶液中95°C變性5min,冰浴IOmin,為了降低非特異性的結(jié)合，在Hank’ s溶液中加入0.lmg/ml鮭精DNA和lmg/ml的BSA，作為結(jié)合緩沖液。然后，隨機(jī)文庫(kù)和2ug靶標(biāo)多肽在200ul結(jié)合緩沖液中于37V反應(yīng)30min，用結(jié)合緩沖液洗3次，以結(jié)合了 ssDNA的磁珠為模板，用標(biāo)記有FITC和生物素的引物擴(kuò)增dsDNA，擴(kuò)增條件為:94°C 40s, 65°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10m，25個(gè)循環(huán)。雙鏈產(chǎn)物經(jīng)磁珠分離后得到富集的單鏈文庫(kù)，用于下一輪篩選。4輪篩選后，用沒有修飾的引物P4:
5’ -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3’ (SEQ ID NO:6)和 P5:
5’ -TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’ (SEQ ID NO:7)擴(kuò)增 dsDNA，TA 克隆，測(cè)序。
流式細(xì)胞分析
用流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選的進(jìn)程，方法:FITC標(biāo)記的單鏈文庫(kù)和靶標(biāo)多肽包被的磁珠在含有10% FBS的結(jié)合緩沖液中于37°C反應(yīng)30min，PBS洗兩遍，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)，未篩選的隨機(jī)文庫(kù)作為對(duì)照；
為了檢測(cè)適配子和靶標(biāo)的特異性結(jié)合，將FITC標(biāo)記的適配子在200ul結(jié)合緩沖液中分別和BSA或29-AA的多肽包被的磁珠于37°C反應(yīng)30min，PBS洗兩遍，用流式細(xì)胞儀分析；
為了檢測(cè)適配子和細(xì)胞的結(jié)合，分別刮取5X IO5的A549、MCF7、！fepG2和L02細(xì)胞，將其和FITC標(biāo)記的適配子在200ul結(jié)合緩沖液中于37°C反應(yīng)30min，PBS洗兩遍，用流式細(xì)胞儀分析
Kd值的測(cè)定:靶標(biāo)多肽包被的磁珠和FITC標(biāo)記的不同濃度的適配子在200ul結(jié)合緩沖液中于37°C反應(yīng)30min，PBS洗兩遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，未篩選的隨機(jī)文庫(kù)作為陰性對(duì)照用于非特異性的結(jié)合，適配子和靶標(biāo)結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度減去隨機(jī)文庫(kù)非特異性結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式Y(jié) = B max X/(Kd+X) (Y:平均熒光強(qiáng)度，X:所用的aptamer的濃度，B是一個(gè)常數(shù)，max是最大值的意思)計(jì)算適配子和祀標(biāo)結(jié)合的Kd值。
熒光光譜分析阿霉素嵌入到適配子中
適配子預(yù)先于95°C孵育5min,冰浴IOmin,取不同量的適配子和3nm阿霉素混勻，適配子和阿霉素的摩爾比例依次為:0.001,0.003,0.005,0.01,0.03,0.1和I。在黑色96孔板中靜置lh，測(cè)量阿霉素的熒光光譜值。Dox的激發(fā)光譜為480nm。發(fā)射光譜為520_700nm。
細(xì)胞攝入實(shí)驗(yàn)
共聚焦顯微鏡檢測(cè):制備A549和HepG2的細(xì)胞爬片，1.5uM dox和適配子-dox (適配子和阿霉素的復(fù)合體)分別和兩種細(xì)胞于37°C反應(yīng)2h，用PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定lOmin, PBS洗3遍，封片，熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。
流式細(xì)胞儀檢測(cè):刮取A549和H印G細(xì)胞，PBS洗兩遍，1.5uM dox和適配子_dox分別和兩種細(xì)胞于37°C反應(yīng)4h，PBS洗兩遍，流式儀檢測(cè)。
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
3uM適配子、dox和適配子-dox分別和A549和H印G2細(xì)胞于37°C孵育4h，PBS洗兩遍，MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。
二、結(jié)果
1、適配子的篩選和特點(diǎn)
DMUCl蛋白的細(xì)胞外肽骨架由空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定一致的可變數(shù)目的重復(fù)序列組成，基本的重復(fù)序列含有20個(gè)氨基酸(TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS(SEQ ID NO:8)。其中，肽段APDTRPAPG(SEQ ID NO:1)是重復(fù)序列中暴露在外的最具有免疫原性的部分，在以往的研究中，被作為祀標(biāo)用于MUCl的適配子的篩選(Ferreira CSM, Matthews CS, MissailidisS(2006)DNA Aptamers ThatBind to MUCl Tumour Marker:Design and Characterizationof MUCl-Binding Single-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.)。在本研究中，也選了這段多肽作為靶標(biāo)來(lái)篩選MUCl蛋白的適配子。在篩選過(guò)程中，將多肽在EDC的作用下共價(jià)連接到UF磁珠(天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心，目錄號(hào):3392)表面，任何與熒光標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)孵育，每輪篩選后，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)篩選文庫(kù)的富集情況。4輪篩選后，和隨機(jī)文庫(kù)相比，所篩文庫(kù)和靶標(biāo)多肽結(jié)合的熒光強(qiáng)度有了顯著的提高(圖1)，說(shuō)明所篩文庫(kù)中富集到了一些和靶標(biāo)多肽結(jié)合的適配子。將所篩文庫(kù)的DNA進(jìn)行克隆，測(cè)序，進(jìn)一步檢測(cè)每個(gè)克隆和多肽的結(jié)合情況，從50個(gè)克隆中篩選出了一個(gè)和多肽結(jié)合最強(qiáng)的適配子(MA3)，其 DNA —級(jí)序列為 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3’ (SEQ ID NO:9)。另外，本發(fā)明還研究了上述序列的變體的MUC l蛋白的特異性結(jié)合能力，所述變體通過(guò)在上述序列的兩端或一段添加部分核苷酸或者改變所述序列中的部分核苷酸而獲得，所述變體保持或基本保持與SEQID NO:9相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而保持了其與MUCl蛋白特異性結(jié)合的能力。上述核苷酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，另外本發(fā)明的上述內(nèi)容中也具體公開了適配子與MUCl蛋白特異性結(jié)合的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以據(jù)此容易地獲得這樣的變體。這樣的變體的例子如下述序列:
5' -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO: 10)，和
5， -AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGCCTATGTCATCGTGGGTGGTTCTGATGTGACATCGGGAACACAGACACACTACACACGCACA-3’ (SEQ ID NO:11)，它們與MUCl蛋白的結(jié)合能力也較強(qiáng)(數(shù)據(jù)略)。
2)特異性是評(píng)價(jià)適配子的一個(gè)重要指標(biāo)，為了驗(yàn)證篩選出來(lái)的適配子是否具備一定的靶標(biāo)特異性，檢測(cè)了其與其他蛋白的結(jié)合情況。因?yàn)榘椎鞍资茄褐泻孔钬S富的蛋白，因此檢測(cè)了適配子與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合。BSA共價(jià)連接到UF磁珠表面，和標(biāo)記有FITC的適配子反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合情況。隨機(jī)庫(kù)DNA (合成的隨機(jī)模板鏈)作為隨機(jī)對(duì)照。流式結(jié)果顯示，MA3和BSA反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度和隨機(jī)對(duì)照一致(圖2b)，而MA3和靶標(biāo)多肽反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度顯著高于隨機(jī)對(duì)照(圖2a)，說(shuō)明MA3和BSA有很弱的交叉反應(yīng)。同時(shí)也用相同的方法將MA3和S2.2在這一方面做了比較，S2.2是文獻(xiàn)報(bào)道的MUCl核酸適配子中親和力最高的一個(gè)(Ferreira CSM, Matthews CS, MissailidisS (2006)DNA Aptamers That Bind to MUCl Tumour Marker:Design and Characterizationof MUCl-Binding Single-Stranded DNA Aptamers.Tumor Biol 27:289-301.FerreiraCS, Cheung MC, Missailidis S, Bisland S, Gariepy J(2009)Phototoxic aptamersselectiveIyenter and kill epithelial cancer celIs.Nucleic Acids Res 37:866-876.)。結(jié)果顯示，S2.2在結(jié)合靶標(biāo)多肽的同時(shí)，也和BSA具有一定的結(jié)合(圖2c和圖2d)，說(shuō)明MA3和BSA的交叉反應(yīng)弱于S2.2。
3)MA3顯示了比較好的靶標(biāo)特異性，然后用流式細(xì)胞儀測(cè)定了它和靶標(biāo)多肽結(jié)合的親和力。不同濃度的FITC標(biāo)記的MA3和靶標(biāo)多肽包被的磁珠孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，用非線性回歸分析測(cè)得MA3和靶標(biāo)多肽的Kd值為38.3±0.6nM(圖3a)。
4)為了進(jìn)一步驗(yàn)證適配子和MUCl結(jié)構(gòu)結(jié)合的可能性，合成了含有整個(gè)基本重復(fù)序列序列的由29個(gè)氨基酸組成的多肽(GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (SEQ ID NO:2))。將多肽連接到磁珠表面，和標(biāo)記有FITC的適配子反應(yīng)，隨機(jī)庫(kù)DNA作為隨機(jī)對(duì)照，流式結(jié)果顯示適配子和29肽反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度仍然顯著高于隨機(jī)對(duì)照(圖3b)，這表明以9肽為靶標(biāo)所篩選到的適配子和含有整個(gè)基本重復(fù)序列的多肽也有較高的結(jié)合。因?yàn)镸UCl蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)由不同數(shù)目的基本重復(fù)序列組成，因此所篩的適配子和MUCl陽(yáng)性細(xì)胞表面的MUCl結(jié)構(gòu)的結(jié)合可能性較大。
5)為了評(píng)估MA3能否和表達(dá)MUCl的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，選取高表達(dá)MUCl的腫瘤細(xì)胞系MCF7和A549以及不表達(dá)MUCl的腫瘤細(xì)胞系H印G2和正常肝上皮細(xì)胞系L02，分別和標(biāo)記有FITC的MA3孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。隨機(jī)庫(kù)DNA作為隨機(jī)對(duì)照。結(jié)果顯示，MA3和MCF7、A549細(xì)胞孵育后的熒光強(qiáng)度明顯高于隨機(jī)對(duì)照(圖4a和圖4b)，而和H印G2、L02細(xì)胞反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度和隨機(jī)對(duì)照一致(圖4c圖4d)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MA3和MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞結(jié)合強(qiáng)，和MUCl陰性細(xì)胞結(jié)合弱，MA3能夠識(shí)別表達(dá)MUCl蛋白的腫瘤細(xì)胞表面的MUCl結(jié)構(gòu)。
2、阿霉素(dox)是很重要的一種治療腫瘤的化療藥物，為了驗(yàn)證篩選出來(lái)的適配子能夠選擇性的攜帶藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞，我們制備了不同配比濃度的適配子-dox復(fù)合體(Bagalkot V, Farokhzad 0C, Langer R, Jon S (2006)An aptamer-doxorubicin physicalconjugate as a novel targeted drug-delivery platform.Angew Chem Int Ed Engl 45:8149-8152.)，熒光光譜分析表明阿霉素嵌入到適配子中(圖5)。單純的dox是通過(guò)細(xì)胞膜的被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不能區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，毒副作用比較大。由于適配子能夠和表達(dá)MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，適配子-dox載藥復(fù)合體應(yīng)該也有可能被表達(dá)MUCl的腫瘤細(xì)胞特異性的攝取。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)了適配子-dox在MUCl陽(yáng)性和陰性腫瘤細(xì)胞中的攝入。設(shè)立Dox和適配子-dox組，分別和MUCl陽(yáng)性的A549以及MUCl陰性的!fepG2細(xì)胞孵育，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)dox的含量。結(jié)果顯示，游離dox在兩種細(xì)胞內(nèi)都有強(qiáng)的熒光，含量都很高，對(duì)兩種細(xì)胞的攝入沒有選擇性(圖6a和圖6b)。與此相反，適配子-dox組中，A549細(xì)胞中熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于IfepG2細(xì)胞(圖6c和圖6d)。這表明適配子-dox在HepG2細(xì)胞中的攝入明顯低于游離dox。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適配子-dox在MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中的攝入多，在MUCl陰 性的腫瘤細(xì)胞中的攝入少，適配子-dox能夠被MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞選擇性地?cái)z取。
為了更進(jìn)一步證明適配子-Dox是否被MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞選擇性地?cái)z取，將游離Dox和適配子-dox復(fù)合體分別和A549、HepG2孵育，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度的變化，流式結(jié)果顯示:對(duì)于MUCl陽(yáng)性細(xì)胞A549，游離Dox組和適配子-dox復(fù)合體組的熒光強(qiáng)度一致，沒有變化(圖6e)。而對(duì)于MUCl陰性細(xì)胞H印G2，適配子-dox組的熒光強(qiáng)度明顯低于游離Dox (圖6f)。上述實(shí)驗(yàn)再次說(shuō)明了適配子-dox在MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中的攝入多，在MUCl陰性細(xì)胞中的攝入少，能夠被MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞選擇性地?cái)z取。總的來(lái)說(shuō)，共聚焦顯微鏡試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀試驗(yàn)說(shuō)明MA3可以作為一個(gè)載體工具靶向性地?cái)y帶Dox到MUCl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。
4)因?yàn)檫m配子-Dox被MUCl陰性細(xì)胞選擇性的攝取減弱，因此有可能造成對(duì)MUCl陰性細(xì)胞的毒性作用減弱。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，設(shè)立適配子組、Dox組和適配子-dox組，分別與A549細(xì)胞、！fepG2細(xì)胞孵育，MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。對(duì)于MUCl陰性的H印G2細(xì)胞，dox組細(xì)胞的存活率為68.71%，而適配子-dox組細(xì)胞存活率為83.28%，顯示適配子-dox對(duì)H印G2細(xì)胞的殺傷顯著低于游離Dox (P < 0.01)(圖7)。然而，對(duì)于MUCl陽(yáng)性的A549細(xì)胞，Dox組中細(xì)胞的存活率為78.09%，適配子_dox組中的存活率為72.68%，顯示適配子-dox對(duì)MUCl陽(yáng)性的A549細(xì)胞的殺傷作用和游離的dox沒有顯著差別(圖8)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適配子-dox能夠減弱Dox對(duì)MUCl陰性細(xì)胞的毒性，而對(duì)MUCl陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷作用沒有變化。另外，單純適配子組中，A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率都接近100%，顯示適配子對(duì)兩種細(xì)胞沒有毒性。
申請(qǐng)人也做了 MA3和其他主要類型的化療藥物結(jié)合形成復(fù)合體及驗(yàn)證該復(fù)合體生物活性的實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)流程與上述實(shí)施例1中的流程相似，結(jié)果表明主要的化療藥物類型，如抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來(lái)霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼均可以有效地與本發(fā)明的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子結(jié)合成為復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)靶向抗腫瘤的效果。
雖然本發(fā)明在上 述具體實(shí)施方案中示例性地列出了實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的精神的情況下，對(duì)本發(fā)明做出大量的修改、修飾。這樣的修改和修飾也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，本發(fā)明的適配子可以和非化療藥物類型的物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體，并進(jìn)而用于特定展示或成像MUCl蛋白陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞及其定位、代謝。本發(fā)明的適配子在與化療藥物或非化療藥物組合使用時(shí)，既可以處于結(jié)合的狀態(tài)，也可以處于簡(jiǎn)單混合(非結(jié)合)的狀態(tài)。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，雖然本發(fā)明僅列出了 MUCl蛋白特異性核酸適配子的具體序列，但該序列的部分堿基可以被去除、替換或者額外的部分堿基(如1-10個(gè)，加于一端或兩端)被加到該序列而仍然保持其與MUCl蛋白的特異性結(jié)合能力，這樣的序列也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。同時(shí)，本發(fā)明的適配子和/或適配子-化療藥物復(fù)合體可以與其他的適配子和/或適配子-化療藥物聯(lián)合使用，從而達(dá)到同時(shí)治療多種腫瘤的目的。
權(quán)利要求
1.一種MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO:9所示，以及其保持與MUCl蛋白特異性結(jié)合能力的長(zhǎng)度介于70-110、優(yōu)選75-100、更優(yōu)選80-90、最優(yōu)選86個(gè)核苷酸的變體，優(yōu)選地，所述變體具有如SEQ ID N0:10或SEQ ID ΝΟ:11所示的序列。
2.一種復(fù)合體，其由如權(quán)利要求1所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物結(jié)合而成或被共同包在納米粒中，優(yōu)選地，MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子的序列如SEQID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11所示，且其中MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物的摩爾比例的范圍為0.001 I，優(yōu)選地，0.003 0.1，更優(yōu)選地，0.005 0.03。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合體，其特征在于所述化療藥物選自阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、米妥蒽醌，優(yōu)選地，所述化療藥物為阿霉素。
4.一種組合物，其活性成分為根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的復(fù)合體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子作為化療藥物靶向載體的用途，優(yōu)選地，所述化療藥物選自抗代謝類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉素C、博來(lái)霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼，更優(yōu)選地，所述化療藥物選自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、順鉬、吉西他濱、雷替曲塞、絲裂霉素、博萊霉素、長(zhǎng)春堿、紫杉醇、羥基喜樹堿、卡鉬、他莫昔芬、來(lái)曲唑、強(qiáng)的松、吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物組成復(fù)合體或者被共同包在納米粒中。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的復(fù)合體或根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中所述腫瘤為腺癌，優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或肝癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述抗腫瘤藥物的劑型為口服劑、肌肉注射劑或靜脈注射劑。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和腫瘤顯影劑的組合物，優(yōu)選地，所述MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和腫瘤顯影劑形成復(fù)合體，優(yōu)選地，所述顯影劑是鐵磁性納米粒或包裹了顯影劑的納米粒，優(yōu)選地，所述組合物中含有一種或多種MUCl蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和/或腫瘤顯影劑。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物在制備腫瘤靶向造影劑中的用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為腺癌，更優(yōu)選地，所述腫瘤選自乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌、前列腺癌、胃腺癌、食道腺癌，最優(yōu)選地，所述腫瘤選自肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或肝癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及MUC1蛋白核酸適配子、復(fù)合體、組合物及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種MUC1蛋白特異性結(jié)合核酸適配子，其序列如SEQ ID NO9所示。本發(fā)明還涉及由所述的MUC1蛋白特異性結(jié)合核酸適配子和化療藥物結(jié)合而成或被共同包在納米粒中而形成的復(fù)合體、包含所述復(fù)合體的組合物及所述核酸適配子、復(fù)合體和組合物的抗腫瘤用途及腫瘤靶向造影用途。
文檔編號(hào)C12N15/115GK103160513SQ201110425169
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者楊先達(dá), 胡燕 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所