專利名稱：戴氏綠僵菌gyya0601菌株用于產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種戴氏綠僵菌GYYA0601菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途以及發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)又名玻璃酸,具有高度的保水、潤膚及抗菌入侵的保護(hù)作用而廣泛用作化妝品的添加劑。HA作為一種生化藥物，主要用于治療關(guān)節(jié)炎、眼科粘性手術(shù)、軟組織修復(fù)以及外科手術(shù)后的粘性抑制劑等。HA是由D-葡糖醛酸和乙酰氨基-D-葡萄糖按1:1的摩爾比組成的、平均分子量一般為50萬 500萬的酸性粘多糖。 在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)壁，在HA合成酶作用下，HA由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)兩前提物合成。HA無種屬差異性，無論何種來源，其結(jié)構(gòu)和組成都是一樣的，僅存在相對分子質(zhì)量的差別。通常，以葡糖醛酸含量表示HA的純度， 化妝品級為中等分子量HA分子，含35% 45%的葡糖醛酸，醫(yī)藥級為高分子量HA分子，含 42% 48%的葡糖醛酸。
上世紀(jì)30年代，美國Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出HA。70年代，Balazs等從雞冠和人臍帶提取HA，并配制成眼科手術(shù)用黏彈性輔助劑NIF-HA，開創(chuàng)了 HA醫(yī)學(xué)應(yīng)用的先河。80年代，日本首先借鑒前人對某些鏈球菌產(chǎn)生HA這一重要發(fā)現(xiàn)，通過工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn) HA。當(dāng)前，HA的生產(chǎn)仍然主要是動物組織提取法和細(xì)菌發(fā)酵法。動物組織提取法的原料受限、產(chǎn)量低、分離純化過程復(fù)雜(含硫酸軟骨素、硫酸葡胺聚糖等多糖雜質(zhì))，生產(chǎn)成本高， 所獲得的HA分子量也較小，不能滿足市場需求。而細(xì)菌發(fā)酵法具有生產(chǎn)規(guī)模不受動物原料限制，發(fā)酵液中HA以游離狀態(tài)存在，易于分離純化，成本低，易于形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，無動物來源的致病病毒污染的危險等優(yōu)點(diǎn)。
細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)使用的菌種主要?dú)w屬于鏈球菌Streptococcus sp·,它有血清 A型和C型，A型為人致病菌， C型為動物致病菌。目前生產(chǎn)菌種多為C型獸疫鏈球菌 S. zoo印idemicu。盡管細(xì)菌發(fā)酵具有動物組織提取無可比擬的優(yōu)勢，但鏈球菌發(fā)酵尚存不足其一，鏈球菌多為病原菌或機(jī)會病原菌，發(fā)酵生產(chǎn)存在潛在危害；其二，鏈球菌的營養(yǎng)需求較高，大規(guī)模生產(chǎn)中用這些特殊成分作為培養(yǎng)基，成本太高。其三，HA發(fā)酵下游分離純化時，需要?dú)绾统グl(fā)酵液中的菌體，殺滅菌體常采用殺菌劑或高溫處理，這將影響HA 的分子構(gòu)象和流變學(xué)特性。其四，因發(fā)酵液的黏度很高，直接過濾或離心除菌體非常困難， 需要先進(jìn)行稀釋，再除去菌體，因此，發(fā)酵下游分離技術(shù)煩瑣，增加成本。另外，鏈球菌是原核生物，兼性厭氧菌，不利于葡萄糖能量代謝轉(zhuǎn)化更多的ATP，從而影響UTP合成及其相應(yīng)合成HA的兩前提物UDP-GlcNAc、UDP-GlCA的生成。因此，尋找新的生產(chǎn)菌種有較高的科學(xué)價值和現(xiàn)實(shí)意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服當(dāng)前生產(chǎn)透明質(zhì)酸方法的不足，提供一種真菌戴氏綠僵菌GYYA0601菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途以及透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供了戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601 菌株 CGMCC NO. 2880 用于發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途。戴氏綠僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株是發(fā)明人在貴州省貴陽市羊艾茶場土壤中采集一種蟲草，利用多途徑多批次和次生子囊孢子微循環(huán)產(chǎn)孢方法(參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷)蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.)分離培養(yǎng)獲得二十余株菌株，所采的蟲草和分離獲得的菌株經(jīng)鑒定為戴氏蟲草Cordyceps taii和戴氏綠僵菌Metarhizium taii。GYYA0601菌株已于2009年I月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 2880，分類命名為戴氏綠僵菌，拉丁文學(xué)名為 Metarhizium taii。
本發(fā)明還提供了透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，以戴氏綠僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株CGMCC NO. 2880為菌種采用如下發(fā)酵方法制備透明質(zhì)酸
(I)菌種活化將菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上活化；
(2)搖瓶種子制備挑取菌絲塊到種子培養(yǎng)液中，26 30°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min 培養(yǎng)3 5天；
(3)發(fā)酵接種搖瓶種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 30°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min培養(yǎng) 7 10天，終止發(fā)酵，去除菌絲體，獲得含透明質(zhì)酸的發(fā)酵液；
(4)分離調(diào)整發(fā)酵液的pH值為8.0，加入胰蛋白酶在30 35°C酶解3 5小時， 調(diào)整pH至6. 8 7. 2，加入乙醇攪拌后收集沉淀，將沉淀溶于去離子水，濾過，濾液加入乙醇攪拌，靜置收集沉淀，用無水乙醇洗滌后再用丙酮洗滌，真空干燥，得透明質(zhì)酸。
進(jìn)一步的，上述發(fā)酵生產(chǎn)方法中，步驟(4)所述分離為調(diào)整I體積倍發(fā)酵液的pH 值為8. 0，按O. 05g/100ml發(fā)酵液的比例加入胰蛋白酶，在30 35°C酶解3 5小時，調(diào)整 pH至6. 8 7. 2，加入3 5體積倍的無水乙醇攪拌后收集沉淀，將沉淀溶于I體積倍的去離子水，濾過，濾液加入2 4體積倍無水乙醇攪拌，靜置收集沉淀，用無水乙醇洗滌后再用丙酮洗滌，60°C真空干燥，得透明質(zhì)酸。
前述生產(chǎn)方法中，采用普通的培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量可達(dá) 31. 3 μ g/mL,而采用如下優(yōu)選的培養(yǎng)基，發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量可達(dá)90. O μ g/mL,優(yōu)選培養(yǎng)基具體為
步驟(I)中所述斜面菌種培養(yǎng)基為蔗糖25g/L、黃豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨 2g/L、麥麩 3g/L、KH2PO4 lg/L、MgS04 O. 5g/L、瓊脂 18g/L、pH 6.0。步驟(2)中所述種子培養(yǎng)液為蔗糖 15g/L、蛋白胨 4g/L、酵母膏 2g/L、麥麩 5g/L、KH2PO4 lg/L，MgSO4O. 5g/L、pH 6.0。步驟(3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基為甘露糖15 30g，牛肉蛋白胨3 9g，酵母膏O. 5 2g,磷酸二氫鉀O. 5 2. Og,碳酸氫鈉O. 5 L 5g,初始pH 5 8,蒸懼水1L。
上述的各種培養(yǎng)基也是發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)而優(yōu)選出來的乳糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、糖蜜、甘露糖、葡萄糖等可用作GYYA0601菌株發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的碳源，并優(yōu)選使用甘露糖；黃豆?jié){、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、魚蛋白胨、胰蛋白胨、 酪蛋白胨、牛肉膏、硝酸鈉、草酸銨、(NH4)H2PO4、蠶蛹粉可用作GYYA0601菌株發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的氮源，并優(yōu)選牛肉蛋白胨；FeS04、Fe2(SO4)3^ CaCl2, KC1、碳酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、ZnSO4, ZnCl2可用作GYYA0601菌株發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的無機(jī)鹽，并優(yōu)選碳酸氫鈉；酸堿度 pH5 8可用作GYYA0601菌株發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的初始發(fā)酵微環(huán)境，并優(yōu)選pH8。最終確定每I升培養(yǎng)基包括甘露糖15 30g，牛肉蛋白胨3 9g，酵母膏O. 5 2g，磷酸二氫鉀 O. 5 2. Og,碳酸氧納 O. 5 1. 5g,初始酸喊度 pH5 8。Metarhizium taii GYYA0601 菌株在搖床轉(zhuǎn)速150 200r/min，26 30°C培養(yǎng)7 10天，采用硫酸咔唑法測定其發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量可達(dá)90. O μ g/mL。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用絲狀真菌戴氏綠僵菌Metarhizium taiiGYYA0601 菌株CGMCC NO. 2880來發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，不僅可以在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，也可很方便實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，絲狀真菌相比鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)首先絲狀真菌是一種食藥用菌，無致病性，不產(chǎn)溶血素，生物安全性高；其次絲狀真菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，生產(chǎn)成本低；第三，發(fā)酵液無需特殊處理，分離工藝簡單、方便，制備透明質(zhì)酸的費(fèi)用低，戴氏綠僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量可達(dá) 90.O μ g/mL。


·
本發(fā)明的戴氏綠僵菌(Metarhizium taii)已于2009年I月16號保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo. 2880。
圖1為透明質(zhì)酸紅外光譜圖，A為透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品；B為戴氏綠僵菌GYYA0601 菌株發(fā)酵生產(chǎn)的樣品。
具體實(shí)施方式
在貴州省貴陽市羊艾茶場采集到一種蟲草，置于無菌試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室按以下兩種方法分離和培養(yǎng)。
方法一根據(jù)組織分離法(方中達(dá)，植物病原研究法(第3版).北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1998)，將采集到的蟲草用水清洗表面泥污，陰干，分別用無菌小刀把菌核和子實(shí)體切開，從中用無菌接種針挑取小塊組織，70%酒精或O.1 %升汞液消毒，無菌蒸餾水清洗2-3 次后置入PDA培養(yǎng)基平板，25-28°C培養(yǎng)2_4天，挑取單菌落，即獲得純培養(yǎng)GYYA0601菌株 CGMCC No. 2880。置于斜面菌種培養(yǎng)基(蔗糖25g/L、黃豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、 麥麩 3g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4O. 5g/L、瓊脂 18g/L、pH6.0，蒸餾水 1L)上備用。
方法二、根據(jù)次生子囊孢子微循環(huán)法分離(參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷) 蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.)。表面消毒蟲草，讓其子實(shí)體中的子囊自動彈射子囊孢子到PDA培養(yǎng)基平板中，25-28°C培養(yǎng)2_4天，挑取單菌落，即獲得純培養(yǎng)菌株。從6根蟲草中一共分離到21株純培養(yǎng)GYYA0601菌株CGMCCNo. 2880，置于斜面菌種培養(yǎng)基(蔗糖25g/ L、黃豆 3g/L、酵母膏 5g/L、蛋白胨 2g/L、麥麩 3g/L、KH2PO4lg/L, MgSO4O. 5g/L、瓊脂 18g/L、 PH6.0，蒸餾水1L)上備用。
所述GYYA0601菌株CGMCC No. 2880具有如下的微生物學(xué)特征
1、形態(tài)學(xué)特性
(I)無性世代菌絲有隔無色至暗色，平展。菌落中央白色，外圍產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形成明顯的8 10條墨綠色環(huán)帶。分生孢子瓶梗(8. O 22. 5 μ mXO. 9 1. 8 μ m)近柱形，具短尖，單生于氣生菌絲或緊密地輪生于分生孢子?；蛟抗Ｉ希部赏ㄟ^微循環(huán)產(chǎn)孢直接從次生子囊孢子上產(chǎn)生。分生孢子(3. 9 13.1 μ mX 2. 4 3.2 μ m)多串生，柱狀，中部稍縊縮，兩端圓或一端稍細(xì)，未見雙生孢子。由次生子囊孢子微循環(huán)產(chǎn)孢形成的分生孢子，形狀大小基本與前者相同。
(2)有性世代戴氏綠僵菌GYYA0601菌株是戴氏蟲草Cordyaps taii (參見梁宗琦.中國真菌志(第23卷)蟲草屬.北京科學(xué)出版社，2007.)。
2、培養(yǎng)性狀
(I)查氏(Czapek Dox)培養(yǎng)基,28°C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直徑分別為O. 98cm、1. 70cm、2. 50cm、3. 05cm、3. 80cm、4. 45cm, 13天時的菌落中央部分為黃綠色，微隆起，周邊大部分(4/5面積)為墨綠至草綠色產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子，粒狀，環(huán)帶不明顯， 菌落邊緣菌絲乳白至淡乳黃，絨狀，平展。背面中央近芥黃，邊緣乳白色。
(2)PDA培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直徑分別為1. 21cm、2. 15cm、3. 10cm、4. 25cm、5. 35cm、5. 78cm, 13 天時的菌落有 8 10 條鮮明的墨綠色產(chǎn)孢環(huán)帶，粒狀，最外層環(huán)帶為淡黃綠至乳黃色，菌落邊緣，由里朝外菌絲層絨狀、平展，乳黃至乳白色，最邊緣的菌落成白色蠟狀平展。背面中央色深，深黃褐至芥黃。
(3)沙氏(Sabouraud’s)培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直徑分別為1. 21cm、2. 03cm、3. 13cm、3. 85cm、4. 45cm、5. 25cm, 13 天時的菌落平展，有 5 6 條不同顏色的產(chǎn)孢環(huán)帶，中央白色，近中央微隆起，米黃至黃綠色，周圍是草綠粒狀物環(huán)帶， 然后是土黃、棕黃和黃綠的粒狀物環(huán)帶相間，產(chǎn)孢環(huán)帶外圍乳白至乳黃絨狀菌絲層，最外緣對光看有蠟狀暈圈。菌落平板背面芥黃，中央皺縮。
3、生理特性
Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)產(chǎn)孢能力強(qiáng)，培養(yǎng)5-7天后均能產(chǎn)生大量孢子，且無 需特殊培養(yǎng)基。
4、代謝特性
Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)能代謝生成具廣譜抗生活性的抗生素。
實(shí)施例1 :采用上述菌株制備透明質(zhì)酸
Metarhizium taii GYYA0601 菌株 CGMCC No. 2880 移植到斜面菌種培養(yǎng)基(蔗糖 25g/L、黃豆 3g/L、酵母膏 5g/L、蛋白胨 2g/L、麥麩 3g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 O. 5g/L、瓊脂18g/L、pH 6. O)上，24 28°C培養(yǎng)7 15天，接著挑取菌絲塊到搖瓶種子培養(yǎng)液(蔗糖 15g/L、蛋白胨 4g/L、酵母膏 2g/L、麥麩 5g/L、KH2P04lg/L，MgSO4O. 5g/L、pH 6. O)中，26 30°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min培養(yǎng)3 5天，按3 5 %的體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(甘露糖15 30g,牛肉蛋白胨3 9g,酵母膏O. 5 2g,磷酸二氫鉀O. 5 2. Og,碳酸氫鈉 O. 5 1. 5g，初始pH5 8，蒸餾水1L)中，搖床轉(zhuǎn)速150 200r/min，26_30°C培養(yǎng)7 10 天，終止發(fā)酵，抽濾去除菌絲體，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液中含有透明質(zhì)酸。采用硫酸咔唑法測定 GYYA0601菌株CGMCC No. 2880發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量為90. O μ g/mL。
透明質(zhì)酸的分離制備調(diào)整I體積倍發(fā)酵液的pH值為8. O,按O. 05g/100ml發(fā)酵液的比例加入胰蛋白酶，在30 35°C酶解3 5小時，調(diào)整pH至6. 8 7. 2，加入3 5 體積倍的乙醇攪拌后收集沉淀，將沉淀溶于I體積倍的去離子水，采用50000Da透析袋去離子水透析或者超濾膜進(jìn)行超濾，透析袋內(nèi)液或?yàn)V液加入2 4體積 倍乙醇攪拌，靜置收集沉淀，用無水乙醇洗滌2次，再用丙酮洗滌I次，真空干燥，得透明質(zhì)酸。所得透明質(zhì)酸能被透明質(zhì)酸酶水解，其光譜學(xué)特征與透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品一致(見圖1)。
權(quán)利要求
1.戴氏綠僵菌JfeiarAiziwstail GYYA0601菌株CGMCC NO. 2880用于發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途。
2.透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法,其特征在于以戴氏綠僵菌tailGYYA0601 菌株CGMCC NO. 2880為菌種采用如下發(fā)酵方法制備透明質(zhì)酸(1)菌種活化將菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上活化；(2)搖瓶種子制備挑取菌絲塊到種子培養(yǎng)液中，26 30°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min培養(yǎng)3 5天；(3)發(fā)酵接種搖瓶種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26 30°C、轉(zhuǎn)速150 200r/min培養(yǎng)7 10天，終止發(fā)酵，去除菌絲體，獲得含透明質(zhì)酸的發(fā)酵液；(4)分離調(diào)整發(fā)酵液的pH值為8.O，加入胰蛋白酶在30 35°C酶解3 5小時，調(diào)整pH至6. 8 7. 2，加入乙醇攪拌后收集沉淀，將沉淀溶于去離子水，濾過，濾液加入乙醇攪拌，靜置收集沉淀，用無水乙醇洗滌后再用丙酮洗滌，真空干燥，得透明質(zhì)酸。
3.按照權(quán)利要求2所述透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(4)所述分離為 調(diào)整I體積倍發(fā)酵液的PH值為8. 0，按O. 05g/100ml發(fā)酵液的比例加入胰蛋白酶，在30 35°C酶解3 5小時，調(diào)整pH至6. 8 7. 2，加入3 5體積倍的無水乙醇攪拌后收集沉淀,將沉淀溶于I體積倍的去離子水,濾過,濾液加入2 4體積倍無水乙醇攪拌，靜置收集沉淀，用無水乙醇洗滌后再用丙酮洗滌，60°C真空干燥，得透明質(zhì)酸。
4.按照權(quán)利要求2所述透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中所述斜面菌種培養(yǎng)基為蔗糖25g/L、黃豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麥麩3g/L、KH2PO4 lg/L、 MgSO4 O. 5g/L、瓊脂 18g/L、pH 6. O。
5.按照權(quán)利要求2所述透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)中所述種子培養(yǎng)液為蔗糖 15g/L、蛋白胨 4g/L、酵母膏 2g/L、麥麩 5g/L、KH2PO4 lg/L, MgSO4O. 5g/L、pH 6· O。
6.按照權(quán)利要求2所述透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基為甘露糖15 30g，牛肉蛋白胨3 9g，酵母膏O. 5 2g，磷酸二氫鉀O. 5 2. Og, 碳酸氫鈉O. 5 1. 5g,初始pH 5 8，蒸懼水1L。
全文摘要
本發(fā)明公開了戴氏綠僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株CGMCCNO.2880用于發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的用途，并公開了發(fā)酵和分離方法，不僅可以在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，也可很方便實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，絲狀真菌相比鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)首先絲狀真菌是一種食藥用菌，無致病性，不產(chǎn)溶血素，生物安全性高；其次絲狀真菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，生產(chǎn)成本低；第三，發(fā)酵液無需特殊處理，分離工藝簡單、方便，制備透明質(zhì)酸的費(fèi)用低，戴氏綠僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株的發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的含量可達(dá)90.0μg/mL。
文檔編號C12P19/04GK103014095SQ20111028057
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者肖建輝, 肖代敏, 劉洪美 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院