專利名稱：利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，還涉及利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾多基因的功能明確后，需要將大量基因聚合導(dǎo)入到栽培作物，以對其綜合農(nóng)藝性狀或多種性狀實(shí)施改良。因此基因大規(guī)模的遺傳轉(zhuǎn)化或大片段DNA的遺傳轉(zhuǎn)化，是植物轉(zhuǎn)基因研究與利用的重要發(fā)展方向之一。目前，實(shí)現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化植物主要通過多基因聚合法，包括多個表達(dá)載體多次轉(zhuǎn)化法、多個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化法、多基因單載體的一次性轉(zhuǎn)化法。多個表達(dá)載體多次轉(zhuǎn)化法是將一次轉(zhuǎn)化的植株作為受體接受二次轉(zhuǎn)化，順序多重轉(zhuǎn)化將外源基因反復(fù)多次地導(dǎo)入同一生物中以達(dá)到目標(biāo)基因的聚合；這種方法雖然不用考慮載體的容量，但是由于轉(zhuǎn)化是進(jìn)行多次獨(dú)立轉(zhuǎn)化，其工作量大、轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性差、 獲得含有多個靶基因的轉(zhuǎn)基因純合系比較困難。多個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化法是將位于不同載體上的多個基因同時(shí)轉(zhuǎn)化到同一植物中，是一步法多基因轉(zhuǎn)化，這種方法降低了工作量，但是實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的共轉(zhuǎn)化效率低。多基因單載體的一次性轉(zhuǎn)化法分為多個基因融合克隆到表達(dá)載體的一個表達(dá)盒上或?qū)⒍鄠€靶基因串聯(lián)在一個載體上；這種方法避免了費(fèi)時(shí)費(fèi)力和共轉(zhuǎn)化頻率低，但是，由于在構(gòu)建多基因單載體大都采用酶切連接的方法，加上的目的基因受酶切位點(diǎn)的限制，使研究者不能按需要連入多個基因，制約了多基因載體的構(gòu)建。因此，急需一種多基因雙元表達(dá)載體，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)入多個基因而連入的多個基因不受酶切位點(diǎn)的限制，具有共轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)。同源重組是低等生物中普遍存在的DNA 重組方式。它不依賴于限制性酶酶切位點(diǎn)，可使兩個DNA分子之間的遺傳信息精確和特異性交換。利用同源重組途徑，是植物基因工程研究早期建立的構(gòu)建共整合Ti載體的一種方法。但是利用多重同源重組途徑、逐步將基因添加進(jìn)雙元表達(dá)載體的T-DNA中，構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，目前尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了解決上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之二在于提供利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法，本發(fā)明的目的之三在于提供多基因雙元表達(dá)載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，從而為實(shí)現(xiàn)多基因遺傳轉(zhuǎn)化提供有力工具，實(shí)現(xiàn)對植物多種性狀實(shí)施改良。本發(fā)明目的之一在于提供利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，所述多基因雙元表達(dá)載體包括T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、大腸桿菌復(fù)制子Cb^V、原核抗性標(biāo)記基因Kan，所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因ζ^ //、原核抗性標(biāo)記基因、至少兩個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述多基因雙元表達(dá)載體由基本雙元載體和同源重組中間載體構(gòu)成，所述基本雙元載體包括T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y、原核抗性標(biāo)記基因◎/ ，所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因/7/7 //、至少一個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述同源重組中間載體包括T-DNA區(qū)、原核抗性標(biāo)記基因和大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y，所述T-DNA區(qū)包括左邊界、原核抗性標(biāo)記基因、至少一個靶基因；所述同源重組中間載體與所述基本雙元載體的所述左邊界、所述原核抗性標(biāo)記基因& 和所述大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y順序串聯(lián)構(gòu)成同源重組片段；所述同源重組中間載體靠近所述大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y的所述靶基因與所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)靠近左邊界一側(cè)的所述靶基因有1. 3-2. 2 1Λ的序列相同構(gòu)成同源重組片段，所述同源重組片段在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組。進(jìn)一步，所述多基因雙元表達(dá)載體所述T-DNA區(qū)由左邊界，真核抗性標(biāo)記基因 /τ/ //，原核抗性標(biāo)記基因 rXetk, PsSym35、PsSynmlO、PsENOD 12a MPsLectin 四個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因/^i//部分ffHPsSy膽10、PsLectin私PsENOD 12a三個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述同源重組中間載體包括基于Amp篩選同源重組中間載體或基于Tc篩選同源重組中間載體，所述基于Amp篩選同源重組中間載體的所述T-DNA區(qū)由所述左邊界、原核抗性標(biāo)記基因基因， PsSym35和PsSynmlO'靶基因順序串聯(lián)；所述基于Tc篩選同源重組中間載體的所述T-DNA 區(qū)的由所述左邊界、真核抗性標(biāo)記基因fl/7i//、原核抗性標(biāo)記基因TetA基因、靶基因順序串聯(lián)。本發(fā)明目的之二在于提供利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，包括以下步驟
a.基于Amp篩選同源重組中間載體
采用限制性內(nèi)切酶切除所述基本雙元載體農(nóng)桿菌復(fù)制子PVSl-REP和右邊界序列，在所述T-DNA區(qū)插入至少一個靶基因和基因，得基于Amp篩選同源重組中間載體；
b.基于Tc篩選同源重組中間載體
采用限制性內(nèi)切酶切除所述基本雙元載體農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP和右邊界序列，在所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)插入TetA基因和至少一個靶基因，得基于Tc篩選同源重組中間載體；
c.構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體
將基本雙元載體轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌，得含有基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌，將步驟a 所得的基于Amp篩選同源重組中間載體轉(zhuǎn)化進(jìn)所得含有基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌中，所述同源重組片段發(fā)生同源重組，得含重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌；將步驟b所得的基于Tc 篩選同源重組中間載體轉(zhuǎn)化所得含重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌，所得重組DNA分子即為多基因雙元表達(dá)載體。進(jìn)一步，所述基本雙元載體按如下步驟制得
(1)克隆豌豆品種食莢大菜豌AZecii/ 基因，連接PMD18-T載體，得PVCT1215載體； 克隆豌豆品種食莢大菜豌/ ^ ^^ 基因，連接PMD18-T載體，得pVCT12^載體；克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接pEasy-T3載體，得pVCT1227載體；
(2)克隆pBIN19載體Pnos:基因，進(jìn)行酶切，同時(shí)酶切pCAMBIA1302載體，將Pnos: :/ /7 //基因與pCAMBIA1302載體酶切片段連接，得pVCT2020載體；
(3)酶切所得PVCT1215載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收；同時(shí)酶切所得pVCT2020 載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；將PVCT1215載體與pVCT2020載體的回收片段連接，得 PVCT2105 載體；
(4)酶切所得pVCT2105載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；同時(shí)酶切所得pVCT12^5 載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，將PVCT2105載體與pVCT12^5載體的回收片段連接， 得PVCT2120載體；
(5)酶切所得pVCT1227載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT1227酶切片段； 同時(shí)酶切PVCT2120載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT2120酶切片段；將回收的 PVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片進(jìn)行連接，得基本雙元載體pVCT2121。進(jìn)一步，步驟a所述基于Amp篩選同源重組中間載體按如下步驟制得
al酶切所得基本雙元載體PVCT2121載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，補(bǔ)平后連接，得 PVCT1210 載體；
a2酶切步驟al所得pVCT1210載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得pVCT1210酶切片段， 所述PVCT1210酶切片段與所述基因連接，得pVCT1220載體；
a3克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接pEasy-T3載體，得pVCT12^載體； 克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接PMD18-T載體，得pVCT1230載體；
a4分別酶切所得pVCT12^載體與pVCT1230載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，連接 PVCT1229載體與pVCT1230載體回收片段，得pVCT1231載體；酶切步驟a2所得pVCT1220載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得PVCT1220酶切片段，同時(shí)酶切所得PVCT1231載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得PVCT1231酶切片段，連接所得PVCT1220酶切片段和pVCT1231酶切片段，得基于Amp篩選同源重組中間載體，命名為pVCT2125。進(jìn)一步，步驟b所述基于Tc篩選同源重組中間載體，包括以下步驟
bl將pCR2. 1-T0P0載體酶切，自環(huán)化連接，得pCR2. Im載體；以pCR2. Im載體為模板， 用如SEQ ID NO :14所示序列為上游引物，如SEQ ID NO :15所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物自環(huán)化連接，得PVCT1191載體；以pVCT1191載體為模板，如SEQ ID NO 16 所示序列為上游引物，如SEQ ID NO :17所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，如SEQ ID NO 16所示序列為上游引物，如SEQ ID NO 18所示序列為下游引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得ηρ //基因，所得ηρ //基因與pMD 18-T載體連接，得pVCT 1202載體；
b2酶切pCAMBIA1302載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pCAMBIA1302載體酶切片段；同時(shí)酶切所得PVCT1202載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得/^i//基因；將 PCAMBIA1302載體酶切片段與職 //基因連接，得pVCT2072載體；酶切所得pVCT2072載體， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；同時(shí)酶切所得PVCT1202載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，連接PVCT2072載體與pVCT1202載體回收片段，得pVCT2102載體；
b3酶切所得pVCT2102載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT2102酶切片段，將所得pVCT2102酶切片段與所述TetA基因連接，得pVCT2U9載體；
b4酶切pUC18載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pUC18載體酶切片段；同時(shí)酶切 PBI121載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pBI121載體酶切片段，將pUC18載體酶切片段與pBI 121載體酶切片段連接，得PVCT2006載體；然后酶切所得pVCT2006載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT2006載體酶切片段；同時(shí)酶切如SEQ ID NO 13所示雙鏈DNA 片段，將PVCT2006載體酶切片段與所得酶切雙鏈DNA片段連接，得pVCT2079載體；
b5酶切所得pVCT2079載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT2079酶切片段，同時(shí)酶切所述PVCT1230載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT1230酶切片段，連接所述pVCT2079酶切片段和所述pVCT1230酶切片段，得pVCT1302載體；
b6酶切步驟沾所得pVCT1302載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT1302酶切片段，同時(shí)酶切步驟b3所得pVCT2U9載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT2U9酶切片段，連接PVCT1302酶切片段和pVCT2U9酶切片段，得基于Tc篩選同源重組中間載體， 命名為pVCT2127。進(jìn)一步，步驟c所述構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，包括以下步驟
將所得基本雙元載體PVCT2121轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌，所述根癌農(nóng)桿菌為EHA105，在含 Rif、Str和Kan的YEB平板上篩選，得含基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105/pVCT2121，將所得同源重組中間載體PVCT2125轉(zhuǎn)化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Mr的 YEB平板上篩選，得含有重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌EHA105/pVCT2U6 ；將所得同源重組中間載體pVCT2127轉(zhuǎn)化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Mr的YEB平板上進(jìn)行篩選，得多基因雙元表達(dá)載體PVCT2U8。進(jìn)一步，所述基因，制備步驟如下以大腸桿菌克隆載體PBR322為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:20所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后Klenow Fragment酶補(bǔ)平，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收1337 bp片段，得基因。進(jìn)一步，所述TetA基因，制備步驟如下以大腸桿菌克隆載體PBR322為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :20所示， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收1470 bp片段， 得TetA基因片段。本發(fā)明目的之三在于提供多基因雙元表達(dá)載體用于植物轉(zhuǎn)基因，所述多基因雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明利用同源重組，通過交替使用氨芐青霉素和四環(huán)素交替篩選，在農(nóng)桿菌中實(shí)現(xiàn)同源重組，順序?qū)⒍鄠€基因串聯(lián)組合，從而使T-DNA持續(xù)延長。由于大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子不能對大分子量載體DNA進(jìn)行復(fù)制，因此，同源重組過程被安排在農(nóng)桿菌中進(jìn)行，并利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的復(fù)制子來確保大分子量質(zhì)?；虼蠓肿恿?T-DNA的合成與構(gòu)建。本發(fā)明公開的多基因雙元表達(dá)載體用于植物遺傳改造中，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)入多個基因，具有共轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標(biāo)和其它優(yōu)點(diǎn)可以通過下面的說明書，權(quán)利要求書，以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)和獲得。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一個借助農(nóng)桿菌將外源基因?qū)胫参锘蚪M的自然過程，由Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)進(jìn)行精確切割、包裝和轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)，最后T-DNA區(qū)隨機(jī)整合進(jìn)植物基因組內(nèi)。雙元表達(dá)載體一般由T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子、大腸桿菌復(fù)制子、原核抗性標(biāo)記基因，其中T-DNA區(qū)有兩個邊界，位于T-DNA左側(cè)邊界為左邊界、位于T-DNA 右側(cè)邊界為右邊界，在左邊界和右邊界之間含有真核抗性標(biāo)記基因和多個靶基因。原核抗性篩選基因、TfeM基因、Kan基因，其中基因編碼的蛋白具有抗氨芐青霉素(Amp)的活性，TetA基因編碼的蛋白質(zhì)具有抗四環(huán)素(Tc)的活性，Kan基因編碼的蛋白質(zhì)具有抗卡那霉素活性(Kan)。真核抗性篩選中抗卡那霉素(Kan)活性的基因稱為 nptll。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為本發(fā)明PVCT1215載體結(jié)構(gòu)圖； 圖2為本發(fā)明pVCT1216載體結(jié)構(gòu)圖； 圖3為本發(fā)明pVCT1227載體結(jié)構(gòu)圖； 圖4為本發(fā)明pVCT1231載體構(gòu)建流程圖； 圖5為本發(fā)明pVCT2020載體構(gòu)建流程圖； 圖6為本發(fā)明pVCT2079載體構(gòu)建流程圖； 圖7為本發(fā)明pVCT2102構(gòu)建流程圖； 圖8為本發(fā)明pVCT2105載體結(jié)構(gòu)圖； 圖9為本發(fā)明pVCT2120載體結(jié)構(gòu)圖； 圖10為本發(fā)明PVCT2121載體結(jié)構(gòu)圖； 圖11為本發(fā)明PVCT1210載體結(jié)構(gòu)圖； 圖12為本發(fā)明PVCT1220載體結(jié)構(gòu)圖； 圖13為本發(fā)明pVCT2125載體結(jié)構(gòu)圖； 圖14為本發(fā)明pVCT2U9載體結(jié)構(gòu)圖； 圖15為本發(fā)明pVCT1302載體結(jié)構(gòu)圖； 圖16為本發(fā)明PVCT2127載體結(jié)構(gòu)圖17為本發(fā)明同源重組的T-DNA拼接及其多基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖； 圖18為本發(fā)明PVCT2U6載體結(jié)構(gòu)圖； 圖19為本發(fā)明pVCT2U8載體結(jié)構(gòu)圖。圖20為本發(fā)明pVCT2U8載體電泳圖(M為DL2000 DNA Marker5A為第1代質(zhì)粒， B為第10代質(zhì)粒)。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1基礎(chǔ)載體的獲得
優(yōu)選實(shí)例中使用的材料.MMXPisum sativum L.)品種食莢大菜豌為材料；大腸桿菌(.Escherichia coli ) 菌株DH5 α，大腸桿菌XLl-Blue，根癌農(nóng)桿菌U^ro力acieriws tumefaciens)菌株EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存；pBI121質(zhì)粒和pCAMBIA1302質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCR2. 1-T0P0 載 #( Invitrogen, US), pEasy-T3 載 #(TransGen,德國)；DNA marker、載體pBR322購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pUC18載體、pMD18_T載體、限制性內(nèi)切酶、Klenow Fragment酶、T4-DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、Prin^tar HS DNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司(Japan) ;Ε· Ζ. N. A. Plasmid Miniprep Kit 禾Π Ε. Ζ. N. Α. Gel Exteaction Kit 購自 Omega 公司(USA)；氨節(jié)青霉素(Ampicilin，Amp)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、四環(huán)素(Tetracycline，！"c)、利福平(Rifampicin，Rif)、鏈霉素 (Streptomycin, Str)、細(xì)菌培養(yǎng)基購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純；引物的合成及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。以下以豌豆凝集素基因PsLec ii/ 、豌豆結(jié)瘤素基因PsENOD 12a、PsSym35和 PsSymlO為靶基因，利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體。(l)pVCT1215 載體構(gòu)建
以豌豆品種食莢大菜豌基因組DNA為模板，根據(jù)已報(bào)道的豌豆凝集素基因，簡、效、PsLectin基因(GenBank accession No. X66368)設(shè)計(jì)弓丨物，上游弓丨物序列為5，-gttaagttctgatgatgtggtgtg-3，(SEQ ID NO 1),下游引物序列為 5‘-ttgccaagaatgggttctattagg-3‘(SEQ ID NO :2)，使用 Prin^tar HS DNA聚合酶，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，55°C退火20秒，72°C延伸2 分20秒，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；得1946 bp飽PsLectin基因片段，所得AZecii/ 片段用Taq DNA聚合酶加A后，與pMDIS-T載體連接，得含豌豆凝集素基因的pMDIS-T載體， 命名為PVCT1215載體，如附圖1所示。其中所基因片段包括啟動子、編碼區(qū)和終止子。(2) pVCT1226 載體構(gòu)建
以豌豆品種食莢大菜豌基因組DNA為模板，根據(jù)已報(bào)道的豌豆早期結(jié)瘤素基因，簡稱/ ^ ^^ 基因(GenBank accession No. X81366)，設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為 5，-caatattgggttatgggtggctgag-3，(SEQ ID NO :3)，下游引物序列為 5’-ggtactagaatgc tttagaaatggatg-3，(SEQ ID NO :4)，使用 Prin^tar HS DNA 聚合酶，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，56°C退火20秒，72°C延伸1分30秒， 30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；得1282 bp大小的、缺失終止子的/ ^ ^^ 基因片段，所得 PsENOD 12a片段，用Taq DNA聚合酶加A，然后與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得含/ ^ ^^ 基因的載體，命名為pVCT12^載體，如附圖2所示。其中所得/ ^ ^^ 基因片段包括啟動子(Pro)和編碼區(qū)(PsENODlh)，不含有終止子。(3) pVCT1227載體構(gòu)建過程
以豌豆品種食莢大菜豌基因組DNA為模板，根據(jù)報(bào)道的豌豆結(jié)瘤素基因，簡攝、PsSymlO基因(GenBank accession No. AJ575250),設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為 5，-ggtcaagtgctagaaatcatcttgg-3，(SEQ ID NO 5),下游引物序列為 5，-gctgacttgcatcaacattttatggg-3，( SEQ ID NO :6)，使用 PrimStar HS DNA 聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，58°C退火20秒，72°C延伸3分30秒，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；得3320 bp大小的豌豆結(jié)瘤素基因片段，所得PsSjmJO片段用Taq DNA聚合酶加A后，與pEasy-T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，場含PsSymlO基因的載體，命名為pVCT1227， 如附圖3所示。其中所得基因片段包括啟動子(Pro)、編碼區(qū)(SymlO)和終止子 (Ter)0(4)pVCT1229
以豌豆品種食莢大菜豌基因組DNA為模板，根據(jù)報(bào)道的豌豆結(jié)瘤素基因上游片段，命名為基因(GenBank accession No. AJ493063)，設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為 5，-catttcctcaagaccaactgtctcgc-3，( SEQ ID NO :7)，下游引物序列為 5' -ccatctcttcccaacaacaaaaccac -3' (SEQ ID NO :8),使用 PrimStar HS DNA 聚合酶， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，60°C退火20 秒，72°C延伸2分鐘20秒，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增出2159 bp飽PsSyin35 up基因片段，所得基因片段用Taq DNA聚合酶加A，然后與pEasy-T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得含 PsSym35up片段的pEasy-T3，命名為pVCT12^載體，如附圖4所示。軌PsSym35up片段包括啟動子(Pro)和上游部分編碼區(qū)序列(￡sSym35p\(5)pVCT1230
以豌豆品種食莢大菜豌基因組DNA為模板，根據(jù)報(bào)道的豌豆結(jié)瘤素基因下游片段，簡稱/ 基因(GenBank accession No. AJ493063)，設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為 5，-ctctcaccttctaatattctctctc-3，( SEQ ID NO :9)，下游引物序列為 5‘-tatctaggaagatggactgctactg-3‘ (SEQ ID NO 10)，使用 I^rin^tar HS DNA聚合酶，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，56°C退火20秒，72°C 延伸3分20秒，30個循環(huán)；72 °C延伸10分鐘。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增出3203 bp的 PsSym35Lp基因片段，W*PsSym35Lp基因片段用Taq DNA聚合酶加A后，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得含基因片段的 PMD18-T，命名為pVCT1230載體，如附圖4所示。其中基因片段包括下游部分編碼區(qū)序列，但沒有終止子(Ter)。PsSym35up基因片段和基因片段構(gòu)成基因的啟動子和編碼區(qū)。(6) pVCT1231載體構(gòu)建過程
所得pVCT12^載體含有基因片段，所得pVCT1230載體含有基因片段，用限制性內(nèi)切酶BstX I和Sal I分別酶切PVCT1229載體和pVCT1230，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，分別回收pVCT12^載體2132bp的片段和pVCT1230載體5583bp的片段，按其摩爾比為3 :1，在T4 DNA連接酶作用下16°C過夜連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp (50 mg/L)的LB平板上篩選，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證，得 PVCT1231載體，如附圖4所示。在載體構(gòu)建過程中PsSym35Lp基因插入基因片段的下游，因此PVCT1231載體中PsSym35up片段和片段構(gòu)成基因，含有啟動子和編碼區(qū)，但無終止子。(7) pVCT2020 載體構(gòu)建
根據(jù)報(bào)道的pBmi9載體序列(GenBank accession U09365)，設(shè)計(jì)含啟動子/iZ7O1S和卡那霉素基因/W//編碼區(qū)(簡稱Pnos: /？辦//基因)的特異引物，上游引物序列為 5' -cggaattcagggagtcacgttatgac-3' ( SEQ ID NO :11)，下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)，下游引物序列為 5，-cgctcgagtcccgctcagaagaac-3，(SEQ ID NO 12)，劃線處為)(ho I 酶切位點(diǎn)，使用I^rin^tar HS DNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒，54°C退火20秒，72°C延伸1分10秒，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，回收片段經(jīng)EcoR I和B10 I酶切后，回收1107 bp片段，得 Pnos: :/ /7 //酶切片段；用EcoR I和Xho I酶消化載體pCAMBIA1302，回收8425 bp片段，得 PCAMBIA1302酶切片段；連接I^nos \nptll酶切片段和pCAMBIA1302酶切片段，得pVCT2020 載體，如附圖5所示。(8) pVCT2079 載體構(gòu)建
用EcoRI/Hindlll同時(shí)雙酶切pUC18載體和pBI121載體，回收pUC18載體2635 bp片段，得pUC18載體酶切片段，回收PBI121載體的含β -葡萄糖苷酸酶基因gus的表達(dá)盒， 得pBI121載體酶切片段，將pUC18載體酶切片段與pBI121載體酶切片段用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得pVCT2006載體。用Ecll36 11/Xba I酶切pVCT2006載體 (Ecll36 II與Me I為同位異裂酶，即識別序列相同)，棄1894 bp片段，電泳回收3773bp 片段，得PVCT2006載體酶切片段；人工合成如SEQ ID NO 13所示雙鏈DNA片段，該DNA片段為138 bp，在3，端含有)(ba I酶切位點(diǎn)，)(ba I酶切人工合成的雙鏈DNA片段，回收131 bp酶切片段，得含)(ba I粘性末端的雙鏈DNA片段；將pVCT2006載體酶切片段與含)(ba I 粘性末端的雙鏈DNA片段用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得pVCT2079載體， 構(gòu)建過程如附圖6所示。(9) pVCT2102 載體構(gòu)建
將pCR2. 1-T0P0載體用EcoR I，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收3913 bp片段，將回收片段T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，Amp和Kan抗性篩選，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得PCR2. Im載體。根據(jù)pCR2. Im載體序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為序列為pCR2. Im F 5，-tcatgaccaaaatccct-3，(SEQ ID NO 14),下游引物序列為 pCR2. Im R 5‘-ttcagaagaactcgtcaagaagg -3，(SEQ ID NO 15);以 pCR2. Im 載體為模板，用 Prin^tar HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件95°C變性2分鐘，1個循環(huán)；95°C變性10秒， 50°C退火20秒，72°C延伸3分鐘，30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，回收四42 bp目的片段，將回收片用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan的LB固體培養(yǎng)基上抗性篩選，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得 PVCT1191載體，pVCT1191載體上pCR2. Im載體的Amp抗性基因得到刪除，并使/？辦//基因末端帶上原核基因終止子，簡稱/ ^//基因，該基因能編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使大腸桿菌具有Kan抗性。根據(jù)pVCT1191載體，設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為pVCT1191 Fl 5' -atactcgagctactgggctatctgg-3' (SEQ ID NO : 16)，劃線處為 Xho I 位點(diǎn)，下游引物序列為pVCT1191 Rl 5'-cattatacgaagttatcctgcaggcggccgcccagggccctggtagctcttgatccg gc-3，(SEQ ID NO 17)，用 Prin^tar HS DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘，95 0C變性10秒，52 0C退火20秒，72 °C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95 °C變性10秒，60°C退火20秒，720C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；擴(kuò)增出 1265 bp大小的職 //基因，將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以SEQ ID Ν0:15所示序列為上游引物，下游引物序列為pVCT1191 R2 5'-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc-3' (SEQ ID NO: 18)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性2分鐘，95°C變性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，3個循環(huán)，再經(jīng)95°C變性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分鐘20秒，27個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收1283 bp 片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆進(jìn)T載體pMD18_T中，得pVCT1202載體。用Bio I酶切pCAMBIA1302載體，棄1094 bp片段，回收9455 bp片段，得 PCAMBIA1302載體骨架；同時(shí)用Β ο I和Ml I酶切pVCT1202載體，棄沈93 bp片段，回收1284 bp片段，得/？辦//基因編碼區(qū)；將pCAMBIA1302載體骨架與/？辦//基因編碼區(qū)用 T4 DNA連接酶連接，得pVCT2072載體。所得pVCT2072載體相當(dāng)于職 //基因編碼區(qū)替換 PCAMBIA1302載體上潮霉素抗性標(biāo)記基因，即構(gòu)建含..nptll·. 表達(dá)盒pVCT2072 載體；所得PVCT2072載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，得到具有卡那霉素抗性的植株，結(jié)果表明2x35S: \nptll·. :T35s基因表達(dá)正常。用PmaC I禾Π Xba I酶切載體pVCT2072，棄413 bp和1124 bp片段，電泳回收 8475bp片段；同時(shí)用Not I酶切所得pVCT1202載體，用Klenow Fragment酶補(bǔ)平后再用)(ba I酶切，棄1250 bp片段，回收2732 bp片段；將回收片段用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得pVCT2102載體，構(gòu)建過程如附圖7所示。本實(shí)施例以豌豆早期結(jié)瘤素基因PsSym35、PsSynmlO、PsENOD 12a和豌豆凝集素基因^Zaiiz7為例，構(gòu)建含有靶基因的基本載體，還可以為其他靶基因，載體也可以為其他雙元植物表達(dá)載體。實(shí)施例2 基本雙元載體構(gòu)建 (l)pVCT2105載體的構(gòu)建
用EcoR I和Hind III酶切載體pVCT1215，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄沈35 bp片段，回收2007 bp片段；用相同的酶酶切pVCT2020載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄51 bp片段，回收 9481 bp片段；將回收片段純化后用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得PVCT2105 載體。如附圖8所示，所得pVCT2105載體含有AZecii/ 靶基因。(2) pVCT2120 載體的構(gòu)建
用PmaC I和Hind III酶切載體所得pVCT2105，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄413 bp和 1118 bp片段，回收9957 bp片段；用Xba I酶切pVCT1226，Klenow Fragment酶補(bǔ)平后，再用Hind III酶切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄沈84 bp片段，回收1297 bp片段；將回收片段純化后用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得PVCT2120載體，如附圖9所示。 所得pVCT2120載體含有Zj1SZecii/ 私PsEN0D12a兩個靶基因，/ ^ ^^ 基因位于pVCT2105 載體的胭脂堿合成酶基因終止子Tnos之前，使不含終止子的/^JVflWA基因表達(dá)能夠終止。(3) pVCT2121 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Mil酶切所得PVCT1227載體，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用 NcoI酶切，棄^66bp片段，回收3395bp大片段，得pVCT1227酶切片段；同時(shí)用136 II(Ecl 136 II與Me I為同位異裂酶，即識別序列相同)和NcoI酶切pVCT2120載體，棄874bp 片段，回收10383bp片段，得pVCT2120酶切片段。將回收的pVCT1227酶切片段和pVCT2120 酶切片段在jM DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，得基本雙元載體PVCT2121，如附圖10所
7J\ οpVCT2121為本實(shí)施例中的基本雙元載體，pVCT2121載體包括T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、STA區(qū)、大腸桿菌復(fù)制子Cb^V、原核抗性標(biāo)記基因◎/ ，其中T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因npt II銀分序V\\、PsSymlO、PsLectin和PsENOD 12a三個靶基因和右邊界所組成；其中左邊界、原核抗性標(biāo)記基因Kan和大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y構(gòu)成同源重組片段，位于T-DNA區(qū)的靠左邊界一側(cè)的基因的部分序列，構(gòu)成另一同源重組片段?；贏mp篩選同源重組中間載體構(gòu)建 (l)pVCT1210載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶AvrII /EheI雙酶切所得基本雙元載體pVCT2121，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，棄9008bp條帶，回收大小為4684bp的片段，得pVCT2121酶切片段，pVCT2121酶切片段用Klenow Fragment酶補(bǔ)平，補(bǔ)平后在T4 DNA連接酶作用下16°C過夜連接，得自環(huán)化載體PVCT1210，如附圖11所示；其中，由原基本雙元載體PVCT2121保留下來的左邊界、原核抗性標(biāo)記基因Kan和大腸桿菌復(fù)制子Cb^V順序串聯(lián)位于T-DNA區(qū)的左邊界外側(cè)序列構(gòu)成同源重組片段，基因的部分序列構(gòu)成另一同源重組片段。⑵Amp基因或TetA基因片段獲得
以大腸桿菌克隆載體PBR322為模板，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶，基因或TfeM 基因(以下簡稱-.AmplTetA基因)特異引物，上游引物為p9 :5，-tttctcgagttggtagctcttgat cc-3，(SEQ ID No :19)，下游引物為 plO :5，-gactcgagcacgatcatgcgcac_3， (SEQ ID No: 20)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性2分鐘；95°C變性10秒，50°C退火15秒， 720C延伸3分鐘，循環(huán)3次；95°C變性10秒，59°C退火15秒，72°C延伸3分，循環(huán)27次； 最后72°C延伸10分鐘，PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳檢測，回收^18bp大小的條帶，得 TetA基因片段。所得Amp/TetA基因片段用限制性內(nèi)切酶BioI/EcoR I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別回收大片段和小片段，其中小片段約1337bp，得基因片段；大片段約為 1470bp，得TfeM基因片段。(3) pVCT1220 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶AseI酶切所得PVCT1210載體，再用Klenow Fragment酶補(bǔ)平，補(bǔ)平后進(jìn)行膠回收，得PVCT1210酶切補(bǔ)平片段。將所得基因片段，用Klenow Fragment酶補(bǔ)平，得Amp基因補(bǔ)平片段，將PVCT1210酶切補(bǔ)平片段與基因補(bǔ)平片段在T4 DNA連接酶作用下連接，16 °C過夜連接，得載體ρVCT1220，如附圖12所示。(4)pVCT2125 的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶》ιοΙ酶切所得pVCT1220質(zhì)粒DNA，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用 NotI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，得pVCT1220片段；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶Sma I/ NotI雙酶切所得含有靶基因的載體pVCT1231，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，得 PVCT1231酶切片段。連接pVCT1220片段和pVCT1231酶切片段，在T4 DNA連接酶作用下 16 V過夜連接，得載體PVCT2125，如附圖13所示。
pVCT2125載體為本發(fā)明實(shí)施例的基于Amp篩選同源重組中間載體，含有T-DNA區(qū)、 原核抗性標(biāo)記基因Kan和大腸桿菌復(fù)制子Cb^V，其中T-DNA區(qū)由左邊界、原核抗性標(biāo)記基因加/7、/^5> ^靶基因和1757bp的/州基因部分片段(S卩/^5> 7 ’)從左至右順序串聯(lián)，但不含有基本雙元載體所含有的農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP和右邊界。PsSymlO，位于 T-DNA區(qū)的右側(cè)，因此同源重組中間載體T-DNA區(qū)的靠右側(cè)與基本雙元載體T-DNA區(qū)靠近左邊界一側(cè)有/^5> 7 ’的1757bp的相同基因序列，構(gòu)成同源重組片段。pVCT2125載體與 PVCT2121載體的左邊界、所述原核抗性標(biāo)記基因&和所述大腸桿菌復(fù)制子Cb^V順序串聯(lián)構(gòu)成含有2338bp相同序列的片段，構(gòu)成另一個同源重組片段。pVCT2125載體與pVCT2121 載體同時(shí)存在于根癌農(nóng)桿菌中時(shí)，將通過兩個同源重組片段介導(dǎo)而發(fā)生同源重組，形成含重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌。本實(shí)施例以pVCT2121載體為基本雙元載體，以AmP基因?yàn)樵丝剐詷?biāo)記基因?yàn)槔倦p元載體還可以為其他雙元載體，抗性基因也可以為其他基本雙元載體上不含有的抗性基因，如氯霉素抗性基因?；赥c篩選同源重組中間載體構(gòu)建 (l)pVCT2129載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶MlI/^boR I雙酶切所得PVCT2102載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收 8503bp大小的片段，得pVCT2102酶切片段，將pVCT2102酶切片段與所得的TetA基因片段用T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)條件為16°C過夜，得PVCT2U9載體，如附圖14所示。(2) pVCT1302 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Hind III酶切所得pVCT2079載體，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用 NheI酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收^59bp的片段，得pVCT2079酶切片段；同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切所得pVCT1230質(zhì)粒DNA，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用限制性內(nèi)切酶^CbaI酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收1333bp的片段，得PVCT1230酶切片段。將回收的pVCT2079酶切片段與pVCT1230酶切片段在T4 DNA連接酶作用下連接，16°C過夜連接， 得PVCT1302載體，如附圖15所示。(3) pVCT2127 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切所得pVCT1302載體，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用 NdeI酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收1874bp的片段，得pVCT1302酶切片段；同時(shí)用限制性內(nèi)切酶BstE II酶切所得pVCT2129載體，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，再用NdeI酶切， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收^37bp的片段，得pVCT2U9酶切片段。將pVCT1302酶切片段和PVCT2U9酶切片段在T4 DNA連接酶作用下連接，16°C過夜連接，得載體pVCT2127，如附圖16所示。載體pVCT2127為本發(fā)明本實(shí)施例的基于Tc篩選同源重組中間載體，含有T-DNA 區(qū)、原核抗性標(biāo)記基因和大腸桿菌復(fù)制子ColEl，其中T-DNA區(qū)由左邊界、真核標(biāo)記基因 npt //、原核抗性標(biāo)記基因TfeM、/^5> J5Z/7’從左至右順序串聯(lián)，但是不含有基本雙元載體所含有的農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSI-REP和右邊界，靶基因PsSym35Lp部分序列(簡稱，) 位于同源重組中間載體T-DNA區(qū)的右側(cè)。T-DNA區(qū)的左邊界、原核抗性標(biāo)記基因和大腸桿菌復(fù)制子的2227bp序列構(gòu)成同源重組片段，1324bp的靶基因/^5> J5Z/7’構(gòu)成另一同源重組片段。
本實(shí)施例以TetA基因?yàn)樵丝剐詷?biāo)記基因，作為同源重組篩選重組載體的標(biāo)記基因，原核抗性標(biāo)記基因還可以為重組子上沒有的其他抗性篩選基因，如氯霉素抗性基因。實(shí)施例3同源重組多基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建
如附圖17所示，將所得基本雙元載體PVCT2121采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，在含Rif (100mg/L), Str (100mg/L)和Kan (50mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上抗性篩選，獲得含有基本雙元載體PVCT2121的農(nóng)桿菌EHA105，命名為EHA105/ pVCT2121。 將基于Amp篩選同源重組中間載體pVCT2125凍融法轉(zhuǎn)化EHA105/ pVCT2121感受態(tài)細(xì)胞， 在含 Kan (50mg/L)、Amp (100mg/L)、Rif (100mg/L)*Mr (100mg/L)的 YEB 固體培養(yǎng)基上篩選，獲得發(fā)生同源重組的含重組DNA分子pVCT2U6的農(nóng)桿菌EHA105，命名為EHA105/ PVCT2U6，pVCT2U6如附圖18所示。pVCT2125載體和pVCT2121載體上的兩個同源重組片段在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組。由于PVCT2125載體上不含有農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP，只有發(fā)生同源重組的重組子才能在含Kan (50mg/L)、Amp (100mg/L)、Rif (100mg/L)和Str (100mg/L)的YEB抗性培養(yǎng)基上生長。將EHA105/ pVCT2U6制備感受態(tài)細(xì)胞，采用凍融法將基于Tc篩選同源重組中間載體PVCT2127轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后將菌液移到含Kan (50mg/L)、Tc (IOOmg/ L)、Rif (100mg/L)和Mr (100mg/L)的YEB抗性平板上篩選，獲得發(fā)生二次同源重組的多基因雙元表達(dá)載體PVCT2U8的農(nóng)桿菌EHA105，命名為EHA105/ pVCT2128, pVCT2128如附圖19所示。同源重組中間載體PVCT2127與pVCT2U6載體具有兩段相同的基因片段構(gòu)成同源重組片段，一段相同片段為由左邊界、原核標(biāo)記基因Kan和大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y構(gòu)成 2227bp的同源重組片段，另一段相同片段為/^5> J5Z/7’靶基因13Mbp構(gòu)成的同源重組片段。同源重組片段在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組，由于PVCT2127載體上不含有農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP，不能在根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制，因此不能在根癌農(nóng)桿菌中遺傳，只有同源重組形成多基因雙元表達(dá)載體PVCT2U8后才能在含Kan (50mg/L)、Tc (100mg/L)、Rif (IOOmg/ L)和Mr (100mg/L)的YEB抗性培養(yǎng)基上生長。所得多基因雙元表達(dá)載體pVCT2U8含有 T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、大腸桿菌復(fù)制子、原核抗性標(biāo)記基因Kan，T-DNA區(qū)包括左邊界、真核抗性標(biāo)記基因職 #、原核抗性標(biāo)記基因TetA以及豌豆凝集素基因AZecii/ 、 早期結(jié)瘤素基因PsSymlO、PsSym35和PsENOD12a四個靶基因。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，利用Amp和Tc交替篩選，能插入更多的靶基因，使T-DNA得到持續(xù)延伸，完成多基因聚合，構(gòu)建含有更多基因的雙元表達(dá)載體，插入基因的數(shù)量以根癌農(nóng)桿菌復(fù)制子PVSl-REP的復(fù)制極限為度(pVSl-REP的復(fù)制極限為200 kb左右)。在最后一次同源重組時(shí)，不使用^^基因作為原核抗性標(biāo)記基因，而使用四環(huán)素抗性基因Tfei兒且要加入/？辦IlJiptllipat等抗性基因作為真核標(biāo)記基因，整合進(jìn)植物后用于對轉(zhuǎn)基因植株的篩選。將本發(fā)明構(gòu)建的帶有豌豆凝集素基因AZ^ii/ 和早期結(jié)瘤素基因隊(duì) PsSym35熱PsENOD12a以及/ ^-/ ^//卡那霉素抗性基因和TfeM四環(huán)素抗性基因等多基因雙元表達(dá)載體PVCT2U8，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆，培育能同時(shí)被大豆根瘤菌和豌豆根瘤菌侵染形成根瘤的、固氮性能得到改善的轉(zhuǎn)基因大豆新材料。本實(shí)施例同源重組以農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化大豆為例，也可以為農(nóng)桿菌的其他株系，如LBA4404等，轉(zhuǎn)化受體也可以根據(jù)研究選擇不同植物作為受體，如煙草、擬南芥等。實(shí)施例4多基因雙元表達(dá)載體的遺傳穩(wěn)定性
將 EHA105/ pVCT2128 接種于 5mL 含 Rif (100mg/L)、Str (100mg/L)禾口 kan (50mg/ L)、Tc (100mg/L)的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、225 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)后的菌液為第一代。取第一代的菌液1 μ L接種于5mL新鮮的與上述相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二代菌液的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。依次培養(yǎng)10代，分別用1. 5 mL Eppendorf管收集第1 代和第10代的菌體。對收集的菌提取質(zhì)粒DNA，電泳檢測所提取pVCT2U8質(zhì)粒DNA，檢測結(jié)果如附圖20所示。結(jié)果表明第1代和第10代菌體提取的pVCT2U8質(zhì)粒DNA，條帶大小一致，說明PVCT2U8載體能在根癌農(nóng)桿菌EHA105中穩(wěn)定遺傳。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，其特征在于所述多基因雙元表達(dá)載體包括T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y、原核抗性標(biāo)記基因Kan，所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因/7/7 //、原核抗性標(biāo)記基因、至少兩個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述多基因雙元表達(dá)載體由基本雙元載體和同源重組中間載體構(gòu)成，所述基本雙元載體包括T-DNA區(qū)、農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP、大腸桿菌復(fù)制子Cb^V、原核抗性標(biāo)記基因仏/7，所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因/7/7 //、至少一個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述同源重組中間載體包括T-DNA區(qū)、原核抗性標(biāo)記基因和大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y，所述T-DNA區(qū)包括左邊界、原核抗性標(biāo)記基因、至少一個靶基因；所述同源重組中間載體與所述基本雙元載體的所述左邊界、所述原核抗性標(biāo)記基因& 和所述大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y順序串聯(lián)構(gòu)成同源重組片段；所述同源重組中間載體靠近所述大腸桿菌復(fù)制子Cb^Y的所述靶基因與所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)靠近左邊界一側(cè)的所述靶基因有 1. 3-2. 2 kb的序列相同構(gòu)成同源重組片段，所述同源重組片段在根癌農(nóng)桿菌中發(fā)生同源重組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，其特征在于所述多基因雙元表達(dá)載體所述T-DNA區(qū)由左邊界，真核抗性標(biāo)記基因/7/7 //，原核抗性標(biāo)記基因 TetA ,PsSym35,PsSynmlO,PsLectin和PsENOD 12a四個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)由左邊界、真核抗性標(biāo)記基因職 //部分序列、PsLectin 私PsENOD12a三個靶基因和右邊界順序串聯(lián)；所述同源重組中間載體包括基于Amp篩選同源重組中間載體或基于Tc篩選同源重組中間載體，所述基于Amp篩選同源重組中間載體的所述T-DNA區(qū)由所述左邊界、原核抗性標(biāo)記基因加/7 -,PsSyna^和PsSynmlO’靶基因順序串聯(lián)；所述基于Tc篩選同源重組中間載體的所述T-DNA區(qū)的由所述左邊界、真核抗性標(biāo)記基因職 //、原核抗性標(biāo)記基因TetA基因、靶基因順序串聯(lián)。
3.權(quán)利要求1所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于，包括以下步驟a.基于Amp篩選同源重組中間載體采用限制性內(nèi)切酶切除所述基本雙元載體農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP和右邊界序列，在所述T-DNA區(qū)插入基因和至少一個靶基因，得基于Amp篩選同源重組中間載體；b.基于Tc篩選同源重組中間載體采用限制性內(nèi)切酶切除所述基本雙元載體農(nóng)桿菌復(fù)制子pVSl-REP和右邊界序列，在所述基本雙元載體所述T-DNA區(qū)插入TetA基因和至少一個靶基因，得基于Tc篩選同源重組中間載體；c.構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體將基本雙元載體轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌，得含有基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌，將步驟a 所得的基于Amp篩選同源重組中間載體轉(zhuǎn)化進(jìn)所得含有基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌中，所述同源重組片段發(fā)生同源重組，得含重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌；將步驟b所得的基于Tc 篩選同源重組中間載體轉(zhuǎn)化所得含重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌，所得重組DNA分子即為多基因雙元表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于， 所述基本雙元載體按如下步驟制得(1)克隆豌豆品種食莢大菜豌AZecii/ 基因，連接pMD18-T載體，得pVCT1215載體； 克隆豌豆品種食莢大菜豌/ ^ ^^ 基因，連接PMD18-T載體，得pVCT12^載體；克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接pEasy-T3載體，得pVCT1227載體；(2)克隆pBIN19載體Pnos:基因，進(jìn)行酶切，同時(shí)酶切pCAMBIA1302載體，將 Pnos: :/ /7 //基因與pCAMBIA1302載體酶切片段連接，得pVCT2020載體；(3)酶切步驟(1)所得pVCT1215載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收；同時(shí)酶切步驟(2) 所得pVCT2020載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；將PVCT1215載體與pVCT2020載體的回收片段連接，得PVCT2105載體；(4)酶切步驟(3)所得pVCT2105載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；同時(shí)酶切步驟 (1)所得pVCT12^載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，將PVCT2105載體與pVCT12^載體的回收片段連接，得PVCT2120載體；(5)酶切步驟(1)所得PVCT1227載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT1227酶切片段；同時(shí)酶切步驟(4)所得pVCT2120載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT2120 酶切片段；將回收的PVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片進(jìn)行連接，得基本雙元載體 PVCT2121。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于， 步驟a所述基于Amp篩選同源重組中間載體按如下步驟制得al酶切所得基本雙元載體PVCT2121載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，補(bǔ)平后連接，得 PVCT1210 載體；a2酶切步驟al所得pVCT1210載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得pVCT1210酶切片段，所述PVCT1210酶切片段與所述基因連接，得pVCT1220載體；a3克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接pEasy-T3載體，得pVCT12^載體； 克隆豌豆品種食莢大菜豌基因，連接PMD18-T載體，得pVCT1230載體；a4分別酶切步驟a3所得pVCT12^載體與pVCT1230載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，連接pVCT12^載體與pVCT1230載體回收片段，得pVCT1231載體；酶切步驟a2所得 PVCT1220載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得PVCT1220酶切片段，同時(shí)酶切所得pVCT1231 載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得PVCT1231酶切片段，連接所得PVCT1220酶切片段和 PVCT1231酶切片段，得基于Amp篩選同源重組中間載體，命名為pVCT2125。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于 步驟b所述基于Tc篩選同源重組中間載體，包括以下步驟bl將pCR2. 1-T0P0載體酶切，自環(huán)化連接，得pCR2. Im載體；以pCR2. Im載體為模板， 用如SEQ ID NO :14所示序列為上游引物，如SEQ ID NO 15所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物自環(huán)化連接，得PVCT1191載體；以pVCT1191載體為模板，如SEQ ID NO 16 所示序列為上游引物，如SEQ ID NO :17所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，如SEQ ID NO :16所示序列為上游引物，如SEQ ID NO :18所示序列為下游引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得ηρ //基因，所得ηρ //基因與pMD 18-T載體連接，得pVCT 1202載體；b2酶切pCAMBIA1302載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pCAMBIA1302載體酶切片段；同時(shí)酶切步驟bl所得pVCT1202載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得/^i//基因； 將pCAMBIA1302載體酶切片段與職 //基因連接，得pVCT2072載體；酶切所得pVCT2072載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收；同時(shí)酶切所得PVCT1202載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，連接PVCT2072載體與pVCT1202載體回收片段，得pVCT2102載體；b3酶切所得pVCT2102載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT2102酶切片段，將所得pVCT2102酶切片段與所述TetA基因連接，得pVCT2U9載體；b4酶切pUC18載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pUC18載體酶切片段；同時(shí)酶切 PBI121載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pBI121載體酶切片段，將pUC18載體酶切片段與pBI 121載體酶切片段連接，得PVCT2006載體；然后酶切所得pVCT2006載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT2006載體酶切片段；同時(shí)酶切如SEQ ID NO 13所示雙鏈DNA 片段，將PVCT2006載體酶切片段與所得酶切雙鏈DNA片段連接，得pVCT2079載體；b5酶切步驟b4所得pVCT2079載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT2079酶切片段，同時(shí)酶切步驟a3所得pVCT1230載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT1230酶切片段，連接所述PVCT2079酶切片段和所述PVCT1230酶切片段，得pVCT1302載體；b6酶切步驟沾所得pVCT1302載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pVCT1302酶切片段，同時(shí)酶切步驟b3所得pVCT2U9載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PVCT2U9酶切片段，連接PVCT1302酶切片段和pVCT2U9酶切片段，得基于Tc篩選同源重組中間載體， 命名為pVCT2127。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于， 步驟c所述構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，包括以下步驟將所得基本雙元載體PVCT2121轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌，所述根癌農(nóng)桿菌為EHA105，在含 Rif、Str和Kan的YEB平板上篩選，得含基本雙元載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105/pVCT2121，將所得同源重組中間載體PVCT2125轉(zhuǎn)化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Mr的 YEB平板上篩選，得含有重組DNA分子的根癌農(nóng)桿菌EHA105/pVCT2U6 ；將所得同源重組中間載體pVCT2127轉(zhuǎn)化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Mr的YEB平板上進(jìn)行篩選，得多基因雙元表達(dá)載體PVCT2U8。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于， 所述基因，制備步驟如下以大腸桿菌克隆載體PBR322為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO 19所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO 20所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后Klenow Fragment酶補(bǔ)平，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收1337 bp 片段，得基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體的方法，其特征在于， 所述TfeM基因，制備步驟如下以大腸桿菌克隆載體PBR322為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :20所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收1470 bp片段，得TetA基因片段。
10.權(quán)利要求1所述多基因雙元表達(dá)載體用于植物轉(zhuǎn)基因，其特征在于所述多基因雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及利用同源重組構(gòu)建多基因雙元表達(dá)載體，所述多基因雙元表達(dá)載體通過多克隆酶切位點(diǎn)，將單個基因或多個基因連成多基因聚合體形成同源重組中間載體，然后通過同源重組將單個基因或多基因聚合體加進(jìn)基本雙元載體中，所述同源重組可以多次進(jìn)行，使基本雙元載體的T-DNA的長度逐步加大，構(gòu)成含有多基因的雙元表達(dá)載體；本發(fā)明還公開了多基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建方法以及在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用，本發(fā)明公開的多基因雙元表達(dá)載體用于植物遺傳改造中，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)入多個靶基因，具有共轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/66GK102329812SQ20111028113
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者萬發(fā)香, 張興國, 杜小兵, 蘇承剛, 謝玉會, 錢春, 陳友龍 申請人:西南大學(xué)